clase 7 Cinetica enzimatica .pdf

tecnicas actividad enzimatica

1. REGULACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Una molécula de enzima no tiene
por qué actuar siempre a la
misma velocidad.

2. La actividad enzimática puede
estar modulada por:
•cambios en el pH y/o temperatura
•presencia de cofactoresy/o inhibidores
•modulación alostérica
•activación por proteolisis
•modificación covalente
•las concentraciones de sustratos y/o productos

3. Cinética de la reacción:
La velocidad de aparición del producto
(o desaparición del sustrato)
en función del tiempo

4. Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado
estacionario:la concentración del complejo enzima-
sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción.
Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-
sustrato es igual a la de su disociación:
Modelo teórico

5. SATURACION: A medida que la reacción transcurre, la
velocidad de acumulación del producto va disminuyendo
porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para
evitar esta complicación se procede a medir la velocidad
inicial de la reacción(v
0).
Modelo empírico

6. Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo,
hecho que puede deberse a las siguientes causas:
•Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima
•El curso de la reacción produce una disminución
significativa de la [S]
•La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse
relativamente importante al aumentar la [P]
E + S [ES] E + P

7. La medida de velocidad inicial (v
0) se realiza antes de que
se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que
pueda considerarse la [S
0] como esencialmente
constantea lo largo del experimento.
En estas condiciones no es
necesario considerar la
reacción inversa, ya que la
cantidad de producto formada
es tan pequeña que la reacción
inversa apenas ocurre.

8. Para explicar la relación entre la velocidad inicial (v
0) y la
concentración inicial de sustrato [S]
0 Michaelisy Menten
propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente
ocurren en dos etapas:
En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato
y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la
formación del producto, liberando el enzima libre

9. La cinética enzimática mide el efecto de la concentración
inicial de sustrato [S
0] sobre la velocidad inicial de la
reacción (v
0), cuando se mantiene la cantidad de enzima
constante
Ecuación de Michaelis-Menten
La V
maxcorresponde al valor
máximo al que tiende la curva
experimental.
La K
Mcorresponde a la
concentración de sustrato en la que
la velocidad de reacción es la mitad
de la V
max.

10. Para determinar gráficamente los valores de K
My V
maxes más sencillo
utilizar la representación doble recíproca(1/v
0frente a 1/[S]
0), ya que
es una línea recta.
Esta representación doble recíproca recibe el nombre de
representación de Lineweaver-Burk.
Es una recta en la cual:
La pendiente es K
M/V
max
La abscisa en el origen (1/v
0= 0) es -1/K
M
La ordenada en el origen (1/[S]
0 = 0) es 1/V
max
De esta forma, a partir de los datos
experimentales se puede calcular
gráficamente, los valores de K
My V
max
de un enzima para diversos sustratos.

11. Actividad específica es el número de unidades de enzima
por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de
disolución (U/ml).
Unidad de actividad enzimática(U): es la cantidad de
enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en
un minuto.

12. t
1
Muestra
o
sustrato
ENZIMA
Término
de la reacción
(cambio t,
adición reactivo)
Detección
Inicio de
Incubación
(preincubación)
t
2
t
3
o
o
o
o
o
o
Tiempo
Abs
Abs
Gráfico de Datos
22 22
17450
25200
255004
5
Base Experimental del Ensayo Enzimático
+

13. •Ensayos rápidos y con mínima manipulación
•Amplia diversidad de elementos a determinar:
cromógenos
sustratos naturales
cofactoresde la reacción
sustratos sintéticos
•Posibilidad de acoplar diferentes ensayos
Ensayos Enzimáticos

14. TIPOS DE
ENSAYO
DISCONTINUOS
( MUESTREO)
CONTINUOS
DIRECTOS
INDIRECTOS
(ACOPLADOS)
Clasificación de Ensayos Enzimáticos

15. S P
Enzima
[S]
o
[P]
Complejo de Color
Incubar y detener a
diferentes tiempos
Desarrollar el complejo
de color y cuantificar
Curso temporal de reacción
[S o P]
Tiempo
Producto
formado
Sustrato
remanente
Intensidad del
color
[S o P]
Curva de calibración del S o P
o
o
o
o
o
Ensayos Enzimáticos con determinación
Espectrofotométrica Métodos Colorimétricos
Enzima

16. Ensayos Enzimáticos con determinación
Espectrofotométrica UV o Vis
Desaparición de Sustrato
Fumarato
(Absorbe a
300 nm)+
H OHC
COO
COO
2
CH
2
H O
CH
HC
COO
COO
Fumarasa
Malato
Curso temporal de la reacción
de la fumarasa
Abs
(
300
nm
)
Tiempo

17. Aparición/Desaparición de Cofactores
Absorbe a
340 nmCH
COO
COHH
3 3
C
COO
CH
O+ +NAD NADH + H
Lactato
Deshidrogenasa
(LDH)
Lactato Piruvato
Absorbancia
nm
250 300 350 400
Oxidado
Reducido
Espectros de absorción del NAD
Ensayos Enzimáticos con determinación
Espectrofotométrica UV o Vis
Abs
340
nm
Tiempo
Cursos temporales de
reacción de LDH
NADH
NAD
+

18. Aparición/Desaparición Sustratos sintéticosOH
2
O N
2
O N OPO
2
3
3
4PO
2
H O
Fosfatasa
alcalina
p –nitrofenil-fosfato
p –nitrofenol
(Absorbe a 410 nm)
Abs
(
410
nm
)
Tiempo
Curso temporal de reacción
de la fosfatasa
Ensayos Enzimáticos con determinación
Espectrofotométrica UV o Vis

19. Ensayos acoplados
Curso temporal de
reacción de TGO
Aspartato
a-ceto-glutaratato
Glutamato
Oxaloacetato
Malato
TGO
MDH
Reacción de Interés Reacción Indicadora
HC
3
HN
CH
2
CH
2
COO
COO
COO
COO
3
HNCH
CH
2
CH
2
C
COO
COO
O
O
COO
COO
CH
2
CH
2
C
++
H
COO
COO
C
CH
2
OH
NADNADH+H
Ensayos Enzimáticos con determinación
Espectrofotométrica UV o Vis
Abs
(340
nm
)
Tiempo