Kiều Công Trí - phần III.docx ccccccccccccccccccccccccccccc

vv

1. Kiều Công Trí
III. ĐỘT PHÁ LIỆU PHÁP GENE GẦN ĐÂY – CRISPR/CAS 9
1. Giới thiệu chung về CRISPR/Cas 9
Một trong những hướng nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp gene mới nhất và phổ biến nhất
hiện nay là CRISPR/Cas 9. Đây là một thành tựu đã được giới khoa học nói riêng và thế giới
nói chung công nhận qua giải thưởng Nobel Hóa học năm 2020 của hai nhà khoa học nữ là
Giáo sư Emmanuelle Charpentier (người Pháp) và Giáo sư Jennifer A. Doudna (người Mỹ).
CRISPR/Cas 9 được ví như là “chiếc kéo phân tử”, đây là một trong những công cụ sắc bén
nhất của công nghệ gene trên thế giới hiện nay.
Công cụ chỉnh sửa gene mới này đã cách mạng hóa khoa học sự sống phân tử, mang lại cơ
hội mới cho việc nhân giống cây trồng, góp phần vào các liệu pháp điều trị ung thư và có thể
biến giấc mơ chữa khỏi các bệnh di truyền thành hiện thực.
Giới nghiên cứu cần thay đổi gene trong các tế bào nếu muốn hiểu về cơ chế bên trong sinh
vật sống. Đây từng là công việc tốn thời gian, khó khăn và đôi lúc bất khả thi. Giờ đây, với
1
Ảnh 1 - Chân dung hai nữ nhà khoa học đoạt giải Nobel Hóa học 2020

2. Kiều Công Trí
CRISPR/Cas 9, các nhà khoa học có thể thay đổi "mật mã" của sự sống (ADN) chỉ trong vài
tuần [1].
2. CRISPR/Cas 9 là gì?
2.1. Khái niệm
CRISPR (viết tắt của "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats") là một
công nghệ mà các nhà khoa học nghiên cứu sử dụng để chỉnh sửa chọn lọc DNA của các
sinh vật sống. CRISPR được điều chỉnh để sử dụng trong phòng thí nghiệm từ các hệ thống
chỉnh sửa gen tự nhiên có trong vi khuẩn [2].
2.2. Lịch sử phát triển CRISPR/Cas 9
Sơ lược dòng thời gian:
Năm 1987: Phát hiện CRISPR trong vi khuẩn E. coli  Chức năng, vai trò của
CRISPR trong vi khuẩn chưa được xác định rõ ràng.
Năm 1995: Francisco Mojica phát hiện trình tự tương tự trong cổ khuẩn  Đặt giả
thuyết về khả năng CRISPR liên quan đến khả năng miễn dịch của vi khuẩn với virus.
Năm 2007: Barrangou và Horvath chứng minh CRISPR giúp vi khuẩn miễn dịch với
virus.
Từ năm 2010: Tiềm năng chỉnh sửa gen của CRISPR dần được phát hiện qua nhiều
nghiên cứu và ứng dụng.
Năm 2012: Charpentier và Doudna phát triển CRISPR/Cas9 thành công cụ chỉnh sửa
gen.
Năm 2020: Emmanuelle Charpentier và Jennifer Doudna vinh dự được nhận Giải
Nobel Hóa học vì đã khám phá ra CRISPR/Cas 9. [4]
2
Ảnh 2 – CRISPR/Cas 9 được ví như “chiếc kéo cắt phân tử”[3]Ảnh 2 – CRISPR/Cas 9 được ví như “chiếc kéo cắt phân tử”[3]Ảnh 2 – CRISPR/Cas 9 được ví như “chiếc kéo cắt phân tử”[3]

3. Kiều Công Trí
3. Cấu tạo của CRISPR/Cas 9
Dựa trên cấu trúc và chức năng của các protein Cas, hệ thống CRISPR/Cas có thể được chia
thành hai nhóm: Nhóm I (bao gồm các loại I, III và IV) và Nhóm II (bao gồm các loại II, V
và VI). Các hệ thống nhóm I gồm các phức hợp protein Cas nhiều tiểu đơn vị, trong khi các
hệ thống nhóm II sử dụng một protein Cas duy nhất. Vì cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas 9
loại II tương đối đơn giản, nên nó đã được nghiên cứu kỹ lưỡng và sử dụng rộng rãi trong kỹ
thuật di truyền. RNA hướng dẫn (gRNA) và protein liên kết CRISPR (Cas 9) là hai thành
phần thiết yếu trong hệ thống CRISPR/Cas 9. Protein Cas 9, protein Cas đầu tiên được sử
dụng trong chỉnh sửa gen, được chiết xuất từ Streptococcus pyogenes (SpCas 9). Đây là một
endonuclease DNA lớn (1368 amino acid), có nhiều miền, chịu trách nhiệm cắt DNA mục
tiêu để tạo ra đứt gãy đôi sợi DNA và được gọi là kéo cắt di truyền. Cas 9 gồm hai vùng,
được gọi là lobe nhận diện (REC) và lobe nuclease (NUC). Lobe REC gồm các miền REC1
và REC2 chịu trách nhiệm kết hợp với RNA hướng dẫn, trong khi lobe NUC gồm các miền
RuvC, HNH và các miền tương tác với Motif gần vị trí Protospacer (PAM). Các miền RuvC
và HNH được sử dụng để cắt mỗi sợi DNA đơn, trong khi miền tương tác với PAM cung
cấp tính đặc hiệu của PAM và chịu trách nhiệm khởi đầu việc kết hợp với DNA mục tiêu.
RNA hướng dẫn bao gồm hai phần, RNA CRISPR (crRNA) và RNA CRISPR kích hoạt
(tracrRNA). crRNA có độ dài từ 18–20 cặp base, có vai trò xác định DNA mục tiêu bằng
cách ghép nối với trình tự mục tiêu, trong khi tracrRNA là một chuỗi dài các vòng giúp Cas
9 nuclease kết hợp. Trong vi khuẩn, RNA hướng dẫn được sử dụng để nhắm đến DNA virus,
nhưng trong công cụ chỉnh sửa gen, nó có thể được thiết kế tổng hợp bằng cách kết hợp
3
Ảnh 3 - [8]Ảnh 3 - [8]Ảnh 3 - [8]

4. Kiều Công Trí
crRNA và tracrRNA để tạo thành RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) nhằm nhắm đến gần như
bất kỳ trình tự gen nào cần chỉnh sửa. [5]
4

5. Kiều Công Trí
4. Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas 9
5
Ảnh 4 - [2]
Ảnh 5 - [3]Ảnh 5 - [3]Ảnh 5 - [3]Ảnh 5 - [3]
Ảnh 4 - [2]Ảnh 4 - [2]Ảnh 4 - [2]

6. Kiều Công Trí
Mô tả cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas 9
Cơ chế chỉnh sửa gen CRISPR/Cas 9 có thể được chia thành ba bước chính: nhận diện, cắt
và sửa chữa. RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) được thiết kế sẽ dẫn Cas 9 và nhận diện trình tự
mục tiêu trong gen cần chỉnh sửa thông qua thành phần cặp base bổ sung 5 crRNA. Protein
ʹ
Cas 9 vẫn không hoạt động nếu không có sgRNA. Enzyme Cas 9 tạo ra đứt gãy đôi sợi DNA
(DSBs) tại một vị trí cách PAM ba cặp base ở phía thượng nguồn. Trình tự PAM là một
chuỗi DNA ngắn (2–5 cặp base) bảo tồn, nằm phía dưới vị trí cắt và kích thước của nó thay
đổi tùy theo loài vi khuẩn. Enzyme nuclease được sử dụng phổ biến nhất trong công cụ
chỉnh sửa gen, protein Cas 9 nhận diện trình tự PAM ở dạng 5 NGG 3 (N có thể là bất kỳ
ʹ ʹ
base nucleotide nào). Khi Cas 9 tìm thấy vị trí mục tiêu với PAM thích hợp, nó kích hoạt
quá trình làm tan chảy DNA tại chỗ, tiếp theo là sự hình thành hỗn hợp RNA DNA, tuy
nhiên cơ chế Cas 9 enzyme làm tan chảy trình tự DNA mục tiêu vẫn chưa được hiểu rõ. Sau
đó, protein Cas 9 được kích hoạt để thực hiện cắt DNA. Miền HNH cắt sợi bổ sung, trong
khi miền RuvC cắt sợi không bổ sung của DNA mục tiêu để tạo ra các đứt gãy đôi sợi chủ
yếu có đầu cắt bằng. Cuối cùng, đứt gãy đôi sợi (DSB) được sửa chữa bởi cơ chế tế bào của
chủ thể. [5]
6
Ảnh 6 - [7]

7. Kiều Công Trí
5. Ứng dụng của CRISPR/Cas 9
5.1. Vai trò trong liệu pháp gene
Cho đến nay, đã có hơn 6000 rối loạn di truyền được biết đến, nhưng đa số các bệnh này
thiếu các phương pháp điều trị hiệu quả. Liệu pháp gene là quá trình thay thế gen bị lỗi bằng
DNA ngoại lai và chỉnh sửa gen đột biến tại vị trí tự nhiên của nó. Đây là sự phát triển mới
nhất trong cuộc cách mạng công nghệ sinh học y tế. Từ năm 1998 đến tháng 8 năm 2019, đã
có 22 liệu pháp gene, bao gồm CRISPR/Cas 9, được phê duyệt để điều trị các bệnh lý ở
người.
Kể từ khi được phát hiện vào năm 2012, chỉnh sửa gene bằng CRISPR/Cas 9 đã mang lại hy
vọng chữa trị hầu hết các bệnh di truyền đã biết như bệnh hồng cầu hình liềm, β thalassemia,
xơ nang và bệnh cơ Duchenne. CRISPR/Cas 9 đã được áp dụng trong các thử nghiệm lâm
sàng điều trị bệnh hồng cầu hình liềm (SCD) và β thalassemia. SCD là một bệnh di truyền
lặn tự nhiễm của tế bào hồng cầu, xảy ra do đột biến điểm trong chuỗi β globin của
hemoglobin dẫn đến hemoglobin hình liềm (HbS). Trong quá trình khử oxy, sự polymer hóa
của HbS dẫn đến các biến chứng lâm sàng nghiêm trọng như thiếu máu tán huyết. Hai
phương pháp chính để điều trị SCD bằng CRISPR/Cas 9 là sửa chữa trực tiếp gen của
hemoglobin S hoặc tăng cường hemoglobin γ của thai nhi. Tuy nhiên, phương pháp phổ biến
nhất trong thử nghiệm lâm sàng là dựa trên việc tăng cường hemoglobin thai nhi. Trước tiên,
các tế bào tủy xương được lấy từ bệnh nhân và gen điều chỉnh việc ngừng sản xuất
hemoglobin thai nhi, gọi là BCL11A, được vô hiệu hóa bằng CRISPR/Cas 9. Sau đó, các tế
bào đã được chỉnh sửa gen được truyền trở lại vào cơ thể. BCL11A là một gen dài 200 base
pair tìm thấy trên nhiễm sắc thể 2 và sản phẩm của nó chịu trách nhiệm chuyển γ globin
thành chuỗi β globin bằng cách ức chế sự biểu hiện của gen γ globin. Khi gen này bị vô hiệu
7
Ảnh 7 - [7]

8. Kiều Công Trí
hóa bằng CRISPR/Cas 9, sự sản xuất hemoglobin thai nhi chứa γ globin trong các tế bào
hồng cầu sẽ tăng lên, giúp giảm bớt mức độ nghiêm trọng và biểu hiện của SCD.
Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu CRISPR/Cas 9 để điều trị xơ nang. Đột biến di
truyền của gen điều hòa sự dẫn truyền CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator) làm giảm độ ổn định cấu trúc và chức năng của protein CFTR dẫn đến bệnh xơ
nang. Protein CFTR là một protein kênh anion được điều hòa bởi protein kinase A, nằm ở bề
mặt trên của các tế bào biểu mô ở phổi, ruột, tụy và cơ quan sinh dục. Mặc dù chưa có
phương pháp chữa trị xơ nang, các liệu pháp điều trị dựa trên triệu chứng (chẳng hạn như
kháng sinh, thuốc giãn phế quản và thuốc làm loãng chất nhầy) và thuốc điều chỉnh CFTR
đã trở thành các phương pháp điều trị đầu tay giúp giảm triệu chứng và giảm nguy cơ biến
chứng. Hiện nay, các công nghệ chỉnh sửa gene và các mục tiêu phân tử cũng đang được
nghiên cứu. Việc sử dụng công nghệ CRISPR/Cas 9 để chỉnh sửa bộ gen có tiềm năng lớn,
mặc dù vẫn còn ở giai đoạn đầu phát triển. Vào năm 2013, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy tế
bào gốc ruột từ hai bệnh nhân xơ nang và sửa chữa đột biến tại locus CFTR dẫn đến sự biểu
hiện của gen đúng và chức năng đầy đủ của protein. Kể từ đó, tiềm năng của việc ứng dụng
CRISPR/Cas 9 cho bệnh xơ nang đã được xác lập. Thêm vào đó, bệnh cơ Duchenne (DMD),
do đột biến gen dystrophin và đặc trưng bởi yếu cơ, đã được chỉnh sửa thành công bằng
CRISPR/Cas 9 trong các tế bào gốc đa năng của bệnh nhân. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực, liệu
pháp điều trị DMD vẫn chỉ có tính chất hỗ trợ thay vì chữa trị. Hiện nay, một số phương
pháp điều trị (liệu pháp gene, liệu pháp tế bào và bỏ qua exon) đang được nghiên cứu để
khôi phục sự biểu hiện của dystrophin trong cơ của bệnh nhân DMD. Việc xóa bỏ DNA nội
gen và loại bỏ exon lặp lại bằng CRISPR/Cas 9 là những phương pháp mới và đầy hứa hẹn
trong việc sửa chữa gen DMD, phục hồi sự biểu hiện của protein dystrophin. [5]
Hơn nữa, các nghiên cứu gần đây cho thấy hệ thống chỉnh sửa cơ sở đơn CRISPR/Cas và hệ
thống chỉnh sửa prime có thể trực tiếp cài đặt các đột biến trong DNA tế bào mà không cần
mẫu vật liệu người hiến tặng. Các hệ thống chỉnh sửa cơ sở CRISPR/Cas và prime không tạo
ra các đứt gãy đôi (DSB), giúp giảm khả năng tạo ra các biến dị (indels) khác với Cas 9
thông thường. Cho đến nay, hai loại chỉnh sửa cơ sở đã được phát triển: chỉnh sửa cơ sở
cytosine (CBE) và chỉnh sửa cơ sở adenine (ABE). CBE là một loại chỉnh sửa cơ sở kết hợp
deaminase cytidine với Cas 9 bị thiếu hoạt tính xúc tác (dCas 9). Đây là một trong những
chiến lược liệu pháp gene mới có thể tạo ra sự thay đổi chính xác từ cytidine (C) thành
thymidine (T). Tuy nhiên, phạm vi mục tiêu của CBE vẫn bị hạn chế bởi các chuỗi PAM
chứa các base G, T hoặc A. Gần đây, một công cụ chỉnh sửa cơ sở tiên tiến hơn với độ chính
xác và hiệu quả cao hơn, gọi là nNme2 CBE (phát hiện từ Neisseria meningitides) với khả
năng tương thích PAM mở rộng cho dinucleotide cytidine đã được phát triển trên cả tế bào
người và phôi thỏ. ABE sử dụng deaminase adenosine liên kết với dCas 9 để sửa chữa sự
thay đổi cặp base từ adenosine (A) thành guanosine (G). Nhìn chung, việc chỉnh sửa cơ sở
đơn thông qua sự kết hợp dCas 9 với deaminase cytidine hoặc adenosine là một phương
pháp an toàn và hiệu quả để chỉnh sửa các đột biến điểm. Tuy nhiên, cả hai loại chỉnh sửa cơ
sở chỉ có thể sửa chữa bốn loại đột biến chuyển tiếp (purine to purine hoặc pyrimidine to
pyrimidine). Để khắc phục hạn chế này, thành viên mới nhất trong bộ công cụ chỉnh sửa
8

9. Kiều Công Trí
genome CRISPR, gọi là Prime Editor (PE), đã được phát triển để mở rộng phạm vi chỉnh
sửa DNA vượt ra ngoài bốn loại đột biến chuyển tiếp. PE bao gồm Cas 9 nickase kết hợp với
reverse transcriptase đã được kỹ thuật hóa và RNA hướng dẫn chỉnh sửa primer đa chức
năng (pegRNA). pegRNA nhận diện chuỗi nucleotide mục tiêu; Cas 9 nickase cắt chuỗi
không bổ sung của DNA ba base upstream từ vị trí PAM, lộ ra một nicks 3 OH của DNA bộ
ʹ
gen. Sau đó, reverse transcriptase sẽ kéo dài nick 3 bằng cách sao chép chuỗi sửa chữa từ
ʹ
pegRNA. Do đó, PE không chỉ sửa chữa tất cả 12 loại chuyển tiếp base, các đột biến chuyển
vị mà còn các đột biến nhỏ chèn thêm hoặc mất đi trong các rối loạn di truyền. [5]
5.2. Vai trò điều trị của CRISPR/Cas 9
Liệu pháp CRISPR đầu tiên trong thử nghiệm trên người được thực hiện để điều trị bệnh nhân ung
thư phổi không phản ứng với điều trị. Các nhà nghiên cứu đã lấy tế bào T từ máu của ba
bệnh nhân và kỹ thuật hóa chúng trong phòng thí nghiệm qua CRISPR/Cas 9 để xóa các gen
(TRAC, TRBC và PD1) gây cản trở khả năng chống lại tế bào ung thư. Sau đó, các tế bào T
đã được chỉnh sửa gen được truyền trở lại vào cơ thể bệnh nhân. Các tế bào T đã được chỉnh
sửa có thể nhắm mục tiêu vào các kháng nguyên đặc hiệu và tiêu diệt tế bào ung thư. Cuối
cùng, không có tác dụng phụ nào được quan sát và các tế bào T đã được kỹ thuật hóa có thể
được phát hiện lên đến 9 tháng sau khi truyền. Công nghệ chỉnh sửa gene CRISPR/Cas 9
cũng có thể được sử dụng để điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật gây ra. Một lĩnh
vực nghiên cứu nổi bật là điều trị HIV, virus gây ra AIDS. Vào tháng 5 năm 2017, một
nhóm các nhà nghiên cứu từ Đại học Temple đã chứng minh rằng sự sao chép HIV 1 có thể
được ngừng hoàn toàn và virus bị loại bỏ khỏi các tế bào nhiễm bệnh thông qua việc cắt bỏ
genome HIV 1 bằng CRISPR/Cas 9 trên mô hình động vật. Ngoài phương pháp nhắm mục
tiêu vào genome HIV, công nghệ CRISPR/Cas 9 cũng có thể được sử dụng để ngăn chặn
HIV xâm nhập vào tế bào chủ bằng cách chỉnh sửa gen CCR5 (chemokine co-receptor type
5) trong các tế bào chủ. Ví dụ, một thử nghiệm in vitro được thực hiện ở Trung Quốc cho
thấy chỉnh sửa genome CCR5 bằng CRISPR/Cas 9 không có dấu hiệu độc hại (nhiễm trùng)
đối với tế bào và các nhà nghiên cứu kết luận rằng các tế bào đã chỉnh sửa có thể được bảo
vệ hiệu quả khỏi nhiễm HIV hơn các tế bào chưa được chỉnh sửa. [5]
6. Ưu điểm và thách thức của CRISPR/Cas 9
6.1. Ưu điểm
Có thể nói, lợi thế quan trọng nhất của CRISPR/Cas 9 so với các công nghệ chỉnh sửa gen
khác là sự đơn giản và hiệu quả của nó.
Vì CRISPR/Cas 9 có thể được áp dụng trực tiếp trên phôi, nó làm giảm thời gian cần thiết để
thay đổi các gen mục tiêu so với các công nghệ nhắm gen dựa trên việc sử dụng tế bào gốc
phôi (ES). Các công cụ tin sinh học được cải tiến — để xác định các trình tự thích hợp nhất
để thiết kế các RNA hướng dẫn — và tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm đã giúp tạo ra các
quy trình rất mạnh mẽ, đảm bảo việc giới thiệu thành công đột biến mong muốn. (6)
9

10. Kiều Công Trí
6.2. Thách thức
Mặc dù công nghệ CRISPR/Cas 9 có tiềm năng lớn trong việc chỉnh sửa gen, nó vẫn gặp
phải một số thách thức cần được giải quyết trong quá trình ứng dụng. Các vấn đề như khả
năng gây miễn dịch, thiếu hệ thống vận chuyển an toàn và hiệu quả đến mục tiêu, hiệu ứng
ngoài mục tiêu, và các vấn đề đạo đức đã là những rào cản chính để mở rộng công nghệ này
trong các ứng dụng lâm sàng. Vì các thành phần của hệ thống CRISPR/Cas 9 có nguồn gốc
từ vi khuẩn, hệ miễn dịch của chủ thể có thể tạo ra phản ứng miễn dịch đối với các thành
phần này. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng có cả phản ứng miễn dịch huyết thanh
(kháng thể chống Cas 9) và tế bào (tế bào T chống Cas 9) đối với protein Cas 9 ở người khỏe
mạnh. Do đó, việc phát hiện và giảm thiểu khả năng gây miễn dịch của protein Cas 9 vẫn là
một trong những thách thức quan trọng trong thử nghiệm lâm sàng của hệ thống này.
Việc vận chuyển an toàn và hiệu quả các thành phần vào tế bào là rất quan trọng trong chỉnh
sửa gen CRISPR/Cas 9. Hiện nay, có ba phương pháp vận chuyển phức hợp CRISPR/Cas 9
vào tế bào: vật lý, hóa học và vector virus. Các phương pháp không phải virus (vật lý và hóa
học) thích hợp hơn cho liệu pháp chỉnh sửa gen CRISPR/Cas 9 ngoài cơ thể. Các phương
pháp vật lý để vận chuyển CRISPR/Cas 9 có thể bao gồm điện sinh lý, tiêm vi mô, tiêm thủy
động học, v.v. Điện sinh lý áp dụng một trường điện mạnh lên màng tế bào để tạm thời tăng
độ thẩm thấu của màng, cho phép phức hợp CRISPR/Cas 9 đi vào tế bào chất của tế bào
mục tiêu. Tuy nhiên, hạn chế chính của phương pháp này là nó gây ra cái chết tế bào đáng
kể. Tiêm vi mô bao gồm việc tiêm trực tiếp phức hợp CRISPR/Cas 9 vào tế bào ở cấp độ vi
mô để chỉnh sửa gen nhanh chóng của một tế bào đơn. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có
một số nhược điểm như gây tổn thương tế bào, kỹ thuật phức tạp và chỉ phù hợp với một số
lượng tế bào hạn chế. Tiêm thủy động học là tiêm nhanh một lượng lớn chất lỏng áp suất cao
vào dòng máu của động vật, thường là qua tĩnh mạch đuôi của chuột. Mặc dù phương pháp
này đơn giản, nhanh chóng, hiệu quả và linh hoạt, nhưng nó chưa được sử dụng trong ứng
dụng lâm sàng do các biến chứng có thể xảy ra. Các phương pháp hóa học của việc vận
chuyển CRISPR/Cas 9 bao gồm các hạt nano lipid và polymer. Hạt nano lipid/liposome là
các cấu trúc hình cầu bao gồm màng lipid đôi và được tổng hợp trong dung dịch nước sử
dụng các chất tác dụng dựa trên Lipofectamine. Các liposome mang điện tích dương được
bao bọc với axit nucleic mang điện tích âm giúp thúc đẩy sự hòa hợp của phức hợp qua
màng tế bào vào trong tế bào. Hạt nano polymer, như polyethyleneimine và poly L lysine, là
những chất mang phổ biến nhất của các thành phần CRISPR/Cas 9. Giống như hạt nano
lipid, hạt nano polymer cũng có thể giúp phức hợp vượt qua màng tế bào thông qua quá trình
thực bào.
Vector virus là những chuyên gia tự nhiên trong việc vận chuyển CRISPR/Cas 9 vào cơ thể
sống. Các vector như vector adenovirus (AVs), virus liên kết adenovirus (AAVs), và vector
lentivirus (LVs) hiện đang được sử dụng rộng rãi như là phương pháp vận chuyển do hiệu
quả vận chuyển cao hơn so với phương pháp vật lý và hóa học. Trong số đó, AAVs là các
vector được sử dụng phổ biến nhất do ít gây miễn dịch và không tích hợp vào gen của tế bào
chủ so với các vector virus khác. Tuy nhiên, dung lượng sao chép virus hạn chế và kích
10

11. Kiều Công Trí
thước lớn của protein Cas 9 vẫn là một vấn đề lớn. Một chiến lược để giải quyết vấn đề này
là đóng gói sgRNA và Cas 9 vào các AAV riêng biệt và sau đó đồng chuyển chúng vào tế
bào. Các phương pháp gần đây sử dụng một chủng Cas 9 nhỏ hơn từ Staphylococcus aureus
(SaCas 9) thay vì SpCas 9 được sử dụng phổ biến hơn để cho phép đóng gói sgRNA và Cas
9 trong cùng một AAV. Gần đây, sự phát triển của các túi ngoài tế bào (EVs) để vận chuyển
CRISPR/Cas 9 vào cơ thể sống, nhằm tránh một số hạn chế của các phương pháp virus và
không phải virus, đã cho thấy tiềm năng lớn.
sgRNA được thiết kế có thể không phù hợp với DNA không phải mục tiêu và dẫn đến những
chỉnh sửa gen không mong muốn, gọi là hiệu ứng ngoài mục tiêu. Hiệu quả mục tiêu của
CRISPR/Cas 9 được xác định bởi chuỗi 20 nucleotide của sgRNA và các trình tự PAM nằm
ngay cạnh gen mục tiêu. Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng nếu có hơn ba sự không phù hợp giữa
chuỗi mục tiêu và sgRNA dài 20 nucleotide, sẽ dẫn đến hiệu ứng ngoài mục tiêu. Hiệu ứng
ngoài mục tiêu có thể gây ra những sự kiện có hại như đột biến chuỗi, xóa sổ, tái cấu trúc,
phản ứng miễn dịch, và kích hoạt gen gây ung thư, điều này hạn chế việc ứng dụng hệ thống
chỉnh sửa CRISPR/Cas 9 cho mục đích điều trị. Để giảm thiểu khả năng hiệu ứng ngoài mục
tiêu của CRISPR/Cas 9, một số chiến lược đã được phát triển, chẳng hạn như tối ưu hóa
sgRNA, sửa đổi nuclease Cas 9, sử dụng các biến thể Cas khác, và sử dụng protein chống
CRISPR. Việc chọn và thiết kế một sgRNA thích hợp cho chuỗi DNA mục tiêu là một bước
quan trọng để giảm thiểu hiệu ứng ngoài mục tiêu. Khi thiết kế sgRNA, các chiến lược như
tỷ lệ GC, chiều dài sgRNA, và các sửa đổi hóa học của sgRNA cần được xem xét. Nói
chung, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ GC từ 40% đến 60%, sgRNA ngắn (chiều dài
ngắn của sgRNA), và việc bổ sung 2 O methyl 3 phosphonoacetate vào xương sống ribose
ʹ ʹ
phosphate của sgRNA là những phương pháp ưa thích để tăng hiệu quả chỉnh sửa gen của
CRISPR/Cas 9. Sửa đổi protein Cas 9 để tối ưu hóa độ đặc hiệu của nuclease cũng là một
cách để giảm hiệu ứng ngoài mục tiêu. Ví dụ, đột biến một trong các dư lượng xúc tác của
nuclease Cas 9 (HNH và RuvC) sẽ biến Cas 9 thành một nickase chỉ có thể tạo ra đứt gãy sợi
đơn thay vì cắt blunt. Có báo cáo cho thấy việc sử dụng miền RuvC không hoạt động của
Cas 9 với sgRNA có thể giảm hiệu ứng ngoài mục tiêu từ 100 đến 1500 lần. Hơn nữa,
nuclease Cas 12a (trước đây gọi là Cpf1) là một hệ thống CRISPR/Cas loại V cung cấp hiệu
quả chỉnh sửa gen cao. Không giống như hệ thống CRISPR/Cas 9, CRISPR/Cas 12a có thể
xử lý pre crRNA thành crRNA trưởng thành mà không cần tracrRNA, từ đó giảm kích thước
của các cấu trúc plasmid. Protein Cas 12a nhận diện trình tự PAM giàu T (5 TTTN) thay vì
ʹ
5 NGG và cung cấp độ chính xác cao hơn tại các vị trí gen mục tiêu so với Cas 9. Gần đây,
ʹ
việc sử dụng các protein CRISPR lớp I đa thành phần, chẳng hạn như CRISPR/Cas 3 và
CRISPR/Cas 10, cung cấp hiệu quả chỉnh sửa gen tốt hơn Cas 9. Cas 3 là một
nuclease/helicase phụ thuộc ATP có thể xóa một phần lớn DNA từ vị trí mục tiêu mà không
có hiệu ứng ngoài mục tiêu rõ ràng. Ví dụ, gen DMD đã được sửa chữa bằng hệ thống Cas 3
trong tế bào gốc pluripotent nhân tạo. Protein Cas 10 không yêu cầu trình tự PAM và có thể
nhận diện các trình tự ngay cả khi có đột biến điểm. Các protein chống CRISPR (Acr) là
những protein nhỏ có nguồn gốc từ virus có khả năng ức chế hoạt động của hệ thống
CRISPR/Cas. Đây là một phương pháp mới được phát hiện để giảm hiệu ứng ngoài mục tiêu
11

12. Kiều Công Trí
của CRISPR/Cas 9. Trong các protein Acr, AcrIIA4 đặc hiệu nhắm vào nuclease Cas 9.
AcrIIA4 mô phỏng DNA và liên kết với vị trí của Cas 9, khiến không thể thực hiện cắt tiếp ở
khu vực ngoài vùng mục tiêu. Hơn nữa, chỉnh sửa gen CRISPR/Cas 9 cũng đối mặt với các
thách thức về đạo đức và an toàn trên toàn thế giới. Vì công nghệ này vẫn còn trong giai
đoạn sơ khai và kiến thức về bộ gen còn hạn chế, nhiều nhà khoa học cảnh báo rằng nó vẫn
cần nhiều công sức để tăng độ chính xác và đảm bảo rằng các thay đổi trong một phần của
bộ gen không gây ra hậu quả ngoài dự kiến, đặc biệt trong ứng dụng thử nghiệm trên người.
[5]
7. Những tiến bộ mới nhất của CRISPR/Cas 9
CRISPR 2.0 – Chỉnh sửa gene chính xác hơn:
Phiên bản mới như Prime Editing cho phép chỉnh sửa gene mà không cần cắt đứt
DNA hoàn toàn.
Base Editing giúp thay đổi từng cặp nucleotide mà không gây đứt gãy DNA.
Ứng dụng trong liệu pháp gene:
Đang được thử nghiệm lâm sàng để chữa các bệnh như beta thalassemia, xơ nang,
và HIV.
CRISPR và chẩn đoán bệnh:
Phát triển công cụ chẩn đoán dựa trên CRISPR như SHERLOCK và DETECTR
giúp phát hiện virus nhanh chóng (ví dụ: SARS CoV 2)
8. Vấn đề đạo đức và pháp lý của CRISPR
Chỉnh sửa phôi người:
oVụ việc gây tranh cãi năm 2018 khi nhà khoa học Trung Quốc He Jiankui
chỉnh sửa phôi người để tạo ra cặp bé gái có khả năng kháng HIV.
oPhản ứng từ cộng đồng khoa học và các tổ chức quốc tế.
Quy định pháp lý:
oNhiều quốc gia có luật hạn chế việc chỉnh sửa gene người.
oCác tổ chức như WHO và UNESCO đang cố gắng xây dựng bộ quy tắc toàn
cầu về chỉnh sửa gene.
9. Tương lai của CRISPR/Cas 9
Điều trị bệnh di truyền và ung thư:
12

13. Kiều Công Trí
oCRISPR có tiềm năng chữa khỏi nhiều bệnh mà hiện nay chưa có phương
pháp điều trị.
Tạo ra các sinh vật "thiết kế" (Designer Organisms):
oCó thể tạo ra cây trồng và vật nuôi được chỉnh sửa gene để thích nghi với biến
đổi khí hậu.
Những lo ngại về "gene hacking":
oNguy cơ lạm dụng công nghệ này để tạo ra vũ khí sinh học hoặc con người
hoàn hảo (designer babies).
13