Detección e identificación de anticuerpos irregulares

Generalidades, Métodos y técnicas

1. Detección e identificación de Anticuerpos irregulares Jessica N. Altamirano Ruiz Inmunohematología Septiembre 2017

2. Introducción Existen dos tipos de anticuerpos irregulares : los aloanticuerpos y los autoanticuerpos . Cuando algún individuo produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno que no posee , éste se denomina aloanticuerpo. En cambio, cuando produce un anticuerpo dirigido contra un antígeno que posee, éste se denomina autoanticuerpo . Consecuentemente , por definición , los aloanticuerpos sólo reaccionan con glóbulos rojos alogénicos que expresan el antígeno correspondiente, no con los glóbulos rojos propios. Contrariamente , los autoanticuerpos reaccionan con los glóbulos rojos propios. En efecto, los autoanticuerpos generalmente reaccionan con los glóbulos rojos de la mayoría de los reactivos así como con los glóbulos rojos autólogos . (American Association of Blood Banks, 2005)

3. Anticuerpos irregulares: Definición Son aquellos anticuerpos formados en el paciente que carece de cierto antígeno y es expuesto a este, por lo que su cuerpo reacciona formando aglutininas (aloinmunización) para el antígeno extraño; y que en una segunda oportunidad, al entrar en contacto con el mismo antígeno genera una respuesta inmunitaria , causando reacciones Post-transfusionales, EHRN, entre otras.

4. Anticuerpos irregulares: Generalidades Son principalmente IgG , por lo tanto de importancia clínica. Entre los que se encuentran los Anticuerpos del: Sistema Rh: D, C, E, c, e Sistema MNSs Sistema Duffy ( Fya , Fyb ) Sistema Kidd ( Jka , Jkb ) Sistema Kell (K, c, Kpa , Kpb , Jsa , Jsb ) Sistema Lutheran ( Lua , Lub ) Sistema Lewis (Lea, Leb ) Sistema P (P1) Sistema X ( Xg )

5. Detección de anticuerpos irregulares (TAI) Método/Técnica de Screening en la rutina del Bco. de Sangre. Se realiza en simultáneo a la determinación del grupo sanguíneo ABO y Rh. Además se le adjunta una prueba autóloga .

6. Identificación de anticuerpos irregulares Estudio completo de Anticuerpos Irregulares. Se realiza cuando el Screening de Anticuerpos Irregulares da Positivo en alguno de los tubos. Existen Tres técnicas: En Tubo, En Columna de Gel y Microplacas .

7. Materiales, Técnicas y métodos Técnica en Tubo Técnica en Columna Técnica en Microplaca Células panel. Suero de Coombs Poliespecífico. Células Control Coombs. Espécimen. 3 Lecturas: Salino 37°C Fase Coombs Técnica Manual Células panel. Columnas de reacción Espécimen. 1 Lectura: 37°C Pueden ser: Automatizado Semi -automatizado Manual Células anti- IgG Microplacas Espécimen. Lectura Final (previa incubación, lavado y agitación) Pueden ser: Automatizado Semi -automatizado Manual

8. Materiales, Técnicas y métodos Células testigos (Paneles) Células completamente fenotípadas . Pueden ser pool, o de un único donante. Permitir identificar los anticuerpos de mayor frecuencia y excluir otros. Al menos 2 paneles con expresión homocigota para Ac que presentan efecto dosis. Poseer al menos un perfil R1R1 y otro R2R2 Suero Anti-Inmunoglobulina Humana (SAGH o Coombs) Debe ser poliespecífico, apropiado para cada tipo de técnica (incorporado en los sistemas de aglutinación en columna o en presentaciones para su utilización en tubos). (Aburto, 2014) “Para poder concluir con la identidad de un anticuerpo, deberán existir suficientes células positivas y negativas para cada antígeno, de tal forma que los resultados obtenidos en un determinado caso sean definitivos y no deducidos al azar o por casualidad.” (Linares, 2002)

9. Columnas de Gel ( Griffols ) Fase Continua: SEPHADEX G Superfino Fase Dispersa: LISS/ NaCl + SAGH Columnas de Perlas de Vidrio (Jonhsons&Jonhsons) Fase Continua: Micro Perlas de Vidrio Fase Dispersa: LISS/ NaCl + SAGH Técnicas de Columnas Materiales, Técnicas y métodos

10. Fase sólida pueden contener antígenos o anticuerpos . Los glóbulos rojos intactos o las membranas de los mismos, de fenotipo conocido, son fijados a pocillos de microplacas . Se dispensa el suero o plasma del paciente . Luego de la incubación , se remueven los anticuerpos que no se unieron. Se utiliza una suspensión de glóbulos rojos testigos revestidos con anti- IgG . Luego de una breve centrifugación Positiva: si las células indicadoras se adhieren en forma difusa en las paredes del pocillo Negativa: si las células testigo se sedimentan en el fondo . Materiales, Técnicas y métodos Técnicas en Microplacas

11. Los Micropocillos vienen impregnados con SAGH ( Poliespecifico ) en una fase continua en el fondo del pocillo Mientras por fase dispersa tiene LISS. Posee un imán en la base del pocillo. Los eritocitos sensibilizados reaccionan con el SAGH en el fondo del pocillo precipitándose formando un patrón regular. No permite la observación de hemolisis. Materiales, Técnicas y métodos Técnicas en Microplacas E.M®Technology por Diagast

12. Interpretación de los resultados En tubo: En Columna: En Microplaca : (Aburto, 2013)

13. Método de identificación

14. Método de identificación Se eliminan anticuerpos presentes en los paneles negativos. Uno por uno, en la línea de cada panel positivo: Se eliminan aquellos anticuerpos que nos están presentes en el panel. Finalmente, identificar el o los Anticuerpos Irregulares presentes.

15. Técnicas para Anticuerpos irregulares Múltiples Tratamiento con Enzimas. Variación en la Temperatura de incubación. Aumento tiempo de incubación. Modificación del pH. Inhibición por antígenos solubles. Absorción y elución selectiva. Empleo de Compuestos sulfidrilicos . Uso de células Rh nulo. ( Linares, 2002)

16. Técnicas para Anticuerpos irregulares Múltiples Tratamiento con enzimas Se le adiciona enzimas a os glóbulos rojos, propiciar la reacción de Antígeno-anticuerpo con el fin de identificar anticuerpos sin que estos se vean interferidos por la presencias de otros anticuerpos presentes. Las enzimas proteolíticas de preferencia son Bromelina , Papaína y Ficina . Existen preparados y células tratadas comerciales y listo para su uso. Antígenos Afectados por el tratamiento enzimático Potenciados Atenuados Rh MNS P Duffy Kidd Xg Lewis Chido/ Rodgers Para la técnica en columna utilizar Columna neutral.

17. Técnicas para Anticuerpos irregulares Múltiples Variación de Temperatura de incubación. Principalmente se usa, cuando existe un anticuerpo frío ( IgM ) fijador del complemento enmascarando anticuerpos calientes ( IgG ) de significancia clínica. Absorción de anticuerpos Permite extraer un anticuerpo interferente, uniéndolo a su antígeno ubicado en el glóbulo rojo y dejando al segundo anticuerpo en el plasma. Básicamente, se busca sensibilizar el glóbulo rojo , y luego por una centrifugación separar el plasma de los eritrocitos. Y así evaluar el otro anticuerpo que estaba siendo opacado por el anticuerpo absorbido.

18. Técnicas para Anticuerpos irregulares Múltiples Elución de anticuerpos La elución busca separar del hematíe, los anticuerpos unidos a él (sensibilizados), con el fin de evaluar específicamente y por separado ese único anticuerpo. Puede ser por métodos físicos o métodos químicos. El proceso de Absorción y elución por lo general, van juntos; pero la elución puede realizarse también a pacientes sensibilizados “in vivo”.

19. Técnicas para Anticuerpos irregulares Múltiples Método Ventajas Desventajas Calor (56°C) Rápido Bueno para EHRN por ABO Pobre para la recuperación de alo y auto anticuerpos ( IgG ) Congelación Rápido Bueno para EHRN por ABO Menos volumen de GR Digitonina ácida No toxico Recuperar la mayoría de anticuerpos Eliminación tedioso del estroma Baja sensibilidad para anti- Kidd Diclorometano / Cloruro de metileno No carcinogénico, no inflamable Bueno para Alo y auto anticuerpos ( IgG ) Vapores Tóxicos Acida en frío Rapida y fácil. Hay kits comerciales Para la mayoría de alo y auto anticuerpos calientes Posibles falsos positivos del eluato . Métodos de obtención del eluato . Adaptado desde: American Association of Blood Banks. (2005). Technical Manual . Bethesda, Maryland: American Association of Blood Banks.

20. Utilidad Clínica En el Banco de Sangre: Aclarar discrepancias ABO Catalogación de donantes: Manejo del Stock. Receptores de Transfusiones: Evitar Reacciones Transfusionales. En la Clínica: Estudio de sensibilización en embarazadas: EHRN. Estudio de Anemias Hemolíticas Autoinmunes. Estudio de las Reacciones Post-transfusionales.

21. conclusión Entre el 0,3 y 38% de la población presenta aloanticuerpos; dependiendo del grupo de pacientes o donantes que se estudie y la sensibilidad de los métodos utilizados. La inmunización a los antígenos eritrocitarios puede ser el resultado de embarazo , transfusiones, trasplantes , administración de material inmunogénico , etc . En algunos casos, no se puede identificar el episodio específico que provocó la inmunización . Los anticuerpos generados naturalmente presumiblemente son el resultado de la exposición a antígenos ambientales, bacterianos o virales similares a los antígenos de grupos sanguíneos. Asimismo, los anticuerpos detectados en las pruebas serológicas pueden adquirirse de manera pasiva, a partir de inyección de inmunoglobulina, transfusión de plasma , linfocitos pasajeras en trasplante de órganos o células progenitoras hematopoyéticas. (American Association of Blood Banks, 2005)

22. BiblioGrafia American Association of Blood Banks. (2005). Technical Manual . Bethesda, Maryland: American Association of Blood Banks . Linares, J. (2002).  Inmunohematología y tranfusión : Principios y fundamentos . Caracas, Venezuela . Aburto, A. (2014). Recomendaciones para la detección e identificación de anticuerpos irregulares eritrocitarios . Santiago, Chile: Instituto de Salud Pública de Chile. Aburto , A. (2013). Recomendaciones para la clasificación sanguínea ABO . Santiago, Chile: Instituto de Salud Pública de Chile.

23. Detección e identificación de Anticuerpos irregulares Jessica N. Altamirano Ruiz Inmunohematología Septiembre 2017