Aula 2 - Utilização de Anticorpos como Biofármacos

Aula sobre utilização de Anticorpos monoclonais como Biofátmacos utilizados no tratamento de câncer e doenças autoimunes

1. Biotecnologia de Fármacos Anticorpos como Biofármacos

2. Estrutura do Anticorpo Anticorpos naturais ou imunoglobulinas, desempenham papéis ativos no sistema imunológico, reconhecendo e defendendo contra patógenos.

3. Estrutura básica de um Anticorpo Cada anticorpo é composta por duas cadeias polipeptídicas pesadas (H) idênticas e duas cadeias polipeptídicas leves (L) idênticas. Estas cadeias são mantidas juntas por pontes dissulfeto intercadeia . Cada cadeia pesada e leve é ​​constituída por regiões dobradas, denominados domínios. As cadeias leves (L) contem uma região variável (VL)e uma região constante (CL). As cadeias pesadas conter uma região variável (VH) e três ou quatro regiões constantes (C H1 - C H4) dependendo do isotipo do anticorpo

4. Regiões Variáveis e Hipervariáveis A sequência de aminoácidos nesta área ( ) é variável entre os anticorpos a partir de diferentes linhagens de células B, quando comparado com a maior parte do resto da estrutura do anticorpo. Nas extremidades das regiões variáveis ​​são as regiões hipervariáveis ( ). É nas regiões hipervariáveis ​​que a maior variabilidade entre anticorpos a partir de diferentes linhagens ocorre. É esta alta variabilidade que permite permutações de conformação muito divergentes para a ligação Ag-Ac . A estrutura de base de um anticorpo contém duplicata das cadeias Variáveis H e L (VH) e (VL) que formam o local de ligação ao Ag . )

5. Ligação ao Antígeno Cada anticorpo tem dois locais de ligação ao Ag idênticos ( ab ). Todos os isotipos de anticorpos, exceto para a IgE, são articulados entre o C H1 e C H2 regiões para conferir flexibilidade à estrutura de anticorpo principal. As regiões variáveis ​​e constantes acima da região de dobradiça são referidos como o seu fragmento de ligação ao antigénio ( Fab ) do anticorpo. As regiões constantes emparelhados abaixo da dobradiça criam o fragmento constante ( Fc ) do anticorpo

6. Glicosilação de Anticorpos Os anticorpos são naturalmente glicosilados - hidratos de carbono ligados ao longo das cadeias pesadas. O conteúdo de hidratos de carbono, especialmente ao longo da poro Fc de um anticorpo, afeta profundamente muitas das ações do anticorpo. Isto inclui a secreção correta do anticorpo a partir do plasmócito, a sua cinética na circulação, as ações de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e complemento, e a química relacionada com radiomarcador adequado ou anexo ligante.

7. Classes das Imunoglobulinas

8. Interação Ag-Ac A parte do anticorpo responsável pela ligação ao Ag é a - Região Determinante Complementaridade – CDR - localizado na extremidade das regiões variáveis. As CDR em VH e VL eu formam um “bolso” de ligação ao antigénio que contata os epítopos ( antigénios ) diretamente. A conformação deste bolso determina A discriminação extremamente fina para Ag próprios (especificidade) A extrema força com que estes Ag estão vinculados (afinidade)

9. Afinidade dos Anticorpos Representação numérica da força de interação de um sítio de ligação ao seu ligando. Valores de Ka que representam baixa afinidade: geralmente entre 10 4 - 10 5 mol/L e melhora através do processo de maturação de afinidade. Valores de Ka que representam alta afinidade: 10 11 mol/L Isto é extremamente alta e explica por que os anticorpos se ligam highaffinity antigénio muito firmemente e permanecem ligados para relativamente longos tempos.

10. Afinidade de Anticorpos Dependendo do isotipo de anticorpo, há entre 2 e 10 Ag ligados Estas afinidades são aditivas e esta força de múltiplas interações é a avidez do anticorpo. Os anticorpos normalmente têm ambos uma elevada afinidade e avidez-um mínimo de 2 locais de ligação ao Ag estão disponíveis para um anticorpo de IgG normais. Se a afinidade de local de ligação ao indivíduo é relativamente baixa, a avidez podem compensar e proporcionar uma excelente força de ligação. É esta característica de elevada afinidade, acoplados com tipicamente avidez elevada que permite que os anticorpos monoclonais a ser candidatos atrativos para a marcação radioativa. Os anticorpos monoclonais são extremamente desejáveis ​​para localizar um epitopo que é muito original ou exclusivo em um tecido alvo desejado.

11. Afinidade de Anticorpos

12. Especificidade dos Anticorpos Pela sua própria natureza, anticorpos - especialmente os produzidos após múltiplas exposições antígeno - são extremamente exigentes no que diz respeito ao tecido-alvo onde se ligam.

13. Anticorpos Policlonais Uma única célula de plasma é capaz de segregar over10 8 anticorpos por dia. Quando um plasmócito segrega anticorpos, cada um é exatamente o mesmo em todos os aspectos. Seus isotipos , componentes Fc , Fab e são idênticos. No entanto, uma resposta imune humoral normal, produz muitas plasmáticas a partir da seleção de diversas linhagens de células B e compatíveis úteis que produzem uma resposta policlonal reunidas. Esta resposta policlonal assegura sobreposição completa na ligação do anticorpo e fornece uma resposta de anticorpos mais eficazes para o antigénio . Isto é ideal para a erradicação da doença..

14. Anticorpos Policlonais X Monoclonais Para a ciência e medicina, isso cria inexatidão e imprecisão. Para fornecer precisão e reprodutibilidade, produtos de clones individuais - anticorpos monoclonais - são necessários. Até 1975, a incapacidade para criar de forma fiável anticorpos monoclonais era um dos principais obstáculos para a aplicação e uso de anticorpos. Necessidade de combinar os atributos de uma linhagem de mieloma (propagação perpétua) com os de uma célula secretoras de anticorpos (com vida limitada)

15. Questões a Considerar para obete Ac Monoclonais Em primeiro lugar,o problema do tempo de vida limitado de células do plasma, o que limita o fornecimento de quaisquer anticorpos monoclonais de interesse. Segundo, apenas os anticorpos policlonais podem ser obtidos a partir de uma cultura de Ag estimulado células-B. Os anticorpos monoclonais podem ser meticulosamente obtidos através do isolamento de uma única célula de plasma, mas que era simplesmente um resultado de ambos sorte e trabalho árduo.

16. Anticorpos Monoclonais à Vista Kohler e Milstein desenvolveram, em 1975, um método de produção de anticorpos a partir da fusão de duas células (um linfócito obtido a partir de clone de linfócitos de rato imunizado) com uma célula tumoral imortalizada, levando pela primeira vez a produção de anticorpos monoclonais Experiências de Kohler e Milstein.

17. Anticorpos Monoclonais Atualmente, é possível produzir anticorpos monoclonais, derivados de um único clone de linfócitos, e podem ser dirigidos a qualquer alvo molecular, como marcadores de células tumorais, substâncias endógenas, enzimas e receptores. Os anticorpos monoclonais têm grande aplicação na oncologia, no tratamento de doenças auto-imunes , na prevenção da rejeição de transplantes, como marcadores para testes diagnósticos ect . Estes são uma classe de fármacos que tem em comum a terminação – MAB (do inglês Monoclonal antibody )

18. Anticorpos Monoclonais O corpo humano segrega anticorpos em resposta a Ag estranhos. Este fenômeno é manifestado através da linhagem de células B com a ajuda de células T e outros componentes do sistema imune. Esta resposta de anticorpos pode-se dizer que se originam em células plasmáticas, ainda que a origem da resposta humoral seja muito mais complexa antes do amadurecimento dos plasmócitos. A resultados humorais normais resposta imune em múltiplas linhagens clonais de células-B que se diferenciam terminalmente em células plasmáticas secretoras de anticorpos, resultando numa resposta de anticorpos policlonais . Para estudo científico e uso médico e é desejado apenas um anticorpo (e assim um clone de células de plasma).

19. Anticorpo Murino Os ratos e os seres humanos são muitas vezes diferentes na glicosilação de anticorpos, uma preocupação para aplicações in vivo com anticorpos monoclonais de murino . O papel desempenhado por glicosilação de anticorpos não foi completamente explicado. No entanto, a ausência ou colocação incorreta de hidratos de carbono sobre fração pesada ( Fc ) altera a solubilidade, a velocidade de depuração do soro, e a boa interação entre anticorpos e receptores Fc . A glicosilação correta do anticorpo é muito importante se a ação do anticorpo depende da ativação do complemento ou a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Mesmo se as funções Fc de um produto anticorpo monoclonal murino não são o foco principal de sua função, as outras questões - de solubilidade, depuração sérica, e farmacocinética gerais - pode ser desconcertantes problemas a serem superados.

20. Desvantagens do Anticorpo Murino (1) o reduzido tempo de meia vida de Ac murino contra IgG humana, e (2)A resposta do corpo humano contra o anticorpo murino (HAMA) que reduz ainda mais a sua meia-vida. A IgG humano normalmente tem uma meia-vida de cerca de três semanas. IgG murino tem uma meia-vida de apenas algumas horas. IgG murino tende a invocar uma resposta HAMA, que não só provoca uma remoção mais rápida do IgG de rato, mas também pode provocar uma resposta de hipersensibilidade anafiláctica , devido à sua natureza externa. As diminuições na semi-vida circulante exigem o aumento das doses administradas (que pode então levar a crescente HAMA,) ou aceitar uma redução da eficácia do produto.

21. Redução de Epítopos Portanto, um objetivo de alta prioridade tem sido a de reduzir o teor de epítopos de murino em anticorpos monoclonais, mantendo a eficácia. Mesmo assim, diversos anticorpos monoclonais de murino foram completamente, e são ainda, utilizado para a imagiologia e aplicações terapêuticas: MuromonabCD3 ( Orthoclone OKT3® a imunossupressor utilizado no transplante de órgãos) e Y-90 ibritumomab tiuxetan ( Zevalin um agente radioimunoterapeutico utilizado como um agente antineoplásico no linfoma de não-Hodgkin).

22. Anticorpos Monoclonais Quiméricos Com o surgimento da tecnologia do DNA recombinante, os anticorpos monoclonais com maiores quantidades de sequências humanas estão sendo desenvolvidos e utilizados. Os anticorpos quiméricos são compostas por sequências de proteínas a partir de duas origens: murino e humano. Enquanto os anticorpos murinos são 100% de proteína de murino , anticorpos quiméricos são tipicamente apenas cerca de 33% de proteínas de murino (Figura 8) com a proteína humana restante. Aa região variável com a especificidade antigénica permanece murino . As regiões constantes que ditam o isotipo de anticorpo são substituídas com proteínas humanas.

23. Anticorpos Monoclonais Quiméricos Os anticorpos quiméricos são feitos por fusão de genes da região variável murina , com os genes das regiões constantes humanas. Um método de DNA recombinante através dos quais isto pode ser conseguido é através do isolamento dos genes da região variável de um hibridoma murino que segregam um anticorpo que se liga ao alvo desejado, em seguida, amplificar estes genes usando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Este produto inicial é uma cópia de DNA ( ADNc ) da região variável de murino (V- cDNA ) o V- DNAc pode então ser ligado num plasmídeo.

24. Anticorpos Monoclonais Quiméricos Numa sequência paralelo, o DNAc para as regiões constantes da cadeia pesada humana também é amplificado e ligado num plasmídeo separado para produzir DNAc cópia da cadeia pesada (HC- cDNA ). Neste ponto, o V e HC- ADNc - cDNA pode ser apresentado em conjunto numa célula hospedeira comum utilizando co-transfecção . Este método elaborado fornece a proteína de fusão desejada, o anticorpo quimérico intacto. Uma vez que as bactérias não glicosilam correctamente proteínas humanas, os anticorpos não são normalmente segregada a partir das bactérias. Em vez disso, o anticorpo quimérico é normalmente expressa em corpos de inclusão nas células de bactérias e devem ser extraído e purificado.

25. Anticorpos Monoclonais Quiméricos Mesmo com esta modificação bem sucedida e elegante para o anticorpo monoclonal de murino original, ainda pode haver uma resposta imunitária humana para as sequências de peptidios murinos na estrutura do anticorpo quimérico. O avanço a partir de anticorpos monoclonais de murino para anticorpos monoclonais quiméricos foi uma melhoria importante na tecnologia de anticorpos. Os anticorpos monoclonais quiméricos ratinho-humano útil estão resumidos na Tabela 3.

26. Anticorpos Monoclonais Quiméricos

27. Anticorpos Monoclonais Humanizados Os anticorpos monoclonais humanizados, tipicamente retem apenas as regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDR), de um anticorpo de murino , enquanto o resto do anticorpo é humano. Assim, os anticorpos humanizados contêm tipicamente apenas 5% a 10% de composição de murina .

28. Anticorpos Monoclonais Humanizados Os anticorpos monoclonais humanizados são tipicamente sintetizados por enxerto de CDR de murino para um anticorpo humano. Utilizando tecnologia de ADN recombinante, a cadeia leve de imunoglobulina humana e os genes de cadeia pesada podem ser amplificado por reação em cadeia da polimerase. A biblioteca de cDNA humano linfóide resultante pode ser utilizado como um molde para a síntese in vitro do anticorpo inteiro, exceto para as CDR. RDCs de murino foram clonadas e cultivadas em paralelo. Os respectivos genes podem, em seguida, ser unido no vetor de DNA e incorporado em bactérias de crescimento.

29. Anticorpos Monoclonais Humanizados Para agilizar o processo, muitas vezes, vetores tanto de ADNc humano - e de ADNc de murino - podem ser incorporados na mesma célula bacteriana (de co-transfecção ) e um anticorpo monoclonal humanizado intacto pode ser produzido. Tal como acontece com os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados deve ser extraído a partir de culturas bacterianas e purificada.

30. Anticorpos Monoclonais Humanizados Um problema encontrado algumas vezes com ambos os anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, é a retenção da região de combinação de integridade conformacional. Um resíduo de aminoácido único (não relacionados com a ligação ao Ag) em Fc ou região variável na zona C-terminal faz com que a CDR altere sua estrutura tridimensional e pode alterar drasticamente a afinidade de ligação do anticorpo e avidez de Fab diminuindo a eficiência de ligação do anticorpo quimérico ou humanizado. Pequenas alterações no cDNA necessárias para restaurar ou melhorar a ligação do anticorpo de epítopo murino . Os anticorpos podem também conduzir a glicosilação inadequada ou inexistente. A glicosilação de Fc é importante na solubilidade, de depuração do soro, e farmacocinética gerais de anticorpos.