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Cibertorio

1. UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA INGENIERÍ A AGROPECUARIA BIOTECNOLOGÍA Detección de una mutación en el protooncogén RET causante de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A) utilizando PCR y enzima de restricción ESTUDIANTE(S): Chicango Bertha, Guanocunga Wendy, Rodriguez Melany, Juiña Jose, Quinga Bryan. FECHA: 02 de Agosto de 202 3

2. Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos Realizar la detección de la mutación en el protooncogén RET causante de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A) mediante PCR y las enzimas de restricción Hin 6I y Hin dIII. Identificar los pacientes que presentan una mutación en el protooncogén RET causante de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A) utilizando la enzima de restricción Hin 6I. Identificar mediante PCR y enzima de restricción Hin dIII la efectividad de detección de pacientes que presentan mutación en el protooncogén RET.

3. Marco teórico Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A (MEN2A) E s un síndrome hereditario caracterizado por el hallazgo de carcinoma medular de tiroides, feocromocitoma, hiperplasia o adenomas paratiroideos (que causan hiperparatiroidismo) Ubicación del gen 10q11 en el cromosoma

4. El c-Ret C ompuesto de 21 exones, los cuales codifica un receptor del tipo tirosina kinasa. Este receptor se caracteriza por una región caderina-símil en el dominio extracelular, una región rica en cisteína inmediatamente externa a la membrana y un dominio tirosina kinasa intracelular. Mutaciones del protooncogen RET asociadas a cáncer medular tiroideo hereditario

5. Patogenia La mutación se hereda de forma autosómica dominante con alta penetrancia. En los portadores del gen RET el riesgo del desarrollo del carcinoma medular de tiroides es mayor al 95 %, feocromocitoma de un 30 %, hiperparatiroidismo de un 15-30 %, neuromas mucosos y otros defectos que forman parte del síndrome MEN2 en un 5 %. Diagnóstico MEN 2 suele ser variable de unos sujetos a otros, tanto en el número de órganos afectados, como en la cronología del inicio de las diferentes patologías y la forma de presentación de la enfermedad; ello hace que el diagnóstico basado en la clínica sea difícil y generalmente tardío. Aunque inicialmente la sintomatología es leve y la afectación glandular se presenta como hiperplasia, si dejamos evolucionar la enfermedad sin tratamiento hasta el 48% de los pacientes con MEN2 pueden fallecer por causas secundarias a la enfermedad, de ahí la importancia de un diagnóstico precoz

6. Metodología PARTE 1 Figura 3 Tabla guía para la preparación de mezclas de reacción para el diagnóstico de mutación del protooncogen. Reacción PCR (Incubar) Guardar 4°C

7. Metodología PARTE 2 Gel de Poliacrilamida 5% Se ajustó en la fuente de corriente el voltaje y el tiempo (200 V durante una hora si se elige un gel de poliacrilamida 5%. o bien 300 V durante hora y media para un gel de agarosa 2%). Se conectó a la corriente para comenzar la electroforesis y se observó.

8. Resultados obtenidos Esquema de la corrida electroforética de tres muestras de ADN de diferentes pacientes con la enzima de restricción Hin 6I. Grupo A: 1ª parte del experimento, con PCR: PCR 401 y 2ª parte del experimento, con enzimas de restricción: Hin 6I ¿Cuál de los pacientes presenta la mutación? Paciente 2 y paciente 3 correspondiente a los tubos 8 y 9. ¿Son homocigóticos o heterocigóticos para la mutación? -Paciente 1: Homocigoto con el gen sano de la banda negra. -Paciente 2: Heterocigoto un gen completo y el otro cortado. -Paciente 3: Homocigoto con el gen mutado (no tiene el gen completo) los dos genes están superpuestos. ¿Cuál de los pacientes presenta la mutación? Los pacientes 1 y 2 correspondientes a los tubos 7 y 8 presentan mutación. ¿Son homocigóticos o heterocigóticos para la mutación? El paciente 1 es homocigoto con el gen mutado y el 2 heterocigoto gen completo y el otro mutado

9. Esquemas de la corrida electroforética en gel de agarosa de tres pacientes con la enzima de restricción Hin III. Grupo B: 1ª parte del experimento, con PCR: PCR401 y 2ª parte del experimento, con enzimas de restricción: Hin dIII. Esquemas de la corrida electroforética en gel de poliacrilamida de tres pacientes con la enzima de restricción Hin III. Interpretación: El diagnóstico para la detección de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A), no se puede realizar puesto que la enzima de restricción Hin dIII utilizada para este ensayo no fue válida, pues no realizó el corte en el sitio correcto de la cadena de ADN. es decir no reconoció el sitio de restricción. En sí, esta enzima no sirve para la detección de la mutación del protooncogen, por ello lo que se sugiere en el ensayo es probar otra enzima con secuencia similar a la enzima de restricción Hin 6I, que permita reconocer el sitio de mutación del gen.

10. Discusión Al realizar la detección de una mutación en el protooncogén RET causante de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A) empleando PCR con la enzima de restricción Hin 6I de tres pacientes que fueron analizados su DNA genómico (Pt1, Pt2, Pt3) se pudo determinar que el dos de los tres paciente presentaron la mutación (Pt2, Pt3) respectivamente. Según Giménez Blasi, N. (2018) menciona que la enzima Hin 6I puede detectar varias mutaciones en el exón 11 y en su estudio se practicó secuenciación de ADN para caracterizar la mutación específica en la familia MEN 2A en la que esta endonucleasa detectó la variante genética. Cabe destacar que al realizar por segunda vez la prueba de detección empleando PCR con la enzima de restricción Hin dIII no fue válida, puesto que no se realizó el corte en el sitio correcto de la cadena de ADN es decir no reconoció el sitio de restricción produciendo un falso positivo. Para realizar el PCR en este ensayo se utilizaron controles internos los cuales fueron sin DNA tubo 4, sin cebadores tubo 5, sin DNA tubo 10 y sin enzima tubo 12, Aguilera, P. (2015) dice que para las técnicas de biología molecular es importante utilizar controles (CI) para determinar contaminación, errores en la manipulación, funcionamiento incorrecto de los reactivos o equipos, siendo el principal objetivo, evitar informar falsos positivos o negativos durante el ensayo y destaca que se debe tener un manejo adecuado de los materiales y estén perfectamente esterilizados.

11. Conclusiones Al realizar la detección de la mutación en el protooncogén RET causante de neoplasia endocrina múltiple de tipo 2A (MEN2A) utilizando la enzima de restricción Hin 6I se encontró que dos de los pacientes 2 y 3 mutaron mientras que al utilizar la enzima Hin dIII dieron resultados diferentes al definir que los tres pacientes son sanos. Para el diagnóstico de mutación en RET causante de MEN2A se utilizaron una pareja de cebadores o iniciadores de PCR, específica para una región del exón 11 del protooncogén RET y al realizar la digestión de los productos de PCR con la enzima de restricción Hin 6I se determinó que el paciente 2 y 3 tienen mutación en RET. Mediante PCR y enzima de restricción Hin dIII no fue efectiva para la detección de pacientes que presentan mutación en el protooncogén RET, ya que la enzima no realizó el corte en el sitio correcto de la cadena de ADN es decir no reconoció el sitio de restricción por lo tanto dieron resultados erróneos.