Aula - MÉTODO ANÁLISE FLUORIMETRIA.pptx

A fluorimetria é uma técnica analítica que mede a fluorescência de uma substância para sua análise qualitativa e quantitativa. O processo envolve a absorção de energia radiante por uma substância e sua posterior emissão de luz visível, um fenômeno chamado fluorescência. A intensidade da luz emitida é diretamente proporcional à concentração da substância. Esta técnica é aplicada em diversas áreas, como a triagem neonatal (Teste do Pezinho) e o monitoramento de doenças, como o diabetes, através de testes como o de hemoglobina glicada (HbA1c).

1. São Bernardo - MA 2018.1 METODOS ESPECTROSCÓPICOS FLUORIMETRIA Prof. Drª . Maria Garreto 1

2. 2 Fluorometria (espectroscopia de fluorescência) é um tipo de espectroscopia eletromagnética a qual analisa a fluorescência de uma amostra. Envolve o resultado da absorção de energia radiante e emissão de parte desta energia na forma de luz de baixa energia, mas não necessariamente luz visível. A emissão de luz se dá pela excitação de elétrons nas moléculas de certos compostos, normalmente usando luz ultravioleta. Métodos espectroscópicos

3. 3 É um método de análise usado na determinação quantitativa ou qualitativa de substâncias que são capazes de emitir fluorescência . FLUORIMETRIA Princípio da Fluorimetria Luminescencia : Moléculas que são levadas ao estado excitado não podem nele permanecer e devem necessariamente retornar ao estado fundamental, perdendo o excedente de energia . Colisão com outras espécies Relaxamento vibracional Emissão de um fótom

4. 4 Princípio da Fluorimetria Fotoluminescência: quando fótons são absorvidos por moléculas promovendo-as a um estado excitado. Ao retornar ao estado fundamental, as moléculas emitem radiação. Fluorescência Fosforecência

5. 5 Fluorescência : emissão de um fóton por uma espécie que atingiu o estado excitado por meio de absorção de radiação eletromagnética, ou seja, absorção de um fóton.   Fosforescência: excitação provocada por radiação eletromagnética, porém a emissão de radiação continua após a excitação haver cessado.   A maior diferença entre fluorescência e fosforescência é o tempo entre a absorção da energia e a emissão do fóton, sendo que quando o intervalo de tempo é curto, o processo chamado fluorescência e quando o tempo é longo, o processo chama-se fosforescência.

6. Fluorescência e Fosforescência Exemplos: –material fluorescente à base de fósforo, - material f Fosforescente * tomadas elétricas e interruptores ; * Ponteiros do relógio de pulso;

7. 7 Fluorescência e Fosforescência Bioluminescência

8. 8

9. 9 Duplas conjugadas Rigidez Pares de elétrons em heteroátomos - conjugação Composto orgânico fluorescência ? Fluorescência em compostos orgânicos ? Presença de conjugação: reduz a diferença de energia entre o estado fundamental e o primeiro estado excitado e confere maior estabilidade ao estado excitado Rigidez molecular: reduz a interação da molécula com o meio em que se encontra e a probabilidade de desativação por processo não emissivos. Substituintes que doam elétrons aumentam a fuorescência ; Grupos que retiram elétrons diminuem ou eliminam a fluorescência;

10. 10 Rigidez é, às vezes, conseguida por meio de complexação com um metal de transição.   A fluorescência pode ser obtida por meio da formação de quelatos com metais (Mg, Zn) Compostos não-fluorescentes podem, muitas vezes, ser derivados quimicamente e tornados fluorescentes com um reagente fluorogênico . Fluorescência em compostos orgânicos

11. 11 EXISTÊNCIA / INTENSIDADE DA FLUORESCÊNCIA Estrutura da molécula Duplas conjugadas Rigidez Pares de eletrons n em heteroátomos (conjugação) Ambiente Temperatura Solvente pH do meio Presença de impurezas Concentração da espécie fluorescente

12. 12 Instrumento FLUORÍMETRO ou FLUORRÔMETRO: mede a fluorescência • Fonte (lâmpada de xenônio, hidrogênio, deutério) •Monocromador (filtros, primas ou redes) • Cubeta (quartzo ou silica fundida) •Detector (faixa visível –tubo fotomultiplicador)

13. 13 ESPECTROFLUORÍMETROS

14. 14 Espectro

15. 15 A luz emitida ou intensidade da fluorescência é proporcional à concentração da espécie fluorescente.      Determinação da concentração Quantificação de compostos por fluorescência Medições relativas ao padrão com fluorescência mais intensa.   Em soluções diluídas: F = k.b.c   k = constante de proporcionalidade   b = espessura da cubeta   c = concentração da espécie fluorescente   A curva padrão é uma reta em concentrações baixas

16. 16 Quantificação de compostos por fluorescência

17. 17 Pre-requisitos para análise: Presença de apenas uma espécie fluorescente (padrões e amostras). Na escolha do comprimento de onda de excitação e emissão considerar o solvente. Melhores limites de detecção (máximo )   Condições experimentais Quantificação de compostos por fluorescência Fontes de erro na análise: O analito pode sofrer decomposição pela radiação da fonte . Tempo de exposição Fluorescência das cubetas

18. 18 Determinação de constituintes de alimentos (traços) Vitaminas Fármacos Contaminantes doseamento de fármacos em formulações farmacêuticas, Identificação de impurezas, estudos de interações ligante-receptor , Análise de alguns metais que podem ser transformados em complexos orgânicos associados com íons ou quelatos fluorescentes. Exemplos: os corantes fluoresceína e rodamina , e seus derivados. Utilizado em análises de amostras de alimentos e biológicas na determinação de elementos traço que sejam mais difíceis de analisar por outras técnicas. Exemplo : mineral selênio, etc. Aplicações

19. 19 Desvantagens : É relativamente caro e difícil de manter Vantagens : - Alta sensibilidade (partes por trilhão) – (cerca de 100 vezes maior do que a da espectroscopia UV- visivel ), - maior seletividade/especificidade (apenas substâncias que absorvem radiação eletromagnética são capazes de emitir fluorescência). Vantagens e desvantagens

20. 20 Até a próxima aula!