CONCEPTOS BASICOS DE BACTERIOLOGÍA.pdf

Descripción sobre bacterias

1. Conceptosbásicosen
BacteriologíaClínica
PROF. MARIBEL FIGUEROA PENA
COLEGIO DE TECNÓLOGOS MEDICOS DE PUERTO RICO

2. Al completer estaconferencia, el
TecnólogoMédicoserácapazde:
1. Mencionaralgunosfundamentosde toma, preservación,
almacenamientoy transportede muestras.
2. Identificarmuestrasinadecuadaspara procesar.
3. Enumerarcaracterísticasmacroscópicasenuna muestra.
4. Resumircuales el propósitodel análisismicroscópicode una
muestray comose realizael mismo.
5. Mencionarlosprincipalesmediosde cultivoy sus características.
6. Enumerardistintosprocedimientospara la identificación
bacteriana.
7. Reconocerprincipiosbásicosde sensitividada antibióticos.

3. Introducción
La Microbiologíaes la cienciaque estudiadiferentesmicroorganismosa
saber: parásitos, virus, hongosy bacterias.
El estudiode las bacteriasque afectanal humanoy le producen
condicionesclinicas–BacteriologíaClínicao Médica.
Bacteriascrecenmajor a una temperaturaentre 35-37ºC, pH +-7.
Algunasrequierenareas del cuerpocon muchahumedad, otrasse
establecenenareas bien secas.

4. Introducción
Estosy otrosfactoresson responsablesdel establecimientode la
Microbiota corporal = Ecosistemacorporal

5. Microbiota
Estaesespecialmente
abundanteennuestro
intestinogruesodonde
millonesde estos
habitantesse
encargande
protegernoscontra
bacteriaspatógenas.

6. Microbiota
Microbiota nosayudaa realizarfunciones
importantespara nuestravida, tales como:
degradaralimentos
sintetizarvitaminas
mantenerla pielsaludable
estimularel sistemainmunológico
La mayoríade nuestramicrobiota reside enel intestine.
Colectivamentetieneun peso de aproximadamente4.4lb.

7. Requerimientosambientales
Psychrophiles –crecimientoóptimoentre 10°C y 20°C
Thermophiles –crecimientoóptimoentre 50°Cy 60°C
Mesophiles–Crecimientoóptimoentre 20°Cy 40°C
Las bacteriasque se hanadaptadoal cuerpohumanoson mesofilas,
temperaturaoptima de crecimientoes de 37°C, nuestratemperatura
corporal !!
Temperaturade incubaciónenlos laboratoriosclínicoses de 35°C.
Temperaturasmenores,(22°C), o temperaturasaltas(42°C) son
parámetrosde identificaciónpara las que asílo requieran.

8. Temperatura
Psychrophiles Thermophiles Mesophiles

9. Requerimientosambientales
Aaeróbicasobligadas–requierenoxígenomolecular para crecer.
Ej. Bacillus subtillis
Anaeróbicasobligadas–No crecenenpresenciade oxígeno.
Ej. Clostridium spp.
Anaeróbicasfacultativas–Crecenenpresenciao enausenciade
oxígeno. Si ésteestapresente, lo utiliza, puesla respiraciónaeróbica
(oxidacion) es mucho mas efectivaque el procesode
fermentación(anaeróbico). Enterobacterias
Anaerobiasaerotolerantes–Puedensobrevivirenpresenciade
oxígeno, perono lo utilizanmetabólicamente.
Streptococcus spp.

10. Requerimientosambientales
Capnofílicas–Bacteriasque requierenCO2para crecer,
usualmenteentre 5 –10 %. Ej. Neisseria gonorrhoeae
Microaerofílicas–requierenbajaconcentraciónde oxígeno.
5%-6% O2Ej. Campylobacter jejuni
Campylobacter -Tambiénestermofílicay capnofílica…
Necesitamediosespecialespara proporcionarla oxigenación
adecuadae incubadoraa 42 C para crecer.

12. Patogenicidad
Patógenosoportunistas
Producencondicionesclínicasenel huéspedcuandoéstese
compromete, inmunológicamentehablando.
Ej. Neisseria meningitidis
Todaslas Enterobacteriasson patógenosoportunistas
Infecciónmas comúnes de orinaEj. E.coli

13. Patogenicidad
Patógenosverdaderos
Siemprecausancondiciónclínicaenel paciente
No todohuéspedtendrála mismarespuestapuesdependede la
cantidadde bacteria que entre al sistema, sitienela capacidad
de producirtoxina, cápsulaetc. y la respuestainmunológicadel
huésped.
Clostridium perfringes, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis

14. CrecimientoBacteriano
Bacteriasse replicanporfisiónbinaria.
De unacélulamadre, salendos célulashijas.
Ambascon las mismascaracterísticasde la célulaoriginal.
El tiempoque tomaesteprocesose conocecomo
Tiempode Generación
Este dependede la bacteria.
E.coli = 20min.
M.tuberculosis= 24hrs.

16. CrecimientoBacteriano
Cadabacteria tienesupropiafisiologíay patrónmetabólico, estoes lo
que le permitesobrevivirenun habitat particular…
Estose demuestraencultivos( in vitro) por medio de
curvade crecimientobacteriano.

17. MorfologíaBacteriana

20. CélulaBacteriana

21. plásmidos

22. Pared celular–Gram + /-

23. Lipopolisacárido
LipidA
Corepolysaccharide
OsidechainorOantigen
LipidA-Endotoxinactivity
Core-Contributestothenegativechargeofbacterialsurface
Ochain-Actsassurfaceantigen

24. Endotoxicshock
Infección severa
con bacterias
gramnegativas.

25. Bacillusanthracis Anthrax
Bordetellapertussis Whoopingcough(tosferina)
Clostridiumbotulinum Botulismo
C. perfringes,septicumGangrena gaseosa
Clostridiumdificille Pseudomembranouscolitis
P. aeruginosa Infecciones piogénicas
S. pyogenes Infecciones piogénicas,fiebre
escarlatina
Shigella Disentería
Exotoxinas–gram positivosy negativos

26. Producción de enzimas
Catalasa Inactiva H2O2 dentro fagocito
Coagulasa Impide fagocitosis y
opsonización
HialuronidasaHidroliza matriz
intercelular(acido hialurónico)
B-lactamasa Resistencia a Penicilina y
Ampicilin
Leucocidinas Destruyen Neutrófilos

27. Funcióndel MicrobiólogoClínico
Aislar–Identificar-Analizar
El conocimientode la estructuray fisiologíabacterianaes
extremadamenteimportantepara el microbiólogopara poder
llevara cabolo siguiente:
1. Cultivodel organism a partirde la muestradel paciente.
2. Caracterizacióne identificacióndel organismoluegode aislarlo.
3. Predecire interpreter patronesde sensitividad.

28. Aislar-Identificar-Analizar
Aislar…
Se necesitaconocerlos requerimientosde crecimientobacteriano
para poderseleccionarel medios(s) necesariospara el cultivo
primarioy optimizarla probabilidadde aislamientoefectivo.
Identificar…
La caracterizaciónmicroscópicay la subsiguienteobservaciónde
diferentespatronesbioquímicos, son la base de los sistemasde
identificaciónutilizadoshoy día.
Recientesavanceenáreade la BiologíaMolecular tales como
Amplificaciónde ácidosnucleicosy MALDI-TOF ---matrix-assisted
laser desorption/ionization---hanreemplazadolas bioquímicas,
perono entodoslos escenarios.

29. Aislar–Identificar-Analizar
Analizar…
Tanto la estructuracelular, comosus patronesbioquímicosson la
base para determinarla sensitividada agentesantimicrobianosde
una bacteria.
La habilidadde estasa cambiarrápidamentey adquirirnuevos
genes medianteprocesosde mutacióny de transferenciagenética
presentanun constanteretoal microbiológoclínico.

30. Toma de Muestra–Pre Analítico
Una buenaselección, coleccióny transportede muestrason pasos
fundamentalespara que el resultadoenel laboratorioprovea
informaciónque ayudea tratarefectivamenteal paciente.
Muestrano adecuadaresultaen:
No deteccióndel agenteinfeccioso
Administraciónde terapiainadecuada
El manejoy transportede muestrasclínicasdebe estarpor escritoy
repasadapor el personal a cargo.
Se debe dar“in service” con frecuenciapara puntualizarcambiosy
mejorarel resultadode todoel proceso.

31. Goal: mantenerviabilidadde los organismos
con un mínimode contaminación
PrincipiosFundamentales
Si posible, tomarmuestraenfaseagudade la infección, antes
administrarantibióticos
Seleccionarel area anatómicacorrecta.
Usarla técnicacorrectacon mínimode contaminación
Cantidadadecuadade la muestra

32. Empacarmuestraenenvaseo mediode transportedesignado
Rotularcorrectamenteel envasesin olvidarel sitioanatómicode dondese
obtuvo.
Transportaral laboratoriorápidamenteo asegurarsede almacenarlaen
lugardondeno se degrade .
Notificarrápidamenteal laboratoriosise sospechapatógenoinusualo
agentede Bioterrorismo.

33. Tomade Muestra
Utilizarenvasesestériles–exceptomuestraescreta
Muestraescreta–envaselimpioe impermeable
Hisopos–muestrasde tractorespiratoriosuperior,oidoexterno,ojos,
tractogenital. Compuestosde dacron,rayon, algodón, etc.
Los de algodónpuedensertóxicosa algunasbacterias
Neisseria spp.
 Heridas, abcesos,lesiones–limpiaráreacon aguaestéril,yluego
aspirarcon jeringuilla. Colocarel material entuboestérilo de
transporte.

34. Tomade Muestra

35. Toma de muestra
Una de las muestrasque mas se recibenenel laboraorioes la muestrade
orina.
Metod: clean-catch midstream specimen
Muestrasde esputo–sirvenpara identificaragentesque causanpulmonia
y provienedel tractorespiratorioinferior.
Hay saberla diferenciaentre esputoy saliva. Si fuerapara Mycobacteria,
se requierentresmuestrasfirst morning.
Muestrade escreta–para detector patogenosgastrointestinales. Se
puedenusarhisopossiemprey cuandoel material fecalsea visible. Lo
ideal son tresmuestrasendiasconsecutivos.

36. Preservativos/Anticoagulantes
ORINA –AcidoBorico–mantieneorinaviable a temperature de salon
hasta por 24 hrs.
ESCRETA –se refrigerasitransportetardaal lab. mas de dos hrs. Si mas
de estetiempo, colocarenmedio de transporteCarry –Blair
ANTICOAGULANTES
Se usaenmuestrasde sangre, medulaoseay fluidosynovial.
El mas usadoes Sodium PolyanetholSulfonate -SPS
Heparina–para aislarMycobacteria ensangre.

37. Transporte
Paso muyimportanteenel procesamientode muestra, sin
embargo, no todaslas muestraspuedenser procesadastan pronto
se reciben.
Existeun protocolode prioridades:
Nivel1 –críticas/invasivas--enfermedadescríticas/fuenteinvasiva
fluidos-amniotico, cerebroespinal, pericardico
Nivel2 –no preservadas–se degradanrápidamentesino se procesan
esputo, drenagede heridas, tejidos

38. Prioridades
Nivel3 –se requierecuantificación
orina
Nivel4 –Preservadas
escreta/orinacon preservativos. Hisopos
Si el procesamientode demuestrasde nivel2 y 3 se pospone, se le
debeproveeralmacenamientoy preservaciónadecuados.

39. Empaquetransportebacteriaspeligrosas

40. Rechazode muestra-faseanalítica
Algunosejemplosde muestrasque debenser rechazadasson:
Informaciónenmuestrano concuerdacon requisicióno no está
identificada.
Envaseno apropiadoo el mismoestáliqueando.
Cantidadinadecuadade muestrao la mismaestáseca.
Tiempode transportede másde dos hrs. y no estápreservada.
Pidencultivoanaeróbicoy el medio de transporteno es para estos
fines.
Gram stain de esputorevelamenosde 25 WBC y másde 10 células
epiteliales/low-power field

41. Observaciónmacroscópica
sies un hisopoo esun aspirado
consistenciade escreta–formadao líquida
sangreo mucosidadpresente
volúmen
fluidos-turbidez
Estasobservacionespermitendeterminarcuanadecuadaes la
muestray sise necesitanprocesosespecialeso adicionales.
Si cultivoanaeróbico, observarpresenciade gas, olordesagradable,
o presenciade granulossulfurosos.
Estosson conglomeradosde pus y bacteriasfilamentosasobservados
eninfeccionescon Actinomicetos.

43. Observaciónmicroscópica
Herramientaimportantísimaa la hora de proveerinformaciónpara
tratamientoaúnantes de la identificacióndel agenteinfeccioso
por cultivo. Ej. Neisseria gonorrhoeae
Ayudaa indicarun procesoinfeccioso. Si vesdiplococosgram
positivosenforma lanceoladay muchascelulasblancas, puedes
sospecharStreptococcus pneumoniae

44. Observaciónmicroscópica
Ayudaa trabajarla muestracon el tipode medio de cultivo,
oxigenación, panel a utilizarseenmediosautomatizadosetc…
Ayudadetectarnecesidadde pruebasadicionales.
El pasoprincipal para la observaciónmicroscópica, esteñirla
muestracon Gram stain.

45. Gram Stain
Gram + Gram -
Primary stain-
Crystal violet
Stains purple Stain purple
Fixation (mordant)-
iodine
Remains purple Remains Purple
Decolorization-Organic
solvent
(95% ethanol:acetone) (1:1)
Remains Purple Decolorize
Counterstain-
Safranine(red)
Remains Purple Stain red

47. Otrostintes
Acid Fast Stain
Tiñebacteriascon un alto contenidode lípidosy cerasensupared
celular. La bacteria acid fast positivaporexcelenciaesMycobacteria.
Si la bacteria esacid fast positivase verarojacon fondoazul.

48. Otrostintes
India ink
Permiteapreciarla cápsulaque rodeaalgunaslevaduras
comoesel Cryptococcusspp.

49. Observacióne interpretaciónde cultivos
La habilidadde reconocery describirla morfologíade la coloniaen
mediosde cultivo, junto al gram stain, facilitanel procesode
identificacióninicialde un microorganismo.
MEDIOS SELECTIVOS
Tienenagentesque inhibenel crecimientode ciertasespeciesy permite
recobrarpatógenosque resistenestosagentesinhibidores.
Modified Thayer Martin –Neisseria spp.
MEDIOS DIFERENCIALES
Mediosbasadosenla habilidadde algunasbacteriasde utilizarsustratos
que usualmenteproducencambiosenpH y se detectanporcambiosen
enel color del medioel cualposeeindicadorde pH.
MacConkey agar (MAC) selectivoy diferencial
MEDIOS PRIMARIOS
Creceprácticamentetodo. Agar sangre(SBA) y agar chocolate(CHOC
agar)

50. Mediosselectivosy diferenciales
MAC agar SBA agar
Thayer-Martin
agar

51. Identificaciónbacteriana
PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y METABÓLICAS
a.Utilizaciónde Carbohidratos( TSI)
b.Metabolismode Glucosay susproductos( MR-VP)
c.Utilizaciónde Amino acidos( Lisina, Ornitina, Arginina)
d.Pruebasmiscelaneas( oxidasa, ureasa, motilidad)
Estaspruebastardan18-24hrs. enpoderleerlas. Para aislaral agente
de la muestratardaentre 24-48 hrs.
Tiempototal = 72hrs.

52. Triple Sugar Iron TSI

53. AUTOMATIZACIÓN

54. Inmunodiagnóstico
Utilizadoampliamente.
Su mayor ventaja: detectaagentesinfecciososdifícilesó imposiblesde cultivar .
Virus y bacteriasde transmisiónsexual __
Treponema pallidum , Chlamydia trachomatis
Algunasde las pruebasmas utilizadasenel laboratorioclínico:
EIA -EnzimeImmunoassay –Bordetella pertussis
IFA -Indirect Florescent Antibody –Mycoplasma pneumoniae
LA -Latex agglutination -Salmonella. Streptococcus group B
Western Blot –HIV

55. DiagnósticoMolecular
Representaun avancesignificativoenel laboratorioclínico.
Han aumentadosusensitividady especifidad.
Proveenal médicoinformaciónrápiday certerapara el diagnósticoy
tratamientode agentesinfecciososque de otramaneratardaría
mucho más.
Las pruebasmas utilizadasson:
Hibridizaciónde ácidosnucleicos
Formaciónde enlaces de hidrógenoentre nucleótidosde
DNA/RNA de unasola hebraque seancomplementarios. Bajo
condicionescorrectas, formanunamoléculade ácidosnucleicosde
doblehebra, estable. Estoshíbridospuedenserde DNA:DNA, DNA:RNA,
RNA:RNA .

56. DiagnósticoMolecular
Amplificacciónde AcidosNucleicos
Utilizadopara aumentarla cantidadde acidonucleicode
organismosa seridentificados( Target) enun periodocortode
tiempo.
Estoaumentala cantidadde acidosnucleicosa serdetectados
porvariosmétodos.
Tambiénse utilizapara aumentarla señaldespuésde haber
hibridizadoun probe al ácidonucleicode un organismo.
Los métodosde amplificacióncombinantiempode detección
rápidacon especificidady sensitividad.
Enalgunoscasosse puedenusarestosmétodosdirectamenteenla
muestra, detectandoel ácidonucleicodel microorganismo
rápidamente. Ej, PCR

57. MALDI –TOF Mass Spectrometry
Identificarápidamentebacteriasy hongos.
Luegode aislarel organismoenmediosólido, se colocacoloniaen
platode metal.
Se le añadesoluciónla cualextraelas proteínasdel organismo.
Se colocaenel instrumentodondeocurrenunaseriede reacciones.
Cadaproteína( microorganismo) genera unaseñaldiferente.

59. Terapiaantimicrobiana
Antibióticos-Substanciasquímicasparatratar
enfermedadesqueson producidospormicroorganismos.
Usualmente,hongosy bacterias.
Compuestossintéticos–Substanciascompletamente
diseñadasporel hombre. EjSulfonamidas
Compuestossemisintéticos–Compuestosnaturales
alteradosquímicamentepor el hombre.
Ampicillin,Carbenicillin

60. Terapiaantimicrobiana
Bactericida–Mata bacterias
Bacteriostático–Inhibeel crecimientobacterianomediante
intervenciónde procesosmetabólicos.
Imp. saber siel agenteactúasobrecélulasen crecimiento.
Ej. Sulfonamidasesbacteriostático, Penicilinaesbactericida
perosolo en célulasen crecimiento, sise administranjuntos,
tendránefectoantagónico.

61. Mecanismosde Acciónde
diferentesagentesantimicrobianos
AfectanIntegridadde la pared
celular.
Inhibiciónsíntesisde proteínas
Inhibiciónde metabolitos
esenciales
Interferenciacon síntesisde
ácidosnucleicos.
Alteraciónde la membrana

62. Integridadde la pared celular
Para que se realicesíntesisde la pared celular, intervienenvariasenzimas, sise
interfierecon ellasó se inactivan, se destruyeó se afectael productofinal de la
pared.
Transpetidasasó Penicillin Binding Proteins(PBPs) son necesariasen transpeptidación
entre NAM enPeptidoglican.
Anillo de B-lactam de agentesantimicrobianosnaturales y semisintéticosse unena
estasenzimas, inactivándolas.

63. B lactam antibiotics

65. B lactam antibiotics
Penicilina-ácido6 aminopenicilánico. La produce el hongoPenicillium
A la estructuracomúnse le añadengruposprostéticosen posicióndel
grupoamino #6 y se formandiferentesPenicilinas.
Cefalosporinas–Del hongoCephalosporium
Se clasificanen distintasgeneraciones, desdela primerahasta la cuarta.

66. Carbapenem
Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Doripenem
Alta afinidadcon PBPs
Carbapenemasas –Problemade resistencia
CRE= CarbapenemResistant Enterobacteria

67. CRE
CarbapenemResistant Enterobacteria
Escherichia coli
Salmonella spp.
Enterobacter cloacae
Proteus mirabilis
Klebsiellaoxytoca
Klebsiellapneumoniae

68. B lactam antibiotics
Acciónbactericida
Bacteriasexpuestasa B-lactam puedenproducirenzima
B-lactamasalas cualeshidrolizanel anillocausando
dañoal antibiótico.
Estoesun mecanismode resistenciade lasbacterias.
Para contrarrestaresteefectoletal, se uneun B lactam +
inhibidorde B-lactamasa, algunosde ellosson:
Acidoclavulánico, Sulbactam, Tazobactam

69. Inhibidoresde B lactamasa
Acidoclavulánico-amoxicillin/clavulanate
Sulbactam -ampicillin/sulbactam
Tazobactam-piperacillin/tazobactam

70. Mecanismosde Resistencia Bacteriana

71. The END