Archaea - V4 (última).pptx

Microbiologia

1. -ARCHAEA- Disciplina: Microbiologia Ambiental Professora: Juliane A. G. Goulart Mestrandas: Daniele B. Gehrke, Fabiane Gartz e Natália Salamoni Universidade regional de blumenau - furb centro de ciências tecnológicas - cct PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA AMBIENTAL – ppgea

2. Foram detectados primeiramente em ambientes extremos, tais como em fontes hidrotermais. 2 Fonte: Educação Pública., 2021

3. Introdução O domínio Archaea é formado principalmente por organismos extremofílicos, isto é, microrganismos que não apenas toleram, mas crescem otimamente em ambientes normalmente considerados inóspitos para a vida, como fontes termais, águas extremamente salgadas, temperaturas baixas e condições extremas de pH. São Procariontes. Pode-se dizer que certas espécies de arqueas definem claramente os limites de tolerância biológica nos extremos físicos e químicos da vida. O estudo dos microrganismos provenientes desses ambientes extremos pode nos fornecer informações valiosas acerca da origem da vida na Terra, bem como das estratégias adaptativas aos ambientes onde esta prosperou (Woese, 1998). 3

4. A adaptação de organismos a esses ambientes obrigou-os a desenvolver componentes celulares e estratégias bioquímicas para sua sobrevivência. Por outro lado, devido às características “exóticas” que têm, e às suas propriedades únicas, esses microrganismos geram bioprodutos que podem ser empregados em condições drásticas, que frequentemente ocorrem em processos industriais. Os componentes moleculares, deles retirados, possuem muitas vezes propriedades que os tornam especialmente adequados para serem utilizados nesses processos. 4 Introdução

5. Nesse contexto, hoje é geralmente aceito que esses microrganismos constituem um precioso repositório de moléculas de interesse industrial e um excelente recurso para o desenvolvimento de novas aplicações biotecnológicas. Os benefícios científicos esperados de um conhecimento maior da biologia das arqueas incluem, entre outros, a compreensão das funções exercidas por esses organismos nos ambientes aquáticos e terrestres, bem como suas interações com outros componentes da biodiversidade. 5 Introdução

6. Os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos para obtenção de agentes terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, biorremediação e biolixiviação de poluentes e recuperação de minérios. Outros benefícios incluem a otimização da capacidade microbiana para processamento de alimentos, tratamento e/ou remediação de resíduos (esgoto doméstico e lixo). 6 Introdução

7. Características: Podem ser autótrofos ou heterótrofos, anaeróbios ou aeróbios; Apresentam forma esférica, de bastão, espiralada, achatada ou irregular; Podem se reproduzir de forma assexuada e sexuada; Vivem em ambientes extremos. 7 Archaea Fonte: life of point, 2021.

8. A evolução é um processo que envolve o surgimento de novas espécies de organismos; é um tema da área de estudo conhecida como filogenia. Uma importante ferramenta que é utilizada na determinação das relações evolutivas são os RNAs ribossomais ( RNAr ), justamente por comporem os ribossomos que estão presentes em todas as células (WOESE et al., 1990). 8 Filogenia Fonte: Educação Pública, 2021.

9. O pioneiro no uso do RNAr foi Carl Woese , um microbiologista norte-americano que revolucionou o entendimento da evolução celular. As sequências de alinhamentos base por base nitrogenada realizadas com o auxílio de um computador permitem distinguir, com base na variação da sequência do RNAr entre dois organismos, a sua divergência evolutiva. Com base nisso, é possível determinar também quais são os ancestrais comuns recentes de um grupo de indivíduos. 9 Filogenia Carl Woese (1928 – 2012) Fonte: News Medical, 2021.

10. Há cerca de vinte anos, Carl Woese e colaboradores sugeriram que os organismos vivos fossem classificados em três grupos principais: Archaea, Bacteria e Eukarya Esses grupos são chamados de domínios e acredita-se que surgiram através de vias evolutivas distintas a partir de um ancestral comum. A diversidade e a biologia das arqueas representam uma enorme contribuição à compreensão da Ecologia Microbiana (WOESE et al., 1990). 10 Filogenia e Fisiologia

11. 11 Fonte : Woese, Kandler , Wheelis , 1990.

12. O domínio Archaea consiste de três divisões: Crenarchaeota , que contém as arqueas hipertermofílicas redutoras de enxofre; Euryarchaeota , que compreende uma grande diversidade de organismos, incluídas as espécies metanogênicas, as halofílicas extremas e algumas espécies termoacidófilas; Korarchaeota , uma divisão descrita mais recentemente, que engloba organismos hipertermofílicos pouco conhecidos, identificados a partir de sequências do gene 16S do rRNA isolados de fontes termais terrestres, porém ainda não cultivados em laboratório. 12 Filogenia e Fisiologia

13. Após serem divididos os três grandes domínios a partir do sequenciamento do 16S rRNA, estudos subsequentes mostraram que cada domínio está associado a uma série de fenótipos. Alguns desses fenótipos são únicos de cada domínio, enquanto outros são compartilhados entre dois ou até entre todos os três domínios, como pode ser observado na Tabela 1. 13 Filogenia e Fisiologia Fonte: Educação Pública, 2021.

14. 14 Fonte: Revista Biotecnologia ciência e desenvolvimento, 2003.

15. São os únicos organismos descobertos até o presente momento que podem sobreviver a temperaturas acima de 95ºC, e o fenótipo hipertermofílico só é encontrado nesse domínio da vida. O metabolismo metanogênico: não se conhecem eubactérias nem eucariotos capazes de produzir metano como resíduo de seu metabolismo. O hábitat das arqueas halofílicas extremas é hipersalino e as espécies em cultivo laboratorial requerem uma quantidade significativa de cloreto de sódio (NaCl) para o crescimento, o que significa um ambiente com cerca de 10 vezes a salinidade encontrada na água do mar. 15 Características do Domínio Archaea

16. As metanogênicas são organismos obrigatoriamente anaeróbios e liberam gás metano (CH 4 ) como resíduo metabólico. São encontradas em ambientes com ausência de oxigênio e abundância de matéria orgânica, como pântanos, açudes, lagos, sedimentos marinhos e rúmen de bovinos. Elas retiram hidrogênio e gás carbônico desses ambientes e os utilizam em seu metabolismo. Vivem como simbiontes de uma grande variedade de protozoários também anaeróbicos, convertendo produtos finais de fermentação em gás metano. 16 Características do Domínio Archaea

17. São de grande importância ao ambiente em que vivem pela alta eficiência de sua enzima hidrogenase que, mantendo uma baixa pressão parcial de H 2 para que a metanogênese ocorra, permite que os demais organismos fermentadores façam reoxidação do NADH (Nicotinamida-Adenina-Dinucleotídio/Coenzima 1), o que corresponde a um maior rendimento de ATP(trifosfato de adenosina/nucleotídio) e um aumento da biomassa (BROCK et al., 1994). As arqueas termoacidófilas compõem um grupo heterogêneo, definido pela capacidade dos organismos de crescerem em altas temperaturas que vão de 55ºC a 85ºC, com pH que varia de 1,0 até 6,0. 17 Características do Domínio Archaea

18. Dentre as enzimas de arqueas de grande potencial para a aplicação biotecnológica, destacam-se as hipertermofílicas, psicrofílicas, alcalofílicas, halofílicas e barofílicas. Entre as enzimas de arqueas que têm recebido maior atenção, estão as termozimas, sendo que os principais processos de potencial utilização dessas enzimas são o beneficiamento do amido, a manufatura e o branqueamento da polpa para produção de papel e a bem estabelecida prática laboratorial da reação em cadeia da polimerase (PCR), entre outras (EICHLER, 2001). 18 Aplicações Biotecnológicas

19. Estudos que envolvem o domínio Archaea vêm confirmando as duas hipóteses iniciais de Woese e Fox (1977), isto é, que as arqueas exibem uma diversidade fenotípica no mínimo comparavél àquela apresentada pelo domínio Bacteria e que os organismos do domínio Archaea serão caracterizados por aspectos únicos em âmbito molecular. Outrossim, o fato de Archaea exibir um mosaico contendo características dos dois outros domínios continua a estimular discussões entre os evolucionistas (FORTERRE et al, 2002). 19 Considerações finais

20. Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e decisivas na manutenção de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos (KASHE; LOVLEY, 2003). É importante ressaltar que grande parte dos avanços da biotecnologia moderna e da agricultura é derivada das descobertas recentes nas áreas de genética, fisiologia e metabolismo de microrganismos. 20 Considerações finais

21. Estamos em plena era biotecnológica, quando os processos bioquímicos são cada vez mais utilizados para a produção de agentes terapêuticos, produtos químicos e biocatalisadores. O grande desafio será incorporar a informação decorrente do estudo desses organismos extremofílicos em novas tecnologias, utilizando o enorme potencial de suas enzimas e biomoléculas. 21 Considerações finais

22. 22 The more important role of archaea than bacteria in nitrification of wastewater treatment plants in cold season despite their numerical relationships Kai-Ling Pan, Jing-Feng Gao, Xiao-Yan Fan, Ding-Chang Li, Hui-Hui Dai Fonte: Pan et al., 2018 O papel mais importante das arquea do que bactérias no nitrificação de estações de tratamento de águas residuais na estação fria, apesar de suas relações numéricas

23. 23 Nitrificação INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO O processo de nitrificãção ocorre em duas etapas: Oxidação da amônia em nitrito pelas arqueas oxidantes de amônia ( AOA ) e bactérias oxidantes de amônia ( AOB ); Oxidação do nitrito em nitrato pelas bactérias oxidantes de nitrito ( NOB ). Ainda, as bactérias de oxidação completa de amônia ( comammox ) convertem diretamente a amônia em nitrato.

24. 24 Metodologia INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO qPCR em tempo real em 23 estações de tratamento de águas rediduais (ETARs); Incubação de DNA-SIP em 3 ETARs com diferentes relações numéricas de oxidantes de amônia: AOA<AOB – ETAR: W1.OD AOA = AOB – ETAR: W8.SBR AOA>AOB – ETAR: W23.OD Sequenciamento de alto rendimento e análise de rede.

25. 25 Coleta de amostra INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Lodo ativado retirado das 23 ETARs; Diferentes posições do tanque de aeração; Transporte para laboratório; Parte do material foi liofilizado e o restante armazenado em 4°C até análises posteriores. Fonte: Labconco , 2021. Liofilizador

26. 26 Incubação DNA-SIP INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO 3 ETARs com diferentes relações numéricas de oxidantes de amônia; Lodo ativado foi submetido a pré-incubação; No laboratório foram preservadas as condições in situ ; A incubação foi feita a fim de rotular os oxidantes de amônia ativos; Concentrações de amônio, nitrito e nitrato; Monitoramento a cada 30 minutos, até o amônio ser completamente degradado; Microssomos são colhidos e liofilizados.

27. 27 Extração de DNA INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: PR Labor, 2021. Kit Fast DNA SPIN for soil Fonte: GMI, 2021. Espectrofotômetro

28. 28 Centrifugação e fracionamento gradiente INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Beckman Coulter , 2021. Centrífuga isopícnica Fonte: Direct Industry , 2021. Refratômetro digital

29. 29 Ensaio qPCR INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Agilent , 2021. Termociclador Quantifica os oxidantes de amônio da amostra; Detecção da fluorescência emitida por uma molécula que aumenta à medida que a reação avança; Os genes alvo de cada um dos três oxidantes de amônia (AOA, AOB e comammox ) foram selecionados e utilizados nas reações.

30. 30 Sequenciamento de alto rendimento INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: QUIAGEN, 2021. Kit de extração de gel Fonte: Promega , 2021. Fluorímetro Fonte: Illumina , 2021. Sequenciador

31. 31 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Ensaio qPCR : quantificação dos oxidantes de amônia Arquea oxidante de amônia Bactéria oxidante de amônia Bactéria oxidante de amônia completa - comammox

32. 32 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Atividade de nitrificação de microssomos DNA-SIP

33. 33 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Quantificação de comunidades nitrificantes

34. 34 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Composição da comunidade de microrganismos nitrificantes ativos

35. 35 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Composição da comunidade de microrganismos nitrificantes ativos

36. 36 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Pan et al., 2018. Potenciais interações entre comunidades nitrificantes ativas

37. 37 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO A co-ocorrência de AOA, AOB e comammox foi confirmada em todas as ETARs na estação fria. O valor de pH foi relatado como o impulsionador mais importante da estrutura da comunidade AOA,; Ampla distribuição do comammox em ETARs na estação fria; Referente à incubação de DNA-SIP das três ETARs , o ensaio demonstrou que AOA foram os oxidantes de amônia ativos dominantes, mesmo com a taxa de crescimento de AOA sendo menor que AOB; A estação fria pode afetar as comunidades de AOA e AOB; A temperatura pode regular a atividade de nitrificação de AOA e AOB, mas não sua abundância. Conclusão

38. 38 Melhora na produção de metano a partir da vinhaça de cana-de-açúcar com torta de filtro em reatores UASB termofílicos , com predominância de  Methanothermobacter  e  Methanosarcina   archaea e bactérias Thermotogae .

39. 39 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Estudo: utilizar os domínios bactérias e archaea na produção de metano, a partir da vinhaça da cana-de-açúcar. Objetivo:   avaliar a conversão anaeróbia termofílica da vinhaça e a diversidade e quantidade de bactérias e  archaeas  em reatores de manta de lodo   anaeróbio ascendente (UASB), em dois estágios, com alto ROL para obter alta produção de metano.  R ealizada através da suplementação de alcalinidade e nutrientes através da torta de filtro e recirculação do efluente.

40. 40 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO P rodução de  bioetanol a partir da  cana-de-açucar  no Brasil (2015): → 30,2 bilhões de litros, ou 30,6% da produção mundial ( Seyboth et al., 2016  , UNICA, 2016 ) ; 1L bioetanol de cana-de-açúcar destilado →gera 10–14L de  vinhaça ( Ortegón et al., 2016 ); Vinhaça da cana-de-açucar → é o resíduo pastoso e malcheiroso que resta após a destilação fracionada do caldo de cana-de-açúcar fermentado, para a obtenção do bioetanol (Marques, 2013); A lto teor de matéria orgânica alto potencial energético

41. 41 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Matéria orgânica (Vinhaça) Bactérias Archaeas Fermentação (anaeróbia) Biogás Metano Dióxido de carbono Fonte: Moraes et al., 2014.

42. 42 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Reatores UASB alimentados pela vinhaça da cana-de-açúcar (afluente) proveniente da destilação do etanol hidratado, coletado mensalmente de coluna de destilação; Torta de filtro (subproduto do processamento da cana-de-açúcar) coletado mensalmente. Ambos coletados em Usina em Ribeirão Preto(SP); Lodo do inóculo ( microorganismos em concentração adequada) de reator termofílico UASB de tratamento da vinhaça de cana-de-açúcar (Usina São Martinho) localizada na cidade de Pradopólis , estado de São Paulo; Archaeas e Bactérias

43. 43 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Reatores UASB em série (R1 e R2), com volumes de 12,1L (R1) e 5,6L (R2), em uma câmara climática com tanques de armazenamento para afluente e efluente, bomba de diafragma e gasômetros de fibra de vidro; Reatores de tubos de PVC, separando as fases em forma de Y, em ângulo de 45°; As temperaturas dos reatores afluente e UASB foram mantidas na faixa termofílica (54-56° C) com sistema de aquecimento e controle de temperatura (equipado com termopar) instalado em câmara climática;

44. 44 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO E stimulação da atividade dos consórcios (bactérias e archaeas ) Suplementação da vinhaça com torta de filtro. Aumentou as concentrações de macro e micronutrientes, principalmente N, P, Fe e Zn.

45. 45 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Representação esquemática Fonte: Barros et al., 2017.

46. 46 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Coleta das amostras: TESTES         FREQUÊNCIA MÉTODO       REFERÊNCIAS Nitrogênio Kjeldhal (NK) e amoniacal ( N-am ) semanalmente destilação a vapor     APHA (2005) Fósforo total (P total ), K, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn e Zn  semanalmente espectofotômentro de absorção atômica APHA (2005) Sólidos totais (ST) e voláteis (VS)   mensalmente Ignição a 550˚C     APHA (2005) Produção de biogás       diariamente gasômetros     Método 2540E Composição do biogás     quinzenalmente cromatógrafo de gás   APHA (2005) Fonte: Barros et al., 2017.

47. 47 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO PCR quantitativa ( qPCR ) em 340 dias →com amostras de DNA isoladas do lodo coletado de cada reator: → 3 amostras de R1 Pontos de coleta (P1, P2, P3 e P4) → 3 amostras de R2 Extrações de DNA genômico - 0,37 mg de lodo - armazenado a −20 ° C Qualidade do DNA genômico Espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 PowerSoil ® DNA Isolation Kit Fonte: Mobio Laboratories , 2021. Quantidade do DNA genômico kit Qubit ® dsDNA HS Assay Fonte:Thermo Fisher Scientific Inc., 2021.

48. 48 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Principais microrganismos identificados (Método Ion Torrent ) no Lodo Gerado: 9 filos bacterianos → os mais abundantes foram Thermotogae ,  Firmicutes e Bacteroidetes . Fonte: Barros et al., 2017.

49. 49 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Principais microrganismos identificados (Método Ion Torrent ) no Lodo Gerado: 2 filos archeas → Euryarchaeota (dominante em ambos os reatores) e  Crenarchaeota .  Classe dominante → Methanobacteria → Methanothermobacter Fonte: Barros et al., 2017.

50. 50 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO A rquitetura genômica e potencial de codificação responsável pela redução do CO 2  à metano ( metanogênese a partir de H 2  e CO 2  ). Methanothermobacter

51. 51 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO   R azões propionato / acetato foram baixas (0,28 - R1 e 0,25 - R2 ). O peração estável; ↑ eficiência na digestão anaeróbia; Aceleração da degradação do acetato e propionato para a produção do metano. N utrientes adicionados aumentaram a atividade microbiana específica das archaeas metanogênicas envolvidas na degradação do propionato.

52. 52 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO Fonte: Barros et al., 2017. Quantificação dos domínios: Quantificação do domínio Archaea : PCR quantitativa ( qPCR ):

53. 53 INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS CONCLUSÃO A quantificação dos microrganismos indicou um equilíbrio entre os domínios Archaea e Bactéria, favorecendo a funcionalidade dos reatores. O desequilíbrio na proporção de bactérias para archaeas poderia afetar todo o sistema levando a uma redução na quantidade de metano produzida ( Akuzawa et al., 2011); A presença das bacterias Thermotogae , Firmicutes e Bacteroidetes (principais responsáveis ​​pela degradação de compostos orgânicos complexos), contribuíram para o consórcio entre bactéria e archaea promovendo a estabilidade do sistema com alta produção de metano; As maiores concentrações de metano no biogás foram de 73% em R1 e 83% em R2 e, consideradas satisfatórias.

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57. 57 OBRIGADA PELA ATENÇÃO!