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1. Embriogénesis somática en arabidopsis thaliana Antonio Calibuig-Serna,Ricardo Mir* y José M.Segui-Simarro* Cárdenas, Tabasco a 08 de octubre de 2025 1

2. Arabidopsis thaliana La Arabidopsis thaliana es relativamente fácil y rápida de cultivar. R equiere un espacio mínimo y produce una gran cantidad de semillas. Aunque no tiene importancia agrícola en sí,  A. thaliana  pertenece a la familia Brassicaceae, que incluye especies de cultivos como la col, la coliflor,  las coles de Bruselas ,  el rábano y la col china. 2

3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION E studiar la inducción de la embriogénesis somática en Arabidopsism utilizando semillas como explantes. C aracterizar el proceso a nivel de microscopio óptico y electrónico de barrido y se estudio varios aspectos específicos como, la deposición de callosa y principalmente (Ca) durante las primeras etapas del proceso de inducción de la embriogénesis, mediante análisis confocal FRET. realizar un estudio farmacológico con sustancias químicas que alteran la homeostasis del calcio (CaCl2, inositol 1,4,5-trifosfato, ionóforo A23187, EGTA), la interacción ( clorpromazina, W-7) y la deposición de callosa (2-desoxi-D-glucosa ). . 3

4. EXPLANTE PARA EL ESTUDIO. En Arabidopsis thaliana , La embriogénesis somática puede inducirse in vitro a partir de protoplastos, explantes de raíces, brotes de punta apical y explantes de yemas florales, disparar explantes de ápice de plántulas jóvenes, o embriones en germinación a partir de semillas maduras. Sin embargo, el sistema de embriogénesis somática más conocido y estudiado en Arabidopsis utiliza embriones cigóticos inmaduros (IZE) 4

5. METODOLOGIA Inducción de embriogénesis somática 5 Microscopia óptico y electrónico de barrido Estudio farmacológico 1.Recoleccion de silicuas. 2.Esterilizacion 30 s (etanol -70%) y 20 min en hipoclorito de sodio-10%. 3.Enjuages (3 repeticiones con agua destilada). 4.Disecion de silicuas para la selección de semillas inmaduras (fueron observadas bajo un microscopio). 5.Se les retiro el endospermo. 6.Se transfirieron a medios de cultivo con medios de inducción. 7.Una vez obtenido el embrión se extirparon y se transfirieron a un medio de germinación. 1.Muestras de Arabidopsis cultivadas in vitro durante 3,5,7,14 días en medio solido E5. 2.Las muestras se fijaron con Karnovsky durante 5h a T ambiente con condiciones de vacío. 3.Se enjugaron c/u en tampón cacodilato 0,025 M luego se mantuvo a 4°C 4.Las muestras se deshidrataron en serie de etanol en agua de la siguiente manera: 30%(4h),50%(4h),70%(noche),90%(2h) y 100%(1h). 5.Se secaron en un secador de punto critico automatizado ,se recubrieron con platino durante 30s ,se montaron y observaron en el microscopio. 1. Se aplicaron diferentes concentraciones de cada compuesto a los cultivos in vitro . Ca+clorudo de calcio. Ca+Calcimicina (A23187). Ca+Acido trietilenglicol Aiamina (EGTA). Ca+Clorpromazina. Ca+Clohidrato (w-7). Ca Sustancia agregada concentraciones Ca Clorudo de Calcio 0mM,2mM,4mM Ca Calcimicina (A23187) 0µM,5µM,10µM,25µM,50µM Ca Acido Trietilenglicol Aiamina (EGTA) 0µM,1µM,10µM,100µM,1mM Ca Clorpromazina 0µM,1µM,10µM Ca Clohidrato 0µM,25µM,50µM

6. 6 CONCENTRACIONES DE MEDIO DE CULTIVO DE INDUCCIÓN Y GERMINACIÓN. Tabla 1 .Composición de los medios de cultivo in vitro utilizados para la inducción de la embriogénesis somática. GB5: medio basal de Gamborg + vitaminas B5 , MS : medio basal Murashige y Skoog + vitaminas MS .Para todos los casos, el pH se ajustó a 5.8 y los medios se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 121◦ C .

7. 7 RESULTADOS DE INDUCCIÓN DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA Figura 1 .Inducción de embriogénesis somática a partir de arabidopsis. (A) Embrión cotiledonario inmaduro recién aislado. ( B) IZE cultivado de cuatro días con cotiledones engrosados. ( C) Formación de protuberancias en el lado adaxial de los cotiledones. ( D) Formación de una protuberancia en el lado adaxial del izquierda cotiledón y la aparición temprana de un embrión somático del lado adaxial del bien cotiledón. (F) Embriones somáticos desarrollados a partir de una masa de callo después de 21 días de cultivo. ( h) Plántula germinada in vitro a partir de un embrión somático individualizado ( I ) Arabidopsis Planta transferida al suelo y aclimatada .

8. 8 ( A) Embrión cotiledonario inmaduro aislado después de tres días de cultivo . ( B) IZE cultivado de cinco días de edad con protuberancias embriogénicas en la región adaxial proximal de los cotiledones. ( C,D) Una masa de células en proliferación surgió de la protuberancia tras la explosión de la epidermis del cotiledón en el día 7 de cultivo. (F ) Crecimiento de las masas celulares de ambas protuberancias hasta formar una sola masa que recubre ambos cotiledones. ( h) Grupo de embriones somáticos extirpados del e xplante después de 14 días de cultivo. ( I) Detalle de dos embriones cotiledonario alargados y en forma de trompeta. Figura 2 .Inducción de embriogénesis somática a partir de arabidopsis.

9. 9 RESULTADOS DE MICROSCOPIA ÓPTICO Y ELECTRÓNICO DE BARRIDO. A) meristemo apical (m) y región proximal de los cotiledones (c), mostrando aumento de Ca2+niveles en la capa celular más externa del meristemo apical del brote y en la epidermis de la región del cotiledón proximal adaxial. B) Células de la región del mesófilo del cotiledón (c). C) Disparo del meristemo apical (m) y una protuberancia (p) en la región del cotiledón proximal adaxial que muestra un alto contenido de Ca.2+niveles. D) ( p) en la región adaxial proximal del cotiledón con un gradiente radial de Ca2+ niveles, siendo más altos en el centro de la protuberancia, donde se forman los embriones somáticos. (mi) Disparo del meristemo apical (m) y región proximal de los cotiledones (c) de un IZE cultivado en condiciones no embriogénicas. Figura 3 . A spectos específicos principalmente (Ca) durante las primeras etapas del proceso de inducción de la embriogénesis, mediante análisis confocal FRET. .

10. 10 RESULTADOS ESTUDIO FARMACOLÓGICO CON SUSTANCIAS QUÍMICAS QUE ALTERAN LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO . Grafica 1. Modulación del Ca intracelular con diferentes químicos: CaCl2(A), ionóforo A23187 (B), EGTA (C ), clorpromazina (D), y W-7 (mi). Se utilizaron productos químicos en diferentes concentraciones y para exposiciones continuas y de 7 días.

11. 11 Modulación del Ca intracelular con diferentes químicos: CaCl2(A), ionóforo A23187 (B), EGTA (C ), clorpromazina (D), y W-7 (mi). Se utilizaron productos químicos en diferentes concentraciones y para exposiciones continuas y de 7 días.

12. 12 Figura 3 . Embriones somáticos producidos en cultivos con diferentes químicos agregados, incluido CaCl2 (A–C), ionóforo A23187 (D–F), EGTA (GRAMO–I), clorpromazina (j–l), y W-7 (METRO–oh) en diferentes concentraciones y duraciones, como se describe en las imágenes.

13. 13 Figura 4. E mbriones con CaCl2 (A–C), Tienen un fenotipo característico con un retraso en la floración, mayor número de hojas juveniles, pérdida de la dominancia apical, raíces cortas y silicuas pequeñas (a) en cambio, la línea W-7 no mostró fenotipo (b). CaCl2 W-7

14. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA Allen, B. L., & Taatjes , D. J. (2015). The Mediator complex: a central integrator of transcription. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 16(3), 155–166. https:// doi.org/10.1038/nrm3951 Berleth , T., & Jürgens , G. (1993). The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryos. Development, 118(2), 575-587. https:// doi.org/10.1016/0168-9525(93)90246- Buendía-Monreal , M., & Gillmor, C. S. (2016). Mediator: A key regulator of plant development. Developmental Biology. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2016.06.009 Chen, X. (2005). microRNA biogenesis and function in plants. FEBS Letters, 579(26), 5923–5931. https:// doi.org/10.1016/j.febslet.2005.07.071 Chen, X. (2009). Small RNAs and their roles in plant development. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 25, 21–44. http://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.042308 . 14