LC MS in Drug Analysis Loralie J Langman Christine L H Snozek

Read Anytime Anywhere Easy Ebook Downloads at ebookmeta.com
LC MS in Drug Analysis Loralie J Langman Christine
L H Snozek
https://ebookmeta.com/product/lc-ms-in-drug-analysis-
loralie-j-langman-christine-l-h-snozek/
OR CLICK HERE
DOWLOAD EBOOK
Visit and Get More Ebook Downloads Instantly at https://ebookmeta.com

METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY™
Series Editor
John M. Walker
School of Life Sciences
University of Hertfordshire
Hat ﬁ eld, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

LC-MS in Drug Analysis
Methods and Protocols
Edited by
Loralie J. Langman and Christine L.H. Snozek
Department of Laboratory Medicine, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Editors
Loralie J. Langman
Department of Laboratory Medicine
Mayo Clinic
Rochester, MN 55905
USA
Christine L.H. Snozek
Department of Laboratory Medicine
Mayo Clinic
Rochester, MN 55905
USA
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)
ISBN 978-1-61779-933-4 ISBN 978-1-61779-934-1 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-61779-934-1
Springer New York Heidelberg Dordrecht London
Library of Congress Control Number: 2012940846
© Springer Science+Business Media, LLC 2012
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed. Exempted from this
legal reservation are brief excerpts in connection with reviews or scholarly analysis or material supplied specifically for
the purpose of being entered and executed on a computer system, for exclusive use by the purchaser of the work.
Duplication of this publication or parts thereof is permitted only under the provisions of the Copyright Law of the
Publisher’s location, in its current version, and permission for use must always be obtained from Springer. Permissions
for use may be obtained through RightsLink at the Copyright Clearance Center. Violations are liable to prosecution
under the respective Copyright Law.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
While the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication, neither
the authors nor the editors nor the publisher can accept any legal responsibility for any errors or omissions that may be
made. The publisher makes no warranty, express or implied, with respect to the material contained herein.
Printed on acid-free paper
Humana Press is a brand of Springer
Springer is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)

v
Preface
This book is intended to provide detailed LC-MS/MS procedures for the analysis of several
compounds of clinical signi ﬁ cance. The  ﬁ rst two chapters provide the reader with an over-
view of mass spectroscopy, its place in clinical practice, its application of MS to TDM and
toxicology, and the merits of LC-MS(/MS) and new sample preparation techniques. The
remaining chapters discuss different approaches to screening for drugs of abuse and for
general unknowns, as well as targeted measurement of speci ﬁ c analytes or classes of analytes
including abused drugs, toxic compounds, and therapeutic agents.
We thank our colleagues who contributed to the content of the book for the many
hours of work that these chapters represent. We hope that you, the reader,  ﬁ nd this book
useful.
Mayo Clinic, MN, USA Loralie J. Langman
Christine L.H. Snozek

vii
Contents
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
1 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry   1
Catherine Hammett-Stabler and Steven W. Cotten
2 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of
Technology for Drug Screening Assays  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Pierre Marquet
3 LC-MS/MS Techniques for High-Volume Screening of Drugs of
Abuse and Target Drug Quantitation in Urine/Blood Matrices. . . . . . . . . . . . 29
Jeff C. Eichhorst, Michele L. Etter, Patricia L. Hall, and Denis C. Lehotay
4 Benzodiazepines and Metabolites from Biological Fluids
by Liquid Chromatography Electrospray Tandem Mass Spectrometry . . . . . . . 43
Cynthia L. Morris-Kukoski, Jason E. Schaff, and Louis J. Reda
5 Opiate Screening and Quantitation in Urine/Blood Matrices
Using LC-MS/MS Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Jeff C. Eichhorst, Michele L. Etter, Patricia L. Hall, and Denis C. Lehotay
6 Synthetic Opioid Analysis by LC-MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
David M. Garby and Lynn A. Cheryk
7 The Determination of Cannabinoids Using Liquid Chromatography
with Mass Spectrometric Detection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Oscar Quintela and Dennis J. Crouch
8 Cocaine and Metabolites by LC-MS/MS  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Christine L.H. Snozek, Matthew W. Bjergum, and Loralie J. Langman
9 Quantitation of Amphetamine-Type Stimulants by LC-MS/MS  . . . . . . . . . . . 105
Robert A. Middleberg and Joseph Homan
10 Detection of Prohibited Substances by Liquid Chromatography
Tandem Mass Spectrometry for Sports Doping Control  . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Brian D. Ahrens, Borislav Starcevic, and Anthony W. Butch
11 LC-MS/MS Screen for Xenobiotics and Metabolites. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
François-Ludovic Sauvage and Pierre Marquet
12 Qualitative Identiﬁcation of Rodenticide Anticoagulants by LC-MS/MS. . . . . 139
Robert A. Middleberg and Joseph Homan
13 Hypoglycemic Agent Screening by LC-MS/MS  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
Eric W. Korman, Loralie J. Langman, and Christine L.H. Snozek
14 LC-MS/MS Method for the Detection of Common Laxatives  . . . . . . . . . . . . 157
Robert A. Middleberg and Joseph Homan

viii Contents
15 Simultaneous Determination of Cyclosporine, Sirolimus, and Tacrolimus
in Whole Blood Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry  . 167
Uttam Garg, Ada Munar, and C. Clinton Frazee III
16 Quantiﬁcation of Tricyclic Antidepressants Using UPLC-MS/MS. . . . . . . . . . 175
Kamisha L. Johnson-Davis, JoEtta M. Juenke, Rebecka Davis,
and Gwendolyn A. McMillin
17 Quantitation of First- and Second-Generation Antipsychotics
by LC-MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Elizabeth R. Kiely and Heather M. Antonides
18 Analysis of Selected Anticonvulsants by High Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Jennifer A. Collins and Gregory C. Janis
19 Therapeutic Drug Monitoring of Tamoxifen Using LC-MS/MS . . . . . . . . . . . 211
Simone M. Tchu, Kara L. Lynch, and Alan H.B. Wu
Index  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

ix
Contributors
BRIAN   D.    A HRENS •    UCLA Olympic Analytical Laboratory, Department of Pathology
& Laboratory Medicine ,  David Geffen School of Medicine at UCLA ,    Los Angeles ,
CA ,  USA
   H
EATHER   M.    A NTONIDES •    Montgomery County Coroner’s Of ﬁ ce ,    Dayton ,  OH ,  USA
   M
ATTHEW   W.    B JERGUM •    Department of Laboratory Medicine ,  Mayo Clinic ,
   Rochester ,  MN ,  USA
   A
NTHONY   W.    B UTCH •    UCLA Olympic Analytical Laboratory, Department of Pathology
& Laboratory Medicine ,  David Geffen School of Medicine at UCLA ,
   Los Angeles ,  CA ,  USA
   L
YNN   A.    C HERYK •    Department of Laboratory Medicine ,  Mayo Medical Laboratories ,
   Andover ,  MA ,  USA
   J
ENNIFER   A.    C OLLINS •    Forensic Laboratory, MEDTOX Laboratories, Inc ,    St. Paul ,
MN ,  USA
   S
TEVEN   W.    C OTTEN •    Department of Pathology and Laboratory Medicine ,
School of Medicine, University of North Carolina at Chapel ,    Chapel Hill ,  NC ,  USA
   D
ENNIS   J.    C ROUCH •    Aegis Sciences Corporation ,    Nashville ,  TN ,  US
   R
EBECKA    DAVIS •    ARUP Laboratories Inc. ,    Salt Lake City ,  UT ,  USA
   J
EFF   C.    E ICHHORST •    Saskatchewan Disease Control Laboratory ,  Saskatchewan Health ,
   Regina ,  SK ,  Canada
   M
ICHELE   L.    E TTER •    Saskatchewan Disease Control Laboratory ,  Saskatchewan Health ,
   Regina ,  SK ,  Canada
   C.   C
LINTON    FRAZEE   III   •    Department of Pathology and Laboratory Medicine,
University of MO kansas City School of Medicine ,  Children’s Mercy Hospitals
and Clinics ,    Kansas City ,  MO ,  USA
   D
AVID   M.    G ARBY •    Department of Laboratory Medicine ,  Mayo Medical Laboratories ,
   Wilmington ,  MA ,  USA
   U
TTAM    GARG •    Department of Pathology and Laboratory Medicine ,  University of MO
Kansas City School of Medicine, Children’s Mercy Hospitals and Clinics ,
   Kansas City ,  MO ,  USA
   P
ATRICIA   L.    H ALL •    Saskatchewan Disease Control Laboratory ,  Saskatchewan Health ,
Regina ,  SK ,  Canada
   C
ATHERINE     HAMMETT-STABLER •    Department of Pathology and Laboratory Medicine ,
School of Medicine, University of North Carolina ,    Chapel Hill ,  NC ,  USA
   J
OSEPH    HOMAN •    NMS Labs ,    Willow Grove ,  PA ,  USA
   G
REGORY   C.    J ANIS •    Forensic Laboratory, MEDTOX Laboratories Inc ,    St. Paul ,  MN ,  USA
   K
AMISHA   L.    JOHNSON-DAVIS •    ARUP Laboratories Inc., Department of Pathology ,
University of Utah School of Medicine ,    Salt Lake City ,  UT ,  USA
   J
OETTA   M.    J UENKE •    ARUP Laboratories Inc. ,    Department of Pathology,
University of Utah School of Medicine, Salt Lake City ,  UT ,  USA
   E
LIZABETH   R.    K IELY •    Montgomery County Coroner’s Of ﬁ ce ,    Dayton ,  OH ,  USA
   E
RIC   W.    K ORMAN •    Department of Laboratory Medicine, & Pathology ,  Mayo Clinic ,
   Rochester ,  MN ,  USA

x Contributors
   LORALIE   J.    LANGMAN •    Department of Laboratory Medicine ,  Mayo Clinic ,
   Rochester ,  MN ,  USA
   D
ENIS   C.    L EHOTAY •    Saskatchewan Disease Control Laboratory ,  Saskatchewan Health ,
   Regina ,  SK ,  Canada
   K
ARA   L.    L YNCH •    Department of Laboratory Medicine ,  University of California ,
   San Francisco ,  CA ,  USA
   P
IERRE    MARQUET •    Department of Pharmacology-Toxicology-Pharmacovigilance ,
Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Limoges ,    Limoges ,  France
   G
WENDOLYN   A.    M CMILLIN •    ARUP Laboratories Inc., Department of Pathology ,
University of Utah School of Medicine ,    Salt Lake City ,  UT ,  USA
   R
OBERT   A.    M IDDLEBERG •    NMS Labs ,    Willow Grove ,  PA ,  USA
   C
YNTHIA   L.    M ORRIS-KUKOSKI •    Chemistry Unit ,  FBI Laboratory ,    Quantico ,  VA ,  USA
   A
DA    MUNAR •    Department of Pathology and Laboratory Medicine ,  University of MO
Kansas City School of Medicine, Children’s Mercy Hospitals and Clinics ,
   Kansas City ,  MO ,  USA
   O
SCAR    QUINTELA •    Instituto Nacional de Toxicología ,  Las Rozas de Madrid ,
   Madrid ,  Spain
   L
OUIS   J.    R EDA •    Chemistry Unit ,  FBI Laboratory ,    Quantico ,  VA ,  USA
   F
RANÇOIS-LUDOVIC    SAUVAGE •    Department of Pharmacology-Toxicology-Pharmacovigilance ,
Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Limoges ,    Limoges ,  France
   J
ASON   E.    S CHAFF •    Chemistry Unit ,  FBI Laboratory ,    Quantico ,  VA ,  USA
   C
HRISTINE   L.   H.    S NOZEK •    Department of Laboratory Medicine ,  Mayo Clinic ,
   Rochester ,  MN ,  USA
   B
ORISLAV    STARCEVIC •    UCLA Olympic Analytical Laboratory, Department of Pathology
& Laboratory Medicine ,  David Geffen School of Medicine at UCLA ,
   Los Angeles ,  CA ,  USA
   S
IMONE   M.    T CHU •    Pharmaceutical Sciences and Pharmacogenomics Program ,
University of California San Francisco ,    San Francisco ,  CA ,  USA
   A
LAN   H.   B.    W U •    Department of Laboratory Medicine ,  University of California ,
   San Francisco ,  CA ,  USA

1
Loralie J. Langman and Christine L.H. Snozek (eds.), LC-MS in Drug Analysis: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 902, DOI 10.1007/978-1-61779-934-1_1, © Springer Science+Business Media, LLC 2012
Chapter 1
An Introduction to Drug Testing: The Expanding
Role of Mass Spectrometry
Catherine Hammett-Stabler and Steven W. Cotten
Abstract
Measurement of drugs and their metabolites in biological ﬂ uids is the foundation of both therapeutic drug
monitoring (TDM) and toxicology. Though different in their application, each discipline depends upon
accurate identi ﬁ cation and quanti ﬁ cation if the measurements are to be useful. Thousands of methods are
described for drug analysis but until recently most have relied upon analytical tools, such as spectropho-
tometry and immunoassay, that suffer from lack of speci ﬁ city and sensitivity. The introduction of methods
based on mass spectrometry (MS), coupled to gas or liquid chromatography, has revolutionized these
areas. The methods are proving to be robust, versatile, and economical. This chapter introduces the reader
to the application of MS to TDM and toxicology, the steps that should be considered during implementa-
tion, and the processes that should be implemented to assure continued quality.
Key words: Mass spectrometry , Gas chromatography , Liquid chromatography , Therapeutic drug
monitoring , Toxicology , Drug testing

Measurement of drugs and their metabolites in biological ﬂ uids is
the foundation of both therapeutic drug monitoring (TDM) and
toxicology. Though different in their application, each of these
disciplines depends upon accurate identi ﬁ cation and quanti ﬁ cation
if drug measurements are to be useful. Thousands of methods are
described for drug analysis but until recently most have relied upon
analytical tools that suffer from lack of speci ﬁ city and sensitivity,
namely, spectrophotometry and immunoassay. It must be acknowl-
edged that the methods utilizing each of these allowed TDM and
toxicology to grow and mature but a new era is dawning as mass
spectrometry promises to take the analysis of drugs and drug
metabolites into new directions.
1. Introduction

2 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
In recent years mass spectrometry coupled with liquid (LC-
MS(/MS)) or gas (GC-MS) chromatography has emerged as a
powerful tool for clinical and toxicology laboratories. Improvements
in user interfaces, computing power, and column characteristics
have expanded the potential of mass spectrometry-based systems
from rigid and cumbersome techniques to limitless, adaptable,
open-source platforms capable of identifying numerous analytes in a
single sample. The sensitivity and accuracy achievable have naturally
found applications in the areas of TDM and toxicological analysis
and beyond (Fig. 1 ). Evidence of the transition to the clinical setting
is seen not only by the number of publications but also in the devel-
opment of quality management guidelines and standards ( 1, 2 ) .
This volume provides the reader with a number of applications
to both disciplines which are introduced in the following pages.
This chapter also discusses some of the issues one should consider
when migrating to mass spectrometry-based methods.

TDM is an integral part of personalized medicine. By providing
accurate quanti ﬁ cation of drug concentrations in the circulation
using blood, serum, or plasma, TDM is used to maximize the effect
of certain prescribed drugs by achieving a therapeutic concentra-
tion as quickly as possible while simultaneously minimizing
unwanted or toxic side effects. The drugs typically monitored are
those with narrow therapeutic indices and for which there are
established relationships between the concentration found within
the circulation and the observed effects of the drug. For these
drugs, the delicate balance between ef ﬁ cacy (ED
50
) and toxicity
2. Therapeutic
Drug Monitoring
Fig. 1. Current applications of mass spectrometry in the clinical laboratory.

31 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
(LD
50
) dictates the need for accurate quanti ﬁ cation. TDM also
provides a means of assessing compliance, ensuring correct dosing,
and identifying drug–drug interactions. Ironically TDM initially
developed in parallel with the introduction of chromatography-
based methods into the clinical laboratory in the early 1970s.
Unfortunately, the methods were time consuming and so were,
in the 1980s, replaced with immunoassay-based methods which
remain in use in many laboratories today. While these methods
offer advantages of ease of use and availability on many analytical
platforms, they suffer from issues of sensitivity and speci ﬁ city.
Positive and negative interferences are well documented and if not
recognized can lead to inappropriate patient care. In addition,
these methods usually cross-react with structurally related metabolites
which may or may not contribute to the pharmacological activity
of the parent drug. Other compounds which also share structural
features with the drug being measured are also likely to cross-react
with the antibody and so the presence of such compounds also
poses problems. Finally, the limit of detection of many immunoas-
says is insuf ﬁ cient for current TDM applications. For example, the
therapeutic targets for digoxin and tacrolimus are much lower than
they were just a few years ago as recognition of toxicity has improved
and protocols have changed. Clinical laboratories have thus
replaced many of the TDM analyses using immunoassay with
methods using LC-MS/MS ( 3– 12 ) .
Monitoring of immunosuppressant therapy for solid organ
transplant patients using LC-MS/MS was perhaps one of the ﬁ rst
areas in which the technique took hold. Subtherapeutic doses can
result in transplant rejection while overdosing can cause serious
toxicity or death. It is therefore imperative to closely monitor indi-
vidual patient drug levels for proper treatment. Methodologies are
now migrating from measurement of individual compounds sepa-
rately to simultaneous quanti ﬁ cation of immunosuppressant drugs
from one whole blood sample using a single LC-MS/MS run
( 13– 15 ) . Whole blood samples are lysed and precipitated (either
of ﬂ ine or online) followed by mass analysis with internal standards.
Koster et al. compared LC-MS/MS with immunoassays for four
immunosuppressants and reported that cyclosporine A and everoli-
mus concentrations were 17 and 30% lower, respectively, compared
to immunoassay ( 14 ) , with the difference being attributed to the
continued issue of cross-reactivity of immunoassay antibodies with
cyclosporine and everolimus metabolites. Current research is focus-
ing on the use of dried blood spot samples instead of whole blood
for analysis ( 16– 21 ) . This approach provides a facile method to
evaluate pharmacokinetics for individual patients through area
under the curve (AUC) studies compared with the cumbersome
collection of multiple venous blood samples.
Multicomponent antiviral therapy, particularly for HIV, needs
careful monitoring to limit the development of viral resistance and

4 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
minimize toxicity. Highly active antiviral therapy (HAART) uses a
cocktail of nucleoside reverse transcriptase inhibitors, non-
nucleoside reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors,
entry inhibitors, and integrase inhibitors. Variation in metabolism
between patients can be monitored through LC-MS/MS to main-
tain ef ﬁ cacy of the therapy. Most published methods simultaneously
measure multiple compounds within a single plasma sample ( 22– 27 ) .
In addition to plasma samples, LC-MS/MS analysis can be applied
to alternate samples such as spinal ﬂ uid, breast milk, and semen
when necessary for monitoring the antiviral therapies ( 28– 31 ) .
The narrow therapeutic window of digoxin makes it an ideal
candidate for measurement using mass spectrometry ( 31– 36 ) .
Furthermore, use of the technique overcomes the well-documented
speci ﬁ city and sensitivity issues of digoxin immunoassays. Mass
spectrometry-based methods eliminate the cross-reactivity of
digoxin-like interfering substance (DLIS) and also the issues with
the digoxin overdose antidote, DigiBind. As noted previously, a
lower therapeutic range is now recommended as increased toxicity
and complications were noted ( 37, 38 ) . Biological matrices include
whole blood, serum, and plasma.
The aforementioned drugs or classes represent but a few of
those for which LC-MS/MS methods have been described.
Methods for antiepileptics, antidepressants, antimicrobials, and
chemotherapeutic agents are readily found, with some being the
only methods described. Clearly another advantage in the adop-
tion of MS techniques is the ability to develop assays in-house
rather than having to wait for immunoassay manufacturers.

Originally the “study of poisons,” toxicology has evolved into a
broader, highly diverse ﬁ eld. Today we recognize that poisons are
readily found in the home, work, and environment, can be man-
made or naturally occurring, and may be therapeutic in other
circumstances. Unfortunately, toxicity may not become apparent
until after the offending agent is metabolized or even cleared by
the body. This poses an interesting challenge. As with TDM, the
use of mass spectrometry-based methods has extended the testing
range and may, in the near future, facilitate discovery long after a
toxin is gone. Still in the early stages and not quite ready for clinical
or forensic application, proteomic and metabolomic pro ﬁ ling using
mass spectrometry have revealed patterns that one day will likely be
used to identify toxins months or years after an exposure.
In the clinical setting, broad screens seeking offending agents
were largely abandoned in the 1990s, again primarily due to the
lengthy times required to complete the analyses and the change in
3. Toxicology

51 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
focus to drugs of abuse. Broad screens are not high-volume tests,
but there are clinical situations in which such a test is useful in
excluding a toxin as a cause of the patient’s symptoms. The fact
that in these cases the toxic compound is unknown has created the
need for recognition of signature product ion spectra that, when
compared to an established library of relevant compounds, allows
for unambiguous analyte identi ﬁ cation. This systematic toxicological
analysis (STA) or multi-analyte searching creates unique challenges
for both clinical and forensic laboratories. Reference libraries of
chemical spectra must be generated in-house or purchased. Screens
encompassing >700 common abused, prescription, and over-the-
counter medications using LC-MS/MS have now been described
( 6, 39– 41 ) . In contrast to the methods used in TDM in which
speci ﬁ c drugs are quanti ﬁ ed through the use of calibrations, these
broad screening methods generally cannot be used to quantify
exact concentrations of drugs that are present and are used for
identi ﬁ cation purposes when the compounds are present above a
de ﬁ ned reportable limit of detection (LOD).
For many years, GC-MS has been considered the gold standard
for con ﬁ rmation of the presence of abused drugs in urine, particu-
larly those sought in workplace and athletic drug testing. As meth-
ods and libraries have developed, many laboratories have turned to
LC-MS/MS for these analyses. In the instance of pain management,
con ﬁ rmatory drug testing using LC-MS/MS allows for detection
of both morphine-based and synthetic opioids. The technique pro-
vides superior sensitivity and speci ﬁ city compared to immunoassays
which are usually targeted to morphine and may thus fail to detect
synthetic opioids such as oxycodone. The use of this technique also
provides an extended analytical measuring range of approximately
10
5
ng/mL that is most useful in this setting ( 42 ) .
The world of athletic drug testing is complicated by the
ever-growing list of prohibited substances that are monitored for
sporting events. Many of the agents elicit toxicological actions and
their measurement becomes part of medical evaluations. The agents
monitored include illicit as well as prescription drugs: Anabolic
androgenic steroids, selective androgen receptor modulators,
peptide hormones, growth factors, β -2 agonists, aromatase inhibi-
tors, selective estrogen receptor modulators, diuretics, stimulants,
narcotics, cannabinoids, alcohol, and glucocorticosteroids ( 43 ) .
Urine is the primary sample of testing but blood is used for hor-
mones and growth factors.
In the forensic arena identi ﬁ cation of drugs and their metabo-
lites from samples related to criminal investigations provides
challenges for the laboratory undertaking these analyses. Matrix
effects from less than ideal samples may behave unusually com-
pared to samples collected in the clinical setting. The myriad of
potential toxins, poisons, and pharmaceuticals that could be present

6 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
in a single sample is daunting. Protocols with streamlined scan
times and focused monitored ions have been optimized to cover
as much chemical space as possible ( 9, 39, 44– 46 ) . Validation of
the selectivity of the method should be tested to ensure proper
identi ﬁ cation. For example, Allen et al. reported a false positive
for tramadol with samples containing venlafaxine during a urine
LC-MS/MS screen for illicit drugs due to a shared transition
ion ( 47 ) .
Recent applications of mass spectrometry in forensics have
been reported in postmortem identi ﬁ cation of fentanyl in six
overdoses cases by Peer et al. using direct injection of urine samples
( 48 ) . Additionally, the designer hallucinogens 2,5-dimethoxy-4-
iodophenethylamine (2C-I) and methylenedioxyamphetamine
(MDA) were identi ﬁ ed using LC-MS/MS in a urine sample from
a patient who suffered a hemorrhagic stroke after presenting with
hypertension, vasoconstriction, and decreased mental status ( 49 ) .

A detailed discussion of LC or GC is beyond the scope of this
book, though some features are discussed in this section. Generally,
these techniques are used to separate the drugs of interest from
other compounds present in the sample. Afterwards the analyte is
introduced into the mass spectrometer which serves as the detec-
tor. Which chromatographic technique is used depends upon the
sample and the volatility and solubility of the target analyte.
Depending upon the biological matrix and target compounds
being analyzed, pre-analytical treatment of the sample is generally
necessary as seen in Fig. 2 . Removal of interfering components
4. Evaluation
of Methods
Fig. 2. Pipeline of steps involved in mass spectrometry analyses.

71 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
such as proteins and lipids improves sensitivity by decreasing the
complexity of the mixture analyzed. Liquid–liquid or solid–liquid
extraction may be necessary prior to introduction on the chroma-
tography system to enrich for target compounds. For compounds
present in low abundance, extraction followed by evaporation of
the solvent to dryness effectively concentrates the sample, improving
sensitivity. For relatively abundant compounds, a simple depro-
teinization step (i.e., the dilute and shoot method) may suf ﬁ ce. In
this, the sample is mixed with an organic compound such as ace-
tonitrile (spiked with the appropriate internal standard), centri-
fuged, and the supernatant injected. These methods work fairly
well for many LC-MS- or LC-MS/MS-based methods.
Internal standards should be added at the beginning of analysis
as both a quality control measure and to facilitate quanti ﬁ cation.
Where possible, it is recommended that analogs labeled with a
stable isotope, e.g., deuterium or
13
C, of the primary analyte of
interest be used as the internal standard. If such is not available, it
is acceptable to use a compound that is structurally related. The
internal standard must undergo all steps of the procedure (extrac-
tion, derivatization, evaporation, etc.) in order to serve the purpose
of identifying problems that could arise during the sample prepara-
tion. Since small amounts of the unlabeled compound may con-
taminate the internal standard, it should be checked by analyzing a
blank sample to which the internal standard is added. If GC is to be
used for separation, compounds with low volatility are derivatized
allowing for separation in the gas phase prior to ionization.
Whether using LC or GC, it is usually necessary to separate the
analytes of interest from each other and from unrelated compounds
by the use of a column. Column chemistry and construction have
improved greatly during the past 10 years, so much so that analyses
that were considered restricted to one separation technique, i.e.,
LC versus GC, are now found using either. In liquid chromatogra-
phy, gradient solvent systems of methanol, water, or acetonitrile
(or mixtures thereof) are frequently used to sequentially elute
compounds based on polarity and af ﬁ nity for the column.
Temperature programming, that is the precise, stepwise increase in
the column temperature, is the equivalent of this in GC. As labora-
torians face increasing work demands, further simpli ﬁ cation of
methods by direct introduction of the sample into the mass spec-
trometer has been explored and continues to gain in popularity.
After separation, the compounds are ionized prior to mass
analysis. The most common techniques for ionization include
chemical ionization (CI), electron impact (EI), electron spray
ionization (ESI), and matrix-assisted laser desorption ionization
(MALDI). Charged compounds are shuttled into the mass analyzer
which, depending upon the method, selects ions based on prede-
termined mass-to-charge ratio ( m / z ) criteria, or scans within
de ﬁ ned m / z ranges. If tandem mass spectrometry (MS/MS) is

8 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
used, the selected ionized compounds are further fragmented,
followed by an additional m / z detection to obtain spectra for both
precursor (formerly known as “parent”) and product (formerly
known as “daughter”) ions. The data are transformed into a recog-
nizable mass spectrum which is subsequently compared to expected
values for the target compounds or internal standards for
quanti ﬁ cation or to a library of chemical spectra to obtain the iden-
tity of the compounds analyzed.

Each laboratory should develop a quality assurance program based
upon its respective regulatory guidelines and needs. Such programs
provide guidance to the analyst regarding method validation and
maintenance with suf ﬁ cient checks to assure that the results
reported are as accurate as possible. Table 1 provides a list of
documents that may be useful in developing a robust quality assur-
ance program.
Method validation should include assessment of the LOD,
limit of quanti ﬁ cation (LOQ), linearity, selectivity, accuracy, preci-
sion, carryover, and matrix effects. For those drugs and analytes
regulated under the Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA)
Amendments of 1988, the laboratory should use the mandatory
precision limits to targeted day-to-day precision necessary for suc-
cessful pro ﬁ ciency testing ( 50 ) . Alternatively, one should consider
the application of the analysis when setting precision and accuracy
goals. If TDM is the application, the actual precision and accuracy
needs may exceed those of CLIA. Digoxin serves as an excellent
example again. Because of its narrow therapeutic index, an assay
must be able to provide the same result within an equally narrow
range on any given day. The CLIA limit for pro ﬁ ciency testing is
5. Quality
Assurance
Table 1
Useful resources and documents for quality assurance programs
CLSI C43-A2 Gas chromatograph-mass spectrometry con ﬁ rmation of drugs
CLSI C50 Mass spectrometry in the clinical laboratory
CLSI EP 05 Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods
CLSI EP 06 Evaluation of the linearity of quantitative measurement methods
CLSI EP09 Method comparison and bias estimation using patient samples
CLSI C24 Assessment of laboratory tests when pro ﬁ ciency testing is not available

91 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
20%, so the acceptable day-to-day precision is <7%. For most other
drugs with TDM application, the CLIA limit is 25%.
Each analytical run should include an adequate number of
quality control samples containing the targeted analytes or drugs
considered representative of those expected. Concentrations
should target decision points and span the analytical measuring
range. For example, a method used for TDM of a drug should
include control samples below, within, and above the therapeutic
range. A method used for con ﬁ rmation of the presence of an
abused drug should include control samples in which the drug is
absent and present near and above the de ﬁ ned cutoff. Blind quality
control samples may be included to assess the non-analytical por-
tions of the entire process. Pro ﬁ ciency testing is also an important
part of quality assurance. Clinical laboratories operating under
CLIA must have control compounds for both quantitative and
qualitative con ﬁ rmatory drug testing and control compounds for
each drug class surveyed in broad-spectrum screening using
GC-MS, and must participate in pro ﬁ ciency testing for each ana-
lyte reported ( 50 ) . In these challenges, the pro ﬁ ciency samples are
tested as ordinary samples. The development of new methods for
various drugs is often ahead of the availability of commercial
sources of such samples. In these cases, it is reasonable for several
laboratories performing the analysis to exchange samples on a regular
basis (at a minimum of twice per year).
A recent review of the state of forensic laboratories in the
United States highlighted the lack of standardization and accredi-
tation in some forensic laboratories ( 51, 52 ) . Some of the outlined
challenges regarding standardization and pro ﬁ ciency related to
analyte identi ﬁ cation will most likely be addressed through the
development and adoption of standards of drugs and drug
metabolites suitable for mass spectrometry. This paradigm shift has
already taken place at the international level with the Scienti ﬁ c
Working Group for the analysis of seized drugs (SWGDRUG), the
International Laboratory Accreditation Program (ILAC), and the
United Nations Of ﬁ ce of Drug and Crime recently publishing
guidelines for drug testing that include mass spectrometry as the
premier analytical method for unambiguous analyte identi ﬁ cation
( 53– 55 ) .

Conventional methods of drug testing using GC-MS or LC-MS(/MS)
will continue to play an increasingly important role in clinical and
forensic laboratories in the future. As new therapies enter the clinic,
methods will be developed that permit accurate quanti ﬁ cation for
TDM applications. For example, methodologies for monitoring
6. Future
Perspectives

10 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
everolimus (Zortress) and lacosamide (Vimpat) were reported
before the drugs received approval by the Food and Drug
Administration. Clinical chemists and forensic toxicologists have
responded to a recent trend in the consumption of research chemi-
cals such as substituted phenylethylamines (2C-B, 2C-E, 2C-I),
the related benzodifurans (2C-B-FLY and Bromo-dragon ﬂ y), and
synthetic cannabinoid ligands such as JWH-018 through the devel-
opment of mass spectrometry screening technologies that can
identify these designer drugs ( 56– 58 ) .
Future clinical applications of mass spectrometry are exploring
global pro ﬁ ling of analytes present in patient samples. Examples of
global-analyte scanning of urine, plasma, serum, and amniotic ﬂ uid
are becoming commonplace in the research settings. Ultra-
performance liquid chromatography coupled with mass spectrom-
etry (UPLC-MS) and high-resolution mass spectrometry (HRMS)
have emerged as promising tools to ﬁ ngerprint metabolomes for
clinical labs. Initial efforts have focused on the development of
reproducible, robust protocols for metabolic pro ﬁ ling of samples,
particularly for urine ( 59– 63 ) . A limited number of studies have
attempted to discriminate between healthy and diseased samples
using metabolic ﬁ ngerprinting ( 64– 66 ) .
As separation techniques continue to improve and hardware
and software platforms advance, the role of mass spectrometry in
the clinical lab will continue to grow. When evaluating a new
mass spectrometry method, the concepts of linearity, sensitivity,
speci ﬁ city, accuracy, and precision should be at the forefront.
Proper validation will ensure the quality of the data generated
using mass spectrometry remains high.
References
1. CLSI (2010) Gas chromatography/mass spec-
trometry con ﬁ rmation of drugs; approved
guideline, CLSI Document C43-A2, 2nd edn.
Clinical and Laboratory Standards Institute,
Wayne, PA
2. CLSI (2007) Mass spectrometry in the clinical
laboratory: General principles and guidance;
approved guideline. CLSI Document C50-A.
Clinical and Laboratory Standards Institute,
Wayne, PA
3. Sauvage FL, Gaulier JM, Lachâtre G, Marquet
P (2006) A fully automated turbulent- ﬂ ow liq-
uid chromatography-tandem mass spectrome-
try technique for monitoring antidepressants in
human serum. Ther Drug Monit 28:123–130
4. Breaud AR, Harlan R, Kozak M, Clarke W
(2009) A rapid and reliable method for the
quantitation of tricyclic antidepressants in
serum using HPLC-MS/MS. Clin Biochem
42:1300–1307
5. Coulter C, Taruc M, Tuyay J, Moore C (2010)
Antidepressant drugs in oral ﬂ uid using liquid
chromatography-tandem mass spectrometry.
J Anal Toxicol 34:64–72
6. Kirchherr H, Kühn-Velten WN (2006)
Quantitative determination of forty-eight anti-
depressants and antipsychotics in human serum
by HPLC tandem mass spectrometry: a multi-
level, single-sample approach. J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 843:100–113
7. Greenaway C, Ratnaraj N, Sander JW, Patsalos
PN (2010) A high-performance liquid chroma-
tography assay to monitor the new antiepileptic
drug lacosamide in patients with epilepsy. Ther
Drug Monit 32:448–452
8. Zhang Y, Mehrotra N, Budha NR, Christensen
ML, Meibohm B (2008) A tandem mass spec-
trometry assay for the simultaneous determina-
tion of acetaminophen, caffeine, phenytoin,
ranitidine, and theophylline in small volume

111 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
pediatric plasma specimens. Clin Chim Acta
398:105–112
9. Sørensen LK (2011) Determination of acidic and
neutral therapeutic drugs in human blood by liq-
uid chromatography-electrospray tandem mass
spectrometry. Forensic Sci Int 206(1–3):119–
126. doi:
10.1016/j.forsciint.2010.07.016
10. Bardin S, Ottinger JC, Breau AP, O’Shea TJ
(2000) Determination of free levels of pheny-
toin in human plasma by liquid chromatogra-
phy/tandem mass spectrometry. J Pharm
Biomed Anal 23:573–579
11. Subramanian M, Birnbaum AK, Remmel RP
(2008) High-speed simultaneous determina-
tion of nine antiepileptic drugs using liquid
chromatography-mass spectrometry. Ther
Drug Monit 30:347–356
12. Baumann P et al (2004) Therapeutic monitor-
ing of psychotropic drugs: an outline of the
AGNP-TDM expert group consensus guide-
line. Ther Drug Monit 26:167–170
13. Salm P, Taylor PJ, Rooney F (2008) A high-
performance liquid chromatography-mass
spectrometry method using a novel atmo-
spheric pressure chemical ionization approach
for the rapid simultaneous measurement of tac-
rolimus and cyclosporin in whole blood. Ther
Drug Monit 30:292–300
14. Koster RA, Dijkers ECF, Uges DRA (2009)
Robust, high-throughput LC-MS/MS method
for therapeutic drug monitoring of cyclosporine,
tacrolimus, everolimus, and sirolimus in whole
blood. Ther Drug Monit 31:116–125
15. Bogusz MJ et al (2007) Simultaneous
LC-MS-MS determination of cyclosporine A,
tacrolimus, and sirolimus in whole blood as
well as mycophenolic acid in plasma using com-
mon pretreatment procedure. J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 850:471–480
16. Wilhelm AJ, den Burger JCG, Vos RM,
Chahbouni A, Sinjewel A (2009) Analysis of
cyclosporin A in dried blood spots using liquid
chromatography tandem mass spectrometry.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life
Sci 877:1595–1598
17. Hoogtanders K et al (2007) Dried blood spot
measurement of tacrolimus is promising for
patient monitoring. Transplantation 83:
237–238
18. Cheung CY et al (2008) Dried blood spot mea-
surement: application in tacrolimus monitoring
using limited sampling strategy and abbrevi-
ated AUC estimation. Transpl Int 21:140–145
19. Edelbroek PM, van der Heijden J, Stolk LML
(2009) Dried blood spot methods in therapeu-
tic drug monitoring: methods, assays, and pit-
falls. Ther Drug Monit 31:327–336
20. van der Heijden J et al (2009) Therapeutic
drug monitoring of everolimus using the dried
blood spot method in combination with liquid
chromatography-mass spectrometry. J Pharm
Biomed Anal 50:664–670
21. Hoogtanders K et al (2007) Therapeutic drug
monitoring of tacrolimus with the dried blood
spot method. J Pharm Biomed Anal
44:658–664
22. Fayet A et al (2009) A LC-tandem MS assay for
the simultaneous measurement of new antiret-
roviral agents: Raltegravir, maraviroc, daruna-
vir, and etravirine. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 877:1057–1069
23. Ruan Q et al (2008) An integrated method for
metabolite detection and identi ﬁ cation using a
linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer
and multiple data processing techniques: appli-
cation to indinavir metabolite detection. J Mass
Spectrom 43:251–261
24. ter Heine R et al (2007) Fast and simultaneous
determination of darunavir and eleven other
antiretroviral drugs for therapeutic drug moni-
toring: method development and validation for
the determination of all currently approved HIV
protease inhibitors and non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitors in human plasma by liq-
uid chromatography coupled with electrospray
ionization tandem mass spectrometry. Rapid
Commun Mass Spectrom 21:2505–2514
25. Le Saux T et al (2008) Quanti ﬁ cation of seven
nucleoside/nucleotide reverse transcriptase
inhibitors in human plasma by high-perfor-
mance liquid chromatography with tandem
mass-spectrometry. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 865:81–90
26. Jung BH, Rezk NL, Bridges AS, Corbett AH,
Kashuba ADM (2007) Simultaneous determi-
nation of 17 antiretroviral drugs in human
plasma for quantitative analysis with liquid
chromatography-tandem mass spectrometry.
Biomed Chromatogr 21:1095–1104
27. Quaranta S et al (2009) Validation of an electro-
spray ionization LC-MS/MS method for quan-
titative analysis of raltegravir, etravirine, and 9
other antiretroviral agents in human plasma
samples. Ther Drug Monit 31:695–702
28. Lorello G et al (2009) Discordance in HIV-1
viral loads and antiretroviral drug concentra-
tions comparing semen and blood plasma. HIV
Med 10:548–554
29. Rezk NL et al (2008) Studies on antiretroviral
drug concentrations in breast milk: validation
of a liquid chromatography-tandem mass spec-
trometric method for the determination of 7
anti-human immunode ﬁ ciency virus medica-
tions. Ther Drug Monit 30:611–619

12 C. Hammett-Stabler and S.W. Cotten
30. Huang Y et al (2008) Sensitive analysis of anti-
HIV drugs, efavirenz, lopinavir and ritonavir,
in human hair by liquid chromatography cou-
pled with tandem mass spectrometry. Rapid
Commun Mass Spectrom 22:3401–3409
31. Yilmaz A et al (2009) Darunavir concentrations
in cerebrospinal ﬂ uid and blood in HIV-1-
infected individuals. AIDS Res Hum
Retroviruses 25:457–461
32. Taylor PJ, Morris RG (2010) Does liquid chro-
matography-tandem mass spectrometry have a
role in therapeutic drug monitoring of digoxin?
Clin Biochem 43:936–937, author reply 938
33. Vlase L, Popa D, Muntean D, Mihu D, Leucuta
S (2009) A new, high-throughput high-perfor-
mance liquid chromatographic/mass spectro-
metric assay for therapeutic level monitoring of
digoxin in human plasma. J AOAC Int
92:1390–1395
34. Oiestad EL, Johansen U, Stokke Opdal M,
Bergan S, Christophersen AS (2009)
Determination of digoxin and digitoxin in
whole blood. J Anal Toxicol 33:372–378
35. Mitamura K et al (2007) Determination of
digoxin in human serum using stable isotope
dilution liquid chromatography/electrospray
ionization-tandem mass spectrometry. Biol
Pharm Bull 30:1653–1656
36. Li S et al (2010) Therapeutic monitoring of
serum digoxin for patients with heart failure
using a rapid LC-MS/MS method. Clin
Biochem 43:307–313
37. Rathore SS, Curtis JP, Wang Y, Bristow MR,
Krumholz HM (2003) Association of serum
digoxin concentration and outcomes in patients
with heart failure. JAMA 289:871–878
38. Bauman JL, Didomerico RS, Galenter WL
(2006) Mechanisms, manifestations, and man-
agement of digoxin toxicity in the modern age.
Am J Cardiovasc Drugs 6:77–86
39. Peters FT (2011) Recent advances of liquid
chromatography-(tandem) mass spectrometry
in clinical and forensic toxicology.Clin Biochem
44(1):54–65. doi:
10.1016/j.clinbiochem.
2010.08.008
40. Viette V et al (2011) A multi-target screening
analysis in human plasma using fast liquid chro-
matography-hybrid tandem mass spectrometry
(Part I). Clin Biochem 44(1):32–44.
doi:
10.1016/j.clinbiochem.2010.07.021
41. Dresen S, Ferreirós N, Gnann H, Zimmermann
R, Weinmann W (2010) Detection and
identi ﬁ cation of 700 drugs by multi-target screen-
ing with a 3200 Q TRAP LC-MS/MS system
and library searching. Anal Bioanal Chem 396:
2425–2434
42. Mikel C, Almazan P, West R, Crews B et al
(2009) LC-MS/MS extends the range of drug
analysis in pain patients. Ther Drug Monit
31:746–748
43. World Anti-Doping Agency (2010) International
standards: prohibited list.
http://www.wada-
ama.org/en/World-Anti-Doping-Program/
Sports-and-Anti-Doping-Organizations/
International-Standards/Prohibited-List/
.
Accessed 17 Nov 2010
44. Maurer HH (2007) Current role of liquid
chromatography–mass spectrometry in clinical
and forensic toxicology. Anal Bioanal Chem
388:1315–1325
45. Beyer J, Drummer OH, Maurer HH (2009)
Analysis of toxic alkaloids in body samples.
Forensic Sci Int 185:1–9
46. Maurer HH (2010) Perspectives of liquid
chromatography coupled to low- and high-
resolution mass spectrometry for screening,
identi ﬁ cation, and quanti ﬁ cation of drugs in
clinical and forensic toxicology. Ther Drug
Monit 32:324–327
47. Allen KR (2006) Interference by venlafaxine
ingestion in the detection of tramadol by liquid
chromatography linked to tandem mass spec-
trometry for the screening of illicit drugs in
human urine. Clin Toxicol (Phila) 44:147–153
48. Peer CJ, Shakleya DM, Younis IR, Kraner JC,
Callery PS (2007) Direct-injection mass spec-
trometric method for the rapid identi ﬁ cation of
fentanyl and norfentanyl in postmortem urine
of six drug-overdose cases. J Anal Toxicol
31:515–521
49. Drees JC, Stone JA, Wu AHB (2009) Morbidity
involving the hallucinogenic designer amines
MDA and 2C-I. J Forensic Sci 54:1485–1487
50. Centers for Medicare & Medicaid Services
(2003) Interpretive guidelines for laboratories.

http://www.cms.gov/CLIA/03_Interpretive_
Guidelines_for_Laboratories.asp . Accessed 17
Nov 2010
51. Committee on Identifying the Needs of the
Forensic Sciences Community, National Research
Council (2009) Strengthening forensic science
in the United States: a path forward. The
National Academies Press, Washington, DC
52. Kaye DH (2010) The good, the bad, the ugly:
the NAS report on strengthening forensic sci-
ence in America. Sci Justice 50:8–11
53. United Nations Of ﬁ ce on Drugs and Crime
(2009) Guidance for the implementation of a
quality management system in drug testing
laboratories.
http://www.unodc.org/docu-
ments/scienti ﬁ c/QMS_Ebook.pdf . Accessed
17 Nov 2010

131 An Introduction to Drug Testing: The Expanding Role of Mass Spectrometry
54. International Laboratory Accreditation
Cooperation (2002) ILAC G19:2002
Guidelines for forensic science laboratories

http://www.ilac.org/documents/g19_2002.
pdf . Accessed 17 Nov 2010
55. United States Department of Justice Drug
Enforcement Administration (2010)
Scienti ﬁ c working group for the analysis of
seized drugs recommendations.
http://
www.swgdrug.org/Documents/
SWGDRUG%20Recommendations.pdf
.
Accessed 17 Nov 2010
56. Sobolevsky T, Prasolov I, Rodchenkov G
(2010) Detection of JWH-018 metabolites in
smoking mixture post-administration urine.
Forensic Sci Int 200:141–147
57. Zaitsu K et al (2009) Simultaneous analysis of six
novel hallucinogenic (tetrahydrobenzodifuranyl)
aminoalkanes (FLYs) and (benzodifuranyl)amin-
oalkanes (DragonFLYs) by GC-MS, LC-MS,
and LC-MS-MS. Forensic Toxicol 28:9–18
58. Katagi M et al (2010) Metabolism and toxico-
logic analysis of tryptamine-derived drugs of
abuse. Ther Drug Monit 32:328–331
59. Gika HG, Macpherson E, Theodoridis GA,
Wilson ID (2008) Evaluation of the repeatabil-
ity of ultra-performance liquid chromatogra-
phy-TOF-MS for global metabolic pro ﬁ ling of
human urine samples. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 871:299–305
60. Want EJ et al (2010) Global metabolic pro ﬁ ling
procedures for urine using UPLC-MS. Nat
Protoc 5:1005–1018
61. Cubbon S, Bradbury T, Wilson J, Thomas-
Oates J (2007) Hydrophilic interaction chro-
matography for mass spectrometric
metabonomic studies of urine. Anal Chem
79:8911–8918
62. Gika HG, Theodoridis GA, Wilson ID (2008)
Liquid chromatography and ultra-performance
liquid chromatography-mass spectrometry
ﬁ ngerprinting of human urine: sample stability
under different handling and storage condi-
tions for metabonomics studies. J Chromatogr
A 1189:314–322
63. Gika HG, Theodoridis GA, Wingate JE, Wilson
ID (2007) Within-day reproducibility of an
HPLC-MS-based method for metabonomic
analysis: application to human urine. J Proteome
Res 6:3291–3303
64. Kind T, Tolstikov V, Fiehn O, Weiss RH (2007)
A comprehensive urinary metabolomic
approach for identifying kidney cancer. Anal
Biochem 363:185–195
65. Guy PA, Tavazzi I, Bruce SJ, Ramadan Z,
Kochhar S (2008) Global metabolic
pro ﬁ ling analysis on human urine by
UPLC-TOFMS: issues and method validation
in nutritional metabolomics. J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 871:
253–260
66. Romero R et al (2010) Metabolomics in pre-
mature labor: a novel approach to identify
patients at risk for preterm delivery. J Matern
Fetal Neonatal Med 23:1344–1359

15
Loralie J. Langman and Christine L.H. Snozek (eds.), LC-MS in Drug Analysis: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 902, DOI 10.1007/978-1-61779-934-1_2, © Springer Science+Business Media, LLC 2012
Chapter 2
LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems,
Advantages of Technology for Drug Screening Assays
Pierre Marquet
Abstract
This chapter reviews recent applications of mass spectrometry to systematic toxicological analysis (STA),
where extended lists of compounds of toxicological interest are screened, as well as to the general unknown
screening (GUS), where all exogenous compounds present in a sample are tentatively detected and identi ﬁ ed,
without any preselection. Many recent improvements in sample preparation, chromatographic separation,
gas chromatography-mass spectrometry, and above all liquid chromatography-mass spectrometry techniques
are described, which are applicable or have been applied to STA and/or GUS, generally with promising
results. These improvements come from miniaturization and automation of solid-phase extraction,
turbulent- ﬂ ow or ultrahigh-pressure liquid chromatography, linear ion traps, accurate (e.g., time of ﬂ ight
or orbital trap) mass spectrometry, as well as software re ﬁ nements to alternate between different ionization
modes or automatically interpret the results. It also shows that robust LC-MS/MS techniques already exist
for STA or GUS, which are at least as ef ﬁ cient as the traditional techniques used in most toxicology labora-
tories, such as GC-MS or high-performance liquid chromatography with diode-array detection, as shown
by three comparative studies. However, the major drawback of LC-MS/MS in the full-scan mode for STA
or GUS is that it still lacks universal reference libraries due to insuf ﬁ cient reproducibility of LC-MS(/MS)
mass spectra obtained with different instrument types.
Key words: Systematic toxicological analysis , General unknown screening , LC-MS , GC-MS , Mass
spectral libraries

The identi ﬁ cation of drugs and toxic compounds, often at low levels,
is an important goal in clinical and forensic toxicology, doping
control analysis, and environmental analysis, where the compounds
involved are often unknown. Gas chromatography-mass spectrometry
(GC-MS), high-performance liquid chromatography with diode-
array detection (HPLC-DAD), and liquid chromatography-mass
spectrometry (LC-MS) are the tools most often used in toxicology
1. Introduction

16 P. Marquet
laboratories for identi ﬁ cation, or con ﬁ rmation of identity, of
xenobiotics and their metabolites.
In all these ﬁ elds, numerous methods have been developed for
the analysis of particular target compounds, classes of compounds
(e.g., therapeutic drugs, drugs of abuse, pesticides, environmental
contaminants, and metabolites thereof), or for a more comprehen-
sive screening of xenobiotics and their metabolites in biological
samples. In fact, the screening and identi ﬁ cation of compounds of
interest before quanti ﬁ cation is part of daily routine work ( 1, 2 ) .
Drug screening is a term that encompasses all the techniques
allowing the detection in one run of a large range of compounds
of pharmacological or toxicological interest in urine, plasma,
serum, whole blood, and other body ﬂ uids, as well as hair or
postmortem tissues or organs ( 3 ) .
Many targeted screening methods involving single-stage mass
spectrometry in the single ion monitoring (SIM) mode or tandem
mass spectrometry in the selected reaction monitoring (SRM)
mode have been developed for virtually all classes of drugs and
toxic compounds. In addition to the selective and, if correctly
applied ( 4 ) , speci ﬁ c detection of the compounds targeted, they
allow for their quanti ﬁ cation.
The general unknown screening (GUS) of drugs and toxic
compounds involves untargeted analytical techniques. Its aim is to
detect as many compounds as possible in a matrix and tentatively
identify them, either by comparison with libraries of mass spectra
or by direct interpretation of an individual spectrum. Systematic
toxicological analysis (STA) occupies an intermediate position
between targeted and untargeted analysis. A limited (although
sometimes very large) list of target compounds is screened for and,
for those tentatively detected, rich and/or accurate mass spectral
information is obtained, ensuring their speci ﬁ c identi ﬁ cation.
This chapter focuses on recent STA and GUS procedures
involving mass spectrometry and discusses the respective merits of
GC-MS, LC-MS(/MS), and new sample preparation techniques.

GC-MS has been the technique most employed for the GUS of
compounds of toxicological relevance for the last three decades,
owing to its universal fragmentation conditions and to the avail-
ability of huge mass spectral databases. In addition to being at the
forefront of the development of GC-MS in clinical toxicology, in
particular regarding GUS, the group of Maurer recently tested the
freeware deconvolution software AMDIS (Automated Mass
Spectral Deconvolution and Identi ﬁ cation System) with their
GC-MS GUS technique in urine ( 5 ) . For this, after optimization of
the AMDIS deconvolution and identi ﬁ cation settings, they
2. GC-MS for STA
and GUS: Recent
Improvements

172 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
compared the results obtained from 111 urine samples by manual
and AMDIS data interpretation. They concluded that AMDIS
gave results comparable or even superior to manual evaluation by
an experienced toxicologist, but that it could only identify targets
present in the user-de ﬁ ned MS library. As AMDIS-readable libraries
have to be generated by users by converting commercial or personal
libraries, this may narrow the range of toxicologically relevant com-
pounds identi ﬁ ed and is a current limitation of this promising tool.
Steiner and Larson ( 6 ) employed Direct Analysis in Real Time
(DART), a new atmospheric pressure ionization technique that
can be used for the analysis of solids, liquids, and gases with little
or no sample preparation, merely by placing the test material into
a heated gas ﬂ owing through the sampling area. Ionization in the
positive mode is obtained by charging a heated helium gas stream,
which subsequently reacts with the molecules on the surface of the
sample to induce ionization. In this study, DART was coupled with
a time-of- ﬂ ight (TOF) MS analyzer operating at different collision-
induced dissociation (CID) voltages, without prior chromato-
graphic separation. This technique was able to detect many more
compounds than GC-MS in 553 forensic case specimens; however,
the authors emphasized that data obtained need to be examined
very carefully as the spectra produced from multicomponent
mixtures can become extremely dif ﬁ cult to interpret, interferences
can result in falsely positive results, and differences in in-source
CID spectra can arise for mixtures of compounds with widely
varying proton af ﬁ nities.

Over the last 15 years or so, methods based on the use of HPLC
coupled with single-stage or tandem MS detection have been
reported for GUS and STA, fostered ﬁ rst by the necessity of detect-
ing compounds not amenable to GC (i.e., highly polar, high-
molecular-weight, or thermally labile compounds). It rapidly
turned out that this coupling could detect a very large range of
xenobiotics.
For single-stage MS, in-source CID at different energies was used
to generate fragments and obtain rich enough spectra to be
searched against libraries of spectra generated by the injection of
reference materials in the same conditions. These methods,
reviewed in detail elsewhere ( 7– 9 ) , have now been superseded by
newer approaches.
Many LC-MS/MS methods have been published for the targeted
analysis of a wide variety of drugs, mainly using SRM on triple
quadrupole instruments. For instance, Gergov et al. ( 10 ) developed
3. Recent LC-MS
(/MS) Techniques
for STA and GUS
3.1. Single-Stage
Quadrupole Mass
Spectrometry
3.2. Tandem
Quadrupole Mass
Spectrometry

18 P. Marquet
a method for the screening of 238 drugs in blood using one SRM
transition per compound and a compound-dependent collision
energy (20, 35, or 50 eV), for a total cycle time of 6 s. However,
the use of only one, or even two, SRM transition per compound is
generally insuf ﬁ cient, yielding a signi ﬁ cant number of false-positive
ﬁ ndings ( 4 ) . It should be kept in mind that MS in the SIM or SRM
modes can never reach the identi ﬁ cation power of a full mass
spectrum ( 1 ) .
Improvement with respect to these SRM methods was rendered
possible by the availability of data-dependent acquisition or infor-
mation-dependent acquisition (IDA), by which a tandem mass
spectrometer can automatically switch from a “survey” mode to a
“dependent” (or con ﬁ rmation), full-spectrum MS/MS mode. In
addition, the introduction of linear ion-trap-triple quadrupole
(LIT-QqQ) hybrid instruments further extended the possibilities
of LC-MS/MS in STA or GUS. In this instrument, the second
mass analyzer can be used as either a conventional quadrupole mass
analyzer or a linear ion trap, which by accumulation of ions provides
enhanced full-spectrum sensitivity compared to a conventional
quadrupole. The group of Weinmann used targeted SRM with up
to 700 transitions as the survey detection mode, and the “enhanced”
product ion (EPI) spectrum mode as the dependent mode ( 11 ) .
Whereas this procedure seems to be a more speci ﬁ c approach to
STA as it allows searching rich spectra against those entered in
libraries, the use of SRM as the survey mode cannot answer the
more general clinical question as to whether an individual has been
intoxicated at all, rather than intoxicated with a compound from a
prede ﬁ ned list ( 12 ) . Also, the use of only the positive-ion mode
narrows the detection window.
Alternatively, the single-quadrupole, enhanced full-spectrum
(EMS) mode has been used as the survey detection mode, with
alternated polarities ( 13, 14 ) . The major three ions in each Q3 MS
were selected in the next three acquisitions and fragmented in the
collision cell at three collision energies for each one, taking advan-
tage of the accumulation capacity of the linear trap. Separate libraries
were generated for the positive-ion and negative-ion modes by
injecting pure solutions of drugs and toxic compounds, as well as by
entering the MS/MS spectra of metabolites found in human
samples, or even speci ﬁ cally produced by means of in vitro metabolic
experiments ( 13 ) . More than 1,000 MS/MS spectra in the positive
mode and 250 in the negative mode were entered in the respective
libraries, together with compound name, developed chemical
structure, CAS number, retention time, relative retention time, and
ultraviolet spectrum. A program was developed to automatically
report the results of peak ﬁ nding and library searching. Compounds
not found by other screening or target techniques could be identi ﬁ ed
unambiguously by this LC-LIT-QqQ GUS technique in clinical
toxicology cases ( 15 ) . This technique is described in Chapter 11 .

192 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
Libraries of mass spectra obtained through CID in the collision
cell of triple quadrupole instruments have been developed for STA
( 16 ) or GUS ( 15 ) . The robustness of CID mass spectra between
instruments from the same or from different manufacturers, and
thus the interchangeability of these libraries, has been investigated
by different groups ( 17– 22 ) . These studies generally showed that
the CID spectra were robust across laboratories equipped with the
same instruments, or with instruments of the same brand, but that
the relative intensity, and sometimes the nature of the fragments,
differed across different instrument brands. However, in a recent
study, product-ion spectra were generated at ten different collision
energy values using a quadrupole-time-of- ﬂ ight (Q-TOF) tandem
mass spectrometer, ﬁ ltered and entered in an MS/MS library. This
library was further used to search unknown spectra generated on
Q-TOF, QqQ, hybrid LIT-QqQ, and linear ion-trap-FTICR
(Fourier transform ion cyclotron resonance) instruments in three
different laboratories. By means of a sophisticated matching
algorithm, the correct compound was retrieved as the best hit in
98.1% of cases and as the second best in the remaining 1.9% of
cases ( 22 ) .
Although also possible, the interpretation of unreferenced
MS/MS spectra is a challenge because of the limited understand-
ing of the fragmentation and rearrangement reactions involved and
the limited number of fragments sometimes observed. As is seen
below, even accurate-mass determination using high-resolution
TOF or orbitrap mass spectrometers may not be suf ﬁ cient to
successfully identify unknowns.
Mass spectral libraries dedicated to ion-trap instruments, whether
three-dimensional or two-dimensional (i.e., quadrupole ion
traps), have also been set up ( 23, 24 ) , taking advantage of the
easier-to-optimize CID conditions in ion traps due to the possi-
bility of normalizing collision energies, and the more reproduc-
ible spectra obtained. Dulaurent et al. developed a GUS
procedure for 320 pesticides and metabolites in blood using a
linear ion-trap instrument in the positive and negative ions, MS
2

and then MS
3
modes ( 24 ) . They generated MS
2
and MS
3
librar-
ies of 450 and 430 spectra, respectively. Library searching was
performed on MS
2
spectra and retention time, and positive
results con ﬁ rmed by manually checking the corresponding MS
3

spectrum. The limitations of this technique were that not all pes-
ticides investigated could be detected and that the cycle time was
quite long when continuously switching from the positive to the
negative ionization modes. The authors admitted that, if neces-
sary, it was possible to decrease the detection limits of some
compounds by 10–100-fold by scanning MS
2
in only one polar-
ity, owing to a shorter total scan time.
3.3. Single-Stage
Linear Ion-Trap
Instruments

20 P. Marquet
Liquid chromatography coupled to high-resolution TOFMS
instruments, enabling accurate-mass determination, has also been
employed for STA or GUS ( 25, 26 ) . Identi ﬁ cation has been based
on the accurate mass, isotopic pattern, and retention time ( 27– 29 )
of sample components, from which the atomic formula is calculated
and searched against a database of relevant compounds, preferably
using dedicated software ( 27 ) . Alternatively, forward searching of
compounds of toxicological interest in the full-scan TOFMS data
was proposed by Ojanpera’s group. This approach has been largely
applied in the last couple of years in anti-doping laboratories ( 30– 32 ) .
For instance, a generic LC-TOFMS method was developed and vali-
dated for 241 substances prohibited by the World Anti-Doping
Agency, belonging to various categories ( 31 ) . Positive identi ﬁ cation
was based on retention time and accurate mass, as compared to ref-
erence materials or compounds contained in urine samples from
excretion studies. Limit of detection, extraction recovery, matrix
effect, and repeatability were checked and the method successfully
applied to the retrospective screening of a single designer drug,
4-methyl-2-hexanamine, in stored doping control samples.
When reference standards are not available, structures and thus
elemental formulae of compounds of toxicological interest and their
known or putative metabolites may be taken from the literature or
inferred from expected metabolic pathways ( 33 ) and added to the
database. However, as there are generally several compounds with
the same elemental formula and molecular mass, and as their metab-
olites may also have the same masses, con ﬁ rmation procedures may
be necessary ( 1 ) . Polettini et al. actually showed that no compound
could be unambiguously identi ﬁ ed in postmortem samples when
searched against a library of 55,000 compounds of toxicological
relevance ( 34 ) . Lee et al. tried to overcome this limitation by
using in-source CID to obtain more structural information and by
building a mass spectral library using this approach ( 29 ) . Alternatively
to library searching, Pelander et al. relied on the prediction of
fragmentation patterns using dedicated software ( 33 ) . However,
more application data will be necessary to demonstrate the reliabil-
ity of compound identi ﬁ cation without reference standards ( 2 ) .
A next step in the development of LC-MS approaches in STA
or GUS has been the use of two-stage, Q-TOFMS instruments
able to generate accurate mass data of the parent as well as fragment
ions directly attributable to the parent ( 21 ) .
Only a few applications of orbital-trap (orbitrap) high-resolu-
tion mass spectrometers have been reported for STA or GUS so far.
For the detection of 29 doping agents, an LTQ-orbitrap mass
spectrometer equipped with an APCI ion source was used with in-
source CID and acquisition in the positive ionization scan mode
from 100 to 500 Da ( 35 ) . The mass resolution of 60,000 full width
at half maximum (FWHM) ensured a precision better than 2 ppm
(using external calibration), while the limit of detection was better
3.4. High-Resolution
Mass Spectrometry

212 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
than 100 pg/mL for all compounds. The possible fragmentation
pathways of each agent were inferred from the fragments gener-
ated, using proprietor software. Despite the high selectivity of this
technique, the authors admitted that some of the analytes were
isomeric and had to be separated chromatographically. Using a
different version of orbitrap, with no linear ion-trap upfront,
Thomas et al. ( 36 ) developed a method without precursor ion
selection, where spectra were acquired in the positive and negative
modes in three alternated conditions: without fragmentation in the
100–1,000 Da range with a resolving power of 50,000 FWHM
and then with CID at collision energies of 20 and 50 eV in the
m / z 70–600 range with a resolving power of 25,000 FWHM. The
resulting cycle time was <2 s. Compound identi ﬁ cation was based
on the accurate masses of the parent and fragment ions, sometimes
both in the positive and negative ionization modes, as well as on
their retention time. The authors validated their method for 32
doping agents, including some designer drugs recently introduced
in the WADA lists for which no analytical technique was available
at the time. Like the previous group, they emphasized the fact that
this kind of method provides mass spectra containing all the desired
information to identify unknown substances retrospectively.
A comparative study between TOFMS and orbitrap accurate
mass spectrometry coupled with ultra-performance liquid chroma-
tography (UPLC) was conducted in the ﬁ eld of hormone and
veterinary drug residue analysis ( 37 ) . Extracts from blank bovine
hair were forti ﬁ ed with 14 steroid esters. All 14 compounds could
be detected and their accurate mass measured at low ng/g concen-
trations using orbitrap mass spectrometry at a resolving power of
60,000. UPLC-orbitrap at a resolving power of 7,500 and UPLC-
TOFMS at mass resolving power of 10,000 both failed to detect all
steroid esters, owing to the inability to resolve analyte ions from
co-eluting isobaric matrix compounds. High resolution can thus
partly compensate for low signal-to-background noise concentra-
tion ratios, but the authors concluded that nonselective sample
preparation is expected to aggravate the issue of false negative
results obtained due to insuf ﬁ cient mass resolving power.

Quite a few of the recent, abovementioned STA or GUS techniques
actually employed UPLC or UHPLC ( 29, 30, 36, 37 ) upfront
mass spectrometry. However, the enhancement in chromato-
graphic resolution produces very narrow (commonly 1–3 s wide)
chromatographic peaks ( 38 ) , which is only compatible with mass
spectrometry cycle times at least threefold shorter (provided
no polarity switching or alternated collision energies are used).
4. Ultrahigh
Pressure (or
Ultra-Performance)
Liquid
Chromatography

22 P. Marquet
High-resolution mass spectrometers such as TOFMS or orbitrap
instruments are more suited than QqQ instruments to acquire full-
scan MS data within this time frame. High chromatographic
resolution may thus be considered as a hindrance to rich MS
data acquisition.

Lee et al. compared their UPLC-TOFMS technique with HPLC-UV
(REMEDiHS), in-house HPLC-DAD, full-scan GC-MS, and
UPLC-MS/MS in the SRM mode for the analysis of 30 authentic
urine samples ( 29 ) . UPLC-TOFMS was able to detect 95 com-
pounds, the REMEDiHS 47, GC-MS (without derivatization) 23,
HPLC-DAD 14 (in a library of 594 UV spectra), and UPLC-MS/
MS 23 (out of 170 targeted compounds). 94.7% of the compounds
detected by TOFMS were con ﬁ rmed by at least one of the other
techniques, while the remaining four results could not be con ﬁ rmed
as false positive as the corresponding compounds were not included
in the other techniques. On the other hand, three false negative
results were noted. Although the “gold standard” comprised a
combination of suboptimal techniques, these results advocate for
the sensitivity and speci ﬁ city of UPLC-TOFMS for GUS.
Lynch et al. compared ﬁ ve methods for GUS/STA (which
they called comprehensive drug screening, or CDS) for their abil-
ity to detect drugs in 48 patient urine samples: LC-UV (REMEDi),
full-scan GC-MS after acetylation of the extracts, full-scan LC-MS
with in-source CID, LC-LIT-QqQ in the SRM information-
dependent acquisition-enhanced product ion scan (SRM-IDA-EPI)
mode (264 SRM transitions in the survey mode), and LC-LIT in
the polarity switching, targeted MS
2
mode ( 39 ) . They found that
the LC-LIT and LC-LIT-QqQ methods identi ﬁ ed 15% more drugs
than the single-stage MS or LC-UV methods. However, none was
able to detect all compounds and automatic library searching and
reporting algorithms resulted in false positive and false negative
results, which could be easily identi ﬁ ed upon manual review of the
raw data. The most common cause of false positive results was car-
ryover, specially for LC-LIT, followed by nonspeci ﬁ c matching of
spectra with <3 ions (in particular for LC-LIT-QqQ). It is worth
noting that LC-LIT-QqQ led to tenfold more false negative results
than LC-LIT (49.3% vs. 4.8%), which may also partly be attributed
to the limited number of targeted SRM transitions with the
former.
Another comparative study was conducted between GC-MS
and an STA procedure developed on an LIT-QqQ instrument,
following 100 drugs in the SRM survey mode ( 40 ) . Ninety- ﬁ ve
postmortem blood samples were analyzed in parallel resulting in
5. Comparison of
GC-MS and LC-MS/
MS Techniques
for Screening
Compounds
of Toxicological
Interest

232 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
the detection of >400 drugs, and the two techniques yielded a
surprising 98% concordance between them, despite 2 years of
refrigerated storage between the two sessions of analyses.
One limitation of these three comparative studies is that the
sample preparation procedures were different for all the analytical
techniques compared, with or without urine hydrolysis, using
liquid–liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE), or
dilute and shoot, which does not actually allow for rigorous com-
parison of the respective merits of the hyphenated techniques.
However, all three showed that LC-MS(/MS) was at least as
ef ﬁ cient as the traditional techniques used for GUS/STA in most
toxicology laboratories.

Sample preparation and limits of detection are also important
determinants of the ef ﬁ ciency of such methods. In particular, non-
selective extraction procedures are necessary for good recovery of
molecules in a wide polarity range, including highly polar drugs
not amenable to GC-MS.
Filtration and injection or protein precipitation with ace-
tonitrile and injection of the supernatant (the so-called dilute and
shoot strategy) can provide a direct means to introduce samples
into HPLC ( 41 ) . However, the lack of a concentration step may
limit the detection of some of the most potent drugs, while the
absence of a puri ﬁ cation step may favor matrix effects, hence false
negative results.
Among the molecules targeted by LC-MS(/MS) GUS proce-
dures are those not amenable to GC-MS, i.e., polar, acidic, ther-
mally labile, or hydrophilic, and the extraction procedure should
be chosen accordingly. Two LLE procedures can be used in paral-
lel, one for acidic and one for basic compounds. SPE is also widely
employed, either based on classical, mildly hydrophobic C8 or C18
mixed-mode phases, or on mixed-mode sorbents that can probably
cope with compounds in the largest polarity range.
Though hardly addressed in the literature, emphasis should also
probably be put on the very last step of sample preparation, i.e., the
nature of the solvent used to reconstitute dry extracts, as the solu-
bility of polar compounds can be poor in pure organic solvents.
Another recent possibility is to use online sample preparation
techniques. Standard SPE cartridges can be used with commercial
SPE automation coupled upfront with LC-MS/MS. Alternatively,
microextraction by packed sorbent (MEPS) is a miniaturized SPE
format intended to work with sample volumes as small as 10 μ L.
The MEPS sorbent bed is integrated into a syringe that allows
for manipulations of low-volume samples, either manually or in
6. Extraction
Strategies

24 P. Marquet
combination with certain autosamplers or sample preparation
robots. The low solvent volume used for the elution of the analytes
can be injected directly into GC or LC systems, hence providing
completely automated MEPS/LC-MS or MEPS/GC-MS systems ( 42 ) .
Turbulent ﬂ ow chromatography (TFC) is a column-switching
technique based on direct injection of biologic samples, without
previous extraction. Its main characteristic is the use of a ﬁ rst column
packed with large particles of a stationary phase material and a high
mobile phase ﬂ ow rate, the combination of which generates a
particular chromatographic behavior called turbulent ﬂ ow, which
allows retention of the small molecules of interest and exclusion of
large biomolecules. However, drug–protein bonds have to be
broken prior to injection into the system, generally using a ﬁ rst
step of manual protein precipitation; otherwise the drug bound
fraction would be eliminated with the proteins. To our knowledge,
no published STA or GUS technique has employed online SPE,
MEPS, or TFC so far. Although probably not superior to classic
extraction techniques in terms of recovery yields and method sensi-
tivity, these online techniques offer the advantage of automation.
Actually, whatever the sample preparation procedure, one of the
main problems when using LC-API-MS, particularly for GUS, is
to detect even small signals against a high background noise. The
critical point indeed is the signal-to-noise ratio (S/N), mainly
determined by the purity of the extracts injected and the recovery
of the compounds of interest.

Untargeted screening for unknown compounds by LC-MS is
highly challenging. As a general rule, MS/MS in toxicology brings
higher speci ﬁ city and selectivity (higher S/N), as well as more
structural information when an unknown chromatographic peak
has to be explored. However, the ﬁ rst step for GUS is to detect
unexpected compounds, which is not compatible with the classical
SRM mode, either used alone or as the survey scan prior to a
con ﬁ rmatory, daughter ion scan mode. The major drawback of
LC-MS/MS in the full-scan mode for STA or GUS is the lack
of reference libraries that can be used on different apparatus types
due to insuf ﬁ cient reproducibility of LC-MS(/MS) mass spectra
obtained with different instrument types.
Major improvements have recently come from the MS part of
the coupling: linear ion traps offer increased S/N ratio and MS
3

capabilities, while high-resolution (TOF or orbitrap) mass
spectrometers offer higher mass precision, which greatly facilitates
identi ﬁ cation of unknown compounds and apparently shows the
best performance in comparative studies. The time is probably
7. Conclusion

252 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
close now for a universal GUS procedure based on LC-MS, similar
to but with much better performance than full-scan GC-MS,
provided standardization of basic MS conditions can be agreed
upon by vendors of mass spectrometers in order to share large
libraries of spectra.
References
1. Maurer HH (2010) Perspectives of liquid chro-
matography coupled to low- and high-resolu-
tion mass spectrometry for screening,
identi ﬁ cation, and quanti ﬁ cation of drugs in
clinical and forensic toxicology. Ther Drug
Monit 32:324–327
2. Peters FT (2010) Recent advances of liquid
chromatography-(tandem) mass spectrometry
in clinical and forensic toxicology. Clin Biochem
44(1):54–65
3. Niessen WM (2011) Fragmentation of toxico-
logically relevant drugs in positive-ion liquid
chromatography-tandem mass spectrometry.
Mass Spectrom Rev 30(4):626–63
4. Sauvage FL, Gaulier JM, Lachâtre G, Marquet P
(2008) Pitfalls and prevention strategies for liq-
uid chromatography-tandem mass spectrometry
in the selected reaction-monitoring mode for
drug analysis. Clin Chem 54(9):1519–1527
5. Meyer MR, Peters FT, Maurer HH (2010)
Automated mass spectral deconvolution and
identi ﬁ cation system for GC-MS screening for
drugs, poisons, and metabolites in urine. Clin
Chem 56(4):575–584
6. Steiner RR, Larson RL (2009) Validation of the
direct analysis in real time source for use in
forensic drug screening. J Forensic Sci
54(3):617–622
7. Marquet P (2002) Is LC–MS suitable for a
comprehensive screening of drugs and poisons
in clinical toxicology? Ther Drug Monit
24:125–133
8. Marquet P (2006) Systematic toxicological
analysis with LC-MS. In: Polettini A (ed)
Applications of LC-MS in toxicology.
Pharmaceutical Press, London
9. Marquet P (2006) General unknown screening
using LC-MS. In: Niessen WM (ed) The ency-
clopedia of mass spectrometry volume 8.
Elsevier, Oxford
10. Gergov M, Ojanperä I, Vuori E (2003)
Simultaneous screening for 238 drugs in blood
by liquid chromatography–ionspray tandem
mass spectrometry with multiple-reaction mon-
itoring. J Chromatogr B 795:41–53
11. Dresen S, Ferreirós N, Gnann H, Zimmermann
R, Weinmann W (2010) Detection and
identi ﬁ cation of 700 drugs by multi-target
screening with a 3200 QTRAP
®
LC–MS–MS
system and library searching. Anal Bioanal
Chem 396:2425–2434
12. Sauvage FL, Marquet P (2010) ESI-MS-MS
library of 1,253 compounds for application in
forensic and clinical toxicology. Anal Bioanal
Chem 396(5):1947
13. Sauvage FL, Picard N, Saint-Marcoux F, Gaulier
JM, Lachâtre G, Marquet P (2009) General
unknown screening procedure for the charac-
terization of human drug metabolites in foren-
sic toxicology: applications and constraints.
J Sep Sci 32(18):3074–3083
14. Marquet P, Saint-Marcoux F, Gamble TN,
Leblanc JCY (2003) Comparison of a prelimi-
nary procedure for the general unknown
screening of drugs and toxic compounds using
a quadrupole-linear ion-trap mass spectrometer
with a liquid chromatography–mass spectrom-
etry reference technique. J Chromatogr
789:9–18
15. Sauvage FL, Saint-Marcoux F, Duretz B, Deporte
D, Lachatre G, Marquet P (2006) Screening of
drugs and toxic compounds with liquid chroma-
tography-linear ion trap tandem mass spectrome-
try. Clin Chem 52(9):1735–1742
16. Weinmann W, Gergov M, Goerner M (2000)
MS-MS Libraries with triple quadrupole
MS–MS for drug identi ﬁ cation and drug screen-
ing. Analysis 28:934–941
17. Bristow AWT, Webb KS, Lubben AT, Halket J
(2004) Reproducible product-ion tandem mass
spectra on various liquid chromatography–mass
spectrometry instruments for the development
of spectral libraries. Rapid Commun Mass
Spectrom 18:1447–1454
18. Josephs JL, Sanders M (2004) Creation and
comparison of MS–MS spectral libraries using
quadrupole ion trap and triple-quadrupole mass
spectrometer. Rapid Commun Mass Spectrom
18:743–759
19. Jansen R, Lachâtre G, Marquet P (2005)
LC–MS–MS systematic toxicological analysis:
comparison of MS–MS spectra obtained with
different instruments and settings. Clin Biochem
38:362–372
20. Milman BL (2005) Towards a full reference
library of MS
n
spectra. Testing a library containing

26 P. Marquet
3126 MS
2
spectra of 1743 compounds. Rapid
Commun Mass Spectrom 19:2833–2839
21. Oberacher H, Pavlic M, Libiseller K, Schubert B,
Sulyok M, Schuhmacher R, Csaszar E, Köfeler
HC (2009) On the inter-instrument and inter-
laboratory transferability of a tandem mass
spectral reference library: 1. Results of an
Austrian multicenter study. J Mass Spectrom
44:485–493
22. Oberacher H, Pavlic M, Libiseller K, Schubert B,
Sulyok M, Schuhmacher R, Csaszar E, Köfeler
HC (2009) On the inter-instrument and the
inter-laboratory transferability of a tandem mass
spectral reference library: 2. Optimization and
characterization of the search algorithm. J Mass
Spectrom 44:494–502
23. Baumann C, Cintora MA, Eichler M, Lifante E,
Cooke M, Przyborowska A, Halket JM (2000)
A library of atmospheric pressure ionization
daughter ion mass spectra based on wideband
excitation in an ion trap mass spectrometer.
Rapid Commun Mass Spectrom 14:349–356
24. Dulaurent S, Moesch C, Marquet P, Gaulier JM,
Lachâtre G (2010) Screening of pesticides in
blood with liquid chromatography-linear ion
trap mass spectrometry. Anal Bioanal Chem
396(6):2235–2249
25. Gergov M, Boucher B, Ojanperä I, Vuori E
(2001) Toxicological screening of urine for
drugs by liquid chromatography/time-of- ﬂ ight
mass spectrometry with automated target library
search based on elemental formulas. Rapid
Commun Mass Spectrom 15:521–526
26. Pelander A, Ojanperä I, Laks S, Rasanen I,
Vuori E (2003) Toxicological screening with
formula-based metabolite identi ﬁ cation by liq-
uid chromatography/time-of- ﬂ ight mass spec-
trometry. Anal Chem 75:5710–5718
27. Ojanperä S, Pelander A, Pelzing M, Krebs I,
Vuori E, Ojanperä I (2006) Isotopic pattern
and accurate mass determination in urine drug
screening by liquid chromatography/time-of-
ﬂ ight mass spectrometry. Rapid Commun Mass
Spectrom 20:1161–1167
28. Kolmonen M, Leinonen A, Pelander A,
Ojanperä I (2007) A general screening method
for doping agents in human urine by solid phase
extraction and liquid chromatography/time-of-
ﬂ ight mass spectrometry. Anal Chim Acta
585(1):94–102
29. Lee HK, Ho CS, Iu YP, Lai PS, Shek CC, Lo
Y-C, Klinke HB, Wood M (2009) Development
of a broad toxicological screening technique for
urine using ultra-performance liquid chroma-
tography and time-of- ﬂ ight mass spectrometry.
Anal Chim Acta 649:80–90
30. Badoud F, Grata E, Perrenoud L, Avois L,
Saugy M, Rudaz S, Veuthey JL (2009) Fast
analysis of doping agents in urine by ultra-high-
pressure liquid chromatography-quadrupole
time-of- ﬂ ight mass spectrometry I. Screening
analysis. J Chromatogr A 1216:4423–4433
31.
Vonaparti A, Lyris E, Angelis YS, Panderi I,
Koupparis M, Tsantili-Kakoulidou A, Peters RJ,
Nielen MW, Georgakopoulos C (2010)
Preventive doping control screening analysis of
prohibited substances in human urine using
rapid-resolution liquid chromatography/high-
resolution time-of- ﬂ ight mass spectrometry.
Rapid Commun Mass Spectrom 24:1595–1609
32. Peters RJ, Oosterink JE, Stolker AA,
Georgakopoulos C, Nielen MW (2010) Generic
sample preparation combined with high-resolu-
tion liquid chromatography-time-of- ﬂ ight mass
spectrometry for uni ﬁ cation of urine screening
in doping-control laboratories. Anal Bioanal
Chem 396:2583–2598
33. Pelander A, Tyrkkö E, Ojanperä I (2009) In
silico methods for predicting metabolism and
mass fragmentation applied to quetiapine in liq-
uid chromatography/time-of- ﬂ ight mass spec-
trometry urine drug screening. Rapid Commun
Mass Spectrom 23(4):506–514
34. Polettini A, Gottardo R, Pascali JP, Tagliaro F
(2008) Implementation and performance eval-
uation of a database of chemical formulas for
the screening of pharmaco/toxicologically rel-
evant compounds in biological samples using
electrospray ionization-time-of- ﬂ ight mass
spectrometry. Anal Chem 80:3050–3057
35. Virus ED, Sobolevsky TG, Rodchenkov GM
(2008) Introduction of HPLC/orbitrap mass
spectrometry as screening method for doping
control. J Mass Spectrom 43:949–957
36. Thomas A, Guddat S, Kohler M, Krug O,
Schanzer W, Petrou M, Thevis M (2010)
Comprehensive plasma-screening for known and
unknown substances in doping controls. Rapid
Commun Mass Spectrom 24:1124–1132
37. van der Heeft E, Bolck YJ, Beumer B, Nijrolder AW,
Stolker AA, Nielen MW (2009) Full-scan accu-
rate mass selectivity of ultra-performance liquid
chromatography combined with time-of- ﬂ ight
and orbitrap mass spectrometry in hormone
and veterinary drug residue analysis. J Am Soc
Mass Spectrom 20(3):451–463
38. Guillarme D, Ruta J, Rudaz S, Veuthey JL
(2010) New trends in fast and high-resolution
liquid chromatography: a critical comparison of
existing approaches. Anal Bioanal Chem
397:1069–1082
39. Lynch KL, Breaud AR, Vandenberghe H, Wu AH,
Clarke W (2010) Performance evaluation of
three liquid chromatography mass spectrometry
methods for broad spectrum drug screening.
Clin Chim Acta 411(19–20):1474–1481

272 LC-MS vs. GC-MS, Online Extraction Systems, Advantages of Technology…
40. Herrin GL, McCurdy HH, Wall WH (2005)
Investigation of an LC-MS-MS (QTrap)
method for the rapid screening and identi ﬁ cation
of drugs in postmortem toxicology whole blood
samples. J Anal Toxicol 29(7):599–606
41. Politi L, Morini L, Polettini A (2007) A direct
screening procedure for diuretics in human
urine by liquid chromatography-tandem mass
spectrometry with information dependent
acquisition. Clin Chim Acta 386(1–2):
46–52
42. Abdel-Rehim M (2010) Recent advances in
microextraction by packed sorbent for bioanalysis.
J Chromatogr A 1217(16):2569–2580

29
Loralie J. Langman and Christine L.H. Snozek (eds.), LC-MS in Drug Analysis: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 902, DOI 10.1007/978-1-61779-934-1_3, © Springer Science+Business Media, LLC 2012
Chapter 3
LC-MS/MS Techniques for High-Volume Screening
of Drugs of Abuse and Target Drug Quantitation
in Urine/Blood Matrices
Jeff C. Eichhorst , Michele L. Etter , Patricia L. Hall , and Denis C. Lehotay
Abstract
Liquid chromatography−tandem mass spectrometry, employing electrospray ionization (ESI), has been
applied in the analysis of many drugs and drug    metabolites. Sample preparation has been an important part
of this technique when analyzing biological samples. Here we describe a high−volume urine screening tech−
nique for approximately 40 different drugs of abuse as well as methods for quanti ﬁ cation of many other
drugs in serum, plasma, and whole blood. These techniques can be used in many different settings from
clinical and forensic toxicology examinations to pharmacokinetic studies. Sample preparation procedures
range from simple “dilute and shoot” methods to more extensive solid−phase extraction techniques.
Key words:   Drugs of abuse ,  Tandem mass spectrometry ,  LC−MS/MS ,  Toxicology ,  Chromatography ,
GC−MS ,  Screening

Broad spectrum, high−throughput analysis of drugs using liquid
chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC−
MS/MS) emerged as a widely accepted technique in the late 1990s
and early 2000s  (  1  ) . This included applications for broad−spectrum
screening as well as quanti ﬁ cation and con ﬁ rmation of drug iden−
tity  (  2–  4  ) . Previous to high−throughput mass spectrometric tech−
niques, immunoassay systems were predominantly used for
qualitative screening for many different drugs or families of drugs.
Drug testing governing bodies such as the National Institute
for Drug Abuse (NIDA) and the SAMHSA (Substance Abuse and
Mental Health Service Administration) developed guidelines,
which included recommended cutoff concentrations for each drug
or family of drugs analyzed  (  5  ) . The obvious advantage to immu−
noassay systems is their ability to accommodate high−throughput
1. Introduction

30 J.C. Eichhorst et al.
processing for samples with little or no need to perform sample
cleanup or extraction of analyte from matrix. The obvious disad−
vantages to using immunoassay−based drug testing are that
substantial and variable cross−reactivity can exist for each species
within a class of drugs, and that the assays often have poor speci ﬁ city
(  6  ) . This lack of speci ﬁ city requires using an ultimately more reli−
able method for con ﬁ rmation of drug identity in case of signi ﬁ cant
consequence or for legal purposes. The method of choice for
con ﬁ rmatory analysis has traditionally been gas chromatography−
mass spectrometry (GC−MS)     (  7  ) . By developing and assessing
identi ﬁ cation acceptance criteria when using multiple stage mass
spectrometry for detection and quanti ﬁ cation, it is possible to
obtain con ﬁ rmatory data in these high−throughput testing
con ﬁ gurations  (  8  ) . Speci ﬁ c criteria must be incorporated into
methodologies including monitoring multiple mass transitions,
evaluating the ratios of their relative intensities, as well as using
strict retention window guidelines  (  3  ) .
A major consideration for LC−MS/MS is the problem of ion
suppression or enhancement. A non−optimized (for ion suppres−
sion/enhancement) analytical method can lead to poor precision
and accuracy in quantitative methods  (  9  ) . This is an important
issue, which must be addressed in method development, valida−
tion, and routine use. Alterations of ionization ef ﬁ ciencies are a
direct result of matrix effects (presence of co−eluting species). Two
common ways of assessing matrix effect are either by a post−extraction
addition method or the post−column infusion method. Modi ﬁ cations
to sample extraction and/or chromatographic separation may be
required to create a successful and robust quantitative method
(  10  ) .
High−throughput concerns have for the most part been elimi−
nated with fast chromatography utilizing sub 2  m m particle size
separation columns. Fast analysis of small molecules requires effec−
tive and ef ﬁ cient chromatography as well as decreased analytical
cycle time in the mass spectrometer. Newer systems have accom−
plished both of these tasks well  (  11  ) . Elimination of tedious sample
preparation and/or the introduction of automated extraction have
become common to handle high−volume testing. Both off−line and
online solid−phase extraction with column switching and turbulent
ﬂ ow chromatography have been used to perform sample prepara−
tion for pharmaceutical compounds and their metabolites. Run
times for parent drug and several metabolites can be as short as
1 min  (  12  ) .
Drug detection, identi ﬁ cation, and quanti ﬁ cation techniques
are used for a wide variety of reasons. LC−MS/MS is a powerful
analytical tool in metabolic studies in drug discovery, as a method
to detect drugs as emerging contaminants in the environment, and
for the study of pharmacokinetics in humans and animals. The
technique is used for evaluating drug–drug interactions involving
cytochrome P450 enzymes and evaluating new chemical entities.

313 LC-MS/MS Techniques for High-Volume Screening…
High−throughput screening is used for the detection of illicit drugs
in drug treatment patients, toxicological examination of clinical
samples, forensic testing, and for law enforcement purposes. It is
also used in therapeutic drug monitoring and for the detection of
veterinary drug residues in milk, honey, and food products.

Methanol and acetonitrile are HPLC grade. Steam distilled water
is used for all reagent preparation. All reagents are stored at room
temperature unless otherwise indicated.
      1.    Commercial stock internal standards: Morphine−D
3
, amphet−
amine−D
5
, methylenedioxymethamphetamine (MDMA)−D
5
,
benzoylecognine−D
8
, 7−aminoclonazepam−D
4
, meperidine−D
4
,
methadone−D
9
, clonazepam−D
4
, diazepam−D
5
, and carboxytet−
rahydrocannabinol (THC−COOH)−D
9
  all at a concentration of
100  m g/mL (Cerilliant, Round Rock, TX). Stored at −20°C.
    2.    Intermediate stock internal standards: All intermediate internal
standards except morphine−D
3
  are prepared by diluting the
commercial stock to a concentration of 1  m g/mL in methanol.
Morphine−D
3
  is prepared at a concentration of 2  m g/mL. No
intermediate stock internal standard is made for THC−
COOH−D
9
. Stored at 4°C.
    3.    Working internal standard: Prepared by diluting commercial
(THC−COOH−D
9
  only) and intermediate internal standard
solutions to a  ﬁ nal volume of 200 mL in 60:40 (v/v, %)
water:methanol with 0.1% formic acid, according to the con−
centrations speci ﬁ ed in Table  1 .
    4.    Commercial stock standards: Solutions of the targeted drugs
were obtained in varying concentrations. Opened and
unopened stock standards are stored at −20°C. Targeted drugs
and stock concentrations are shown in Table  2 .
    5.    Intermediate and working standards: Prepared as shown in
Table  2 . Intermediate standards are prepared in 50:50 (v/v)
methanol:H
2
O and are stored at −20°C. Working standards
are prepared in drug−free urine, and stored at 4°C.
    6.    0.2 M ammonium acetate buffer pH 4.9: Dissolve 1.54 g
ammonium acetate in 100 mL H
2
O. Vortex to dissolve.
    7.    Beta−glucuronidase: Beta−glucuronidase from  helix pomatia  at
2,701,900 Fishman units per gram (Sigma Aldrich, Oakville,
ON, Canada) (see Note 1). Dissolve 0.1 g of enzyme in 12 mL
of 0.2 M ammonium acetate buffer. Vortex vigorously and mix
for 30 min. Spin and pipette off supernatant for use. Store pro−
tected from light at 4°C.
2. Materials
2.1. Standards
and Reagents
for General Screen

Another Random Scribd Document
with Unrelated Content

Unkarikin, joka niin kauan oli hävitysretkillään häirinnyt saksalaisia
maita, avasi vihdoin ovensa saksalaiselle siirtolaisuudelle.
Sankempaa saksalaista uudisasutusta ei kuitenkaan syntynyt muuta
kuin asumattomissa vuorimaissa, kuten Pohjois-Unkarissa, Tatran
rinteillä ja Siebenbürgissä. Mutta muuallakin Unkarissa syntyi
saksalaisia kaupungeita, jotka saivat pitää magdeburgilaisen tai
baijerilaisen oikeutensa. Tämä saksalaisuus on Unkarin kultuuriin
painanut pysyvän leiman, mutta se oli toki liian heikkoa, voidakseen
määrätä kansan valtiollisia kohtaloita.
Tähän suurenmoiseen siirtolaisuuteen ottivat kaikki Saksan heimot
osaa, kaakossa toimivat Baijerilaiset ja Schwaabit, etäimpänä
koillisessa Saksilaiset ja Alafrankit ja näiden eteläpuolella
Thüringiläiset ja Itäfrankit. Niin paljon edelle oli Saksan viljelys jo
päässyt itäisistä rajamaista, että nämä ehdollaan ottivat vastaan
saksalaisia vuorimiehiä, ammattilaisia ja kauppiaita, kohottaakseen
siten oman maan taloudellista elämää. Kansallinen vaara, joka siihen
sisältyi, oli sen ajan ihmisille vielä vieras käsite.
Sota- ja kaupparetkillä Italiaan ja Itämaille, Itämeren rannoille ja
Venäjälle Saksalaiset oppivat tuntemaan vieraita kansoja, jotka olivat
mitä erilaisimmilla sivistysasteilla. Ajan valistus alkoi syventyä
maallikoidenkin kesken, siitä ovat todistuksena ritarien sepittelemät
runoelmat, joita näihin aikoihin alkoi syntyä. Hohenstaufien
perintömaissa varsinkin rehotti tämä hovieepos, jonka tunnetuimmat
edustajat olivat Hartmann von Aue, Gottfried von Strassburg ja
baijerilainen Wolfram von Eschenbach, joka ranskalaisen esikuvan
mukaan kirjotti "Parcivalinsa", keskiajan suuripiirteisimmän
kuvauksen inhimillisestä elämästä ja pyrkimyksestä nuoruuden
kokemattomuudesta epäilyksen kautta autuaallisuuteen, korkeimman
maallisen ja taivaallisen onnen nautintoon. Itävallassa joku ritari,

jonka nimi ei ole jälkimaailmalle säilynyt, vanhoista lauluista ja
historiallisista muistoista kirjotti "Niebelungien" laulun, saksalaisten
kansalliseepoksen, jossa pakanalliset ja kristilliset käsitteet sulavat
valtaavaan kuvaukseen kansainvaelluksien taisteluista. Muuan toinen
itävaltalainen pohjoismaalaista aihetta käsitellen kirjotti "Gudrunin"
laulun. Molemmissakin runoelmissa käsitellään ruhtinaan ja vasallin,
miehen ja vaimon välisiä suhteita, ne ovat siinä suhteessa
aitogermanilaisia hengentuotteita. Muutkin runoilun lajit, etenkin
lyriikka, kehittyivät harvinaisen korkealle. Lyyrikoiden mestari oli
itävaltalainen Walter von der Vogelweide.
Runouden ohella muutkin taiteet kehittymistään kehittyivät,
varsinkin rakennustaide. Kuninkaat ja ruhtinaat alkoivat rakentaa
itselleen yhä komeampia linnoja. Hohenstaufit rakensivat Trifelsin,
Hagenaun, Gelnhausenin, Welfit Dankwarderoden, Thüringin
maakreivit Wartburgin, muita mainitsematta. Alemman ritariston
asumukset sitä vastoin pysyivät edelleenkin jotenkin yksinkertaisina.
Mutta vielä suurisuuntaisempi oli kirkon rakennustyö. Pyöreäkaarinen
romanilainen rakennustyyli kehittyi kehittymistään, lähennellen
suippoholvista gootilaista tyyliä, ja vihdoin tämä itsekin saapui
Saksaan rajan takaa Ranskasta, joka on sen varsinainen kotimaa.
Muitten maakuntain edellä kulki yhä Rheinin jokivarsi, jossa viljelys
oli vanhin. Mainz, Speier ja Worms rakensivat vanhat
tuomiokirkkonsa uudestaan entistä komeammiksi. Kölnissä aljettiin
rakentaa suunnattoman suurta gootilaista tuomiokirkkoa, joka vasta
viime vuosisadalla lopullisesti valmistui, Frankissa ja Hessissä
noudatettiin esimerkkiä, jota vastoin Baijerissa ja Schwaabissa
kauemmin pidettiin kiinni vanhasta romanilaisesta rakennusmallista.
Erinomaisen vilkas ja itsenäinen käsittelyn puolesta oli rakennustoimi
Welfien maissa, Saksin länsiosissa ja Thüringissä, jossa

Halberstadtin, Hildesheimin, Naumburgin, Merseburgin ja
Magdeburgin kaupungit vielä tänä päivänä säilyttävät noilta ajoilta
ihania rakennusmuistomerkkejä. Uudemmista siirtomaista varsinkin
hopearikas Saksi noudatti esimerkkiä. Komeimpia sen aikuisia
muistomerkkejä on Saksissa Freibergin tuomiokirkko. Pohjois-Saksan
alangolla sitä vastoin kivien puute pakotti käyttämään tiiltä ja
samalla yksinkertaisempaa rakennustyyliäkin.
Maaruhtinaiden ja kaupunkien aika.
Keskiajan lopulla.
Niinä sekavina ja melskeisinä aikoina, jotka seurasivat
Hohenstaufien kukistumista, Saksa valtiollisesti peräti heikontui.
Slaavilainen Böhmi, jonka siihen saakka oli täytynyt noudattaa
keisarikunnan käskyjä, paisui nyt niin mahtavaksi, että se joksikin
ajaksi vallotti kaikki Tonavan varrella ja Alpeissa olevat nykyisen
Itävallan maat aina Kärnthiä ja Krainia myöden.
Hohenstaufien jälkeen jatkui yhä selvemmin se kehitys, joka
lopullisesti hajotti Saksan kansan kahdeksi suurvallaksi. Kuninkuus
vakautui pysyväisesti eteläsaksalaisten ruhtinaitten piiriin, yhä
enemmän joutuivat nykyisen Itävallan maat sen kantamaaksi ja
Pohjois-Saksan alueet sitä myöden vieraantuivat valtakunnasta.
Hallitsija yhä valittiin ja kruunu kulki suvusta toiseen, mutta muita
sukuja suuremman vaikutuksen hallitsijanvaaleissa saavutti Itävallan
nykyinen keisarisuku, jonka kantaisä, Habsburgin Rudolf, v. 1273
valittiin kuninkaaksi. Hallitusaikanaan osasi Rudolf etupäässä
avioliittojen kautta niin suuressa määrin vahvistaa sukunsa valtaa,

että kaikki Itävallan nykyiset maakunnat Tonavan varsilla ja Alpeissa
sille kuuluivat. Mutta kauan kulki kruunu vielä muissakin suvuissa,
ennenkuin se muuttui Habsburgin huoneessa perinnölliseksi. Saksan
hallitsijat edelleenkin tekivät retkiä Italiaan, koettaen palauttaa
keisarikuntaa ja vanhaa mahtiaan, mutta lyhytaikaisia olivat siellä
saavutetut menestykset. Italia yhä enemmän vieraantui Saksalaisten
vaikutuspiiristä, jäädäkseen hajanaiseksi maaksi, jossa paavi,
kaupungit ja Napolin kuningaskunta jakoivat vallan. Vieläpä päin
vastoin paavi alkoi saada yhä enemmän sananvaltaa Saksan
kuningasvaaliin.
Neljännentoista vuosisadan keskivaiheilla raivosi Saksassa "musta
surma", joka varsinkin taajaan asutuissa, ajanlaadun mukaan
likaisissa kaupungeissa teki suunnatonta tuhoa. Tätä seikkaa
hyväkseen käyttäen saattoivat ruhtinaat hajottaa Etelä-Saksan
kaupunkien liitot, korvaamattomaksi tappioksi vapaan keskisäädyn
vastaiselle kehitykselle. Kaupunkien liiton vastapainoksi oli
muodostunut ritariliitto ja molempien välillä syntyi sota, jonka
kestäessä maata kamalimmalla tavalla hävitettiin. Kuninkaan
välityksellä sota päättyi, riitakysymykset yhteisesti sovitettiin, mutta
kaupunkien liittokunta hajotettiin ja ritarien liittokunta jäi voimaan, ja
siinä syy, miksi kehitys Etelä-Saksassa ei päässyt jatkumaan samalla
vapaalla pohjalla kuin Pohjois-Saksassa.
Mutta toiselta puolen sai sekä ruhtinasvalta että ritaristo samaan
aikaan ankaran iskun, kun mahtavain Habsburgien kaikista
ponnistuksista huolimatta heidän varsinainen kantamaansa tähän
aikaan vapautui ja yhtyi Sveitsin itsenäiseksi liittovaltakunnaksi.
Siihen saakka olivat sveitsiläiset niin kansallisuudeltaan kuin
valtioyhteyden puolesta olleet osa Saksan kansasta. Böhmin oli
kuitenkin Habsburgin Rudolf saanut uudelleen lannistetuksi. Kaarlo

IV aikana siitä tuli valtakunnan päämaa. Pragiin perustettiin
saksalainen yliopisto, joka pian kehittyi kuuluisimmaksi koko Keski-
Europassa. Böhmi saksalaistumistaan saksalaistui, näytti tosiaan
siltä, kuin siitä lopultakin tulisi saksalaisia yhdistävä keskusmaa,
etenkin kun kruunusta kilpailevat Lützelburgin ja Habsburgin suvut
avioliittojen kautta liittyivät yhteen. Mutta kuninkaan jakaessa
kuollessaan maansa poikainsa kesken tämä mahdollisuus hälveni.
Saksan valtakunta puuttui yhtenäisyyttä vielä entistäkin enemmän.
Sen vuoksi siirtolaisuuden saavutukset suureksi osaksi jälleen
menetettiin. Sisällisesti maa heikontui säätyjen keskinäisten riitain
kautta. Yhä yleisemmäksi alkoi sen vuoksi käydä vaatimus, että
kirkko oli puhdistettava ja valtakuntaa vahvistettava. Skandinavian
maat vähitellen vapautuivat Hansan holhoudesta, idässä Puola
voimistui niin, että se pian saattoi anastaa takaisin koko joukon niistä
slaavilaisista maista, joita Saksalainen ritarikunta yhä saksalaistutti.
Viidennentoista vuosisadan loppupuolella oli koko maa Weichselin
suistamoon saakka Puolan hallussa.
Böhmi kukistaa saksalaisuuden.
Böhmissä, jossa saksalaisuus oli nopeaan edistynyt niinä aikoina,
kun valtakunnan hallitsija Pragissa asui, tapahtui hussilaissotain
kautta viidennentoista vuosisadan alkupuoliskolla perinpohjainen
muutos. Kun Juhana Huss vastoin hallitsijan lupaamaa turvallisuutta
oli Konstanzin kirkolliskokouksessa poltettu, niin Böhmin
tshekkiläinen väestö nousi kapinaan, jota ei paavin saarnaama
ristiretkikään voinut kukistaa. Siitä kehittyi mitä kamalin uskonsota ja
samalla myös rotusota. Tshekkiläiset karkottivat saksalaiset Pragista,
ottivat heidän omaisuutensa takavarikkoon ja valtasivat kaikkialla
maassa kirkot ja luostarit. Kuningas Sigismundin ensimäiset

ristiretkeläisarmeijat voitettiin v. 1420 ja Böhmin saksalaiset
kaupungit toinen toisensa jälkeen vallotettiin ja hävitettiin. Böhmin
varakas saksalainen porvaristo tuhottiin, kaupungit muutettiin
tshekkiläisiksi. Kun Böhmi oli saksalaisista puhdistettu, niin lähdettiin
hävitysretkille Schlesiaan, Lausitziin, Thüringiin, Brandenburgiin, jopa
Itämeren rannoille saakka. Hajanaisen Saksan puolustuslaitos oli
kykenemätön näitä retkiä vastustamaan. Varsinaista armeijaa ei
ollut, paikalliset nostoväet eivät kyenneet vallottajia pysäyttämään.
Maaseutua oli aivan mahdoton puolustaa, kaupungit muurineen
pitivät paremmin puoliaan. Vaivalla kokoon saadut ristiretkiarmeijat
väistivät miesluvultaan heikompia tshekkiläisiä joukkoja. "Niinkuin
hävittäviä laavavirtoja purkava tulivuori riehui silloin Böhmi vuoriensa
piiristä", kostaen saksalaisten sorron. Eikä sitä lopultakaan voitu
sotaisilla keinoilla kukistaa, vaan sekä kirkon että hallitsijan täytyi
myöntyä tshekkiläisten tärkeimpiin vaatimuksiin. Böhmi edelleenkin
pysyi valtakunnan yhteydessä, mutta sisälliset asiansa se oli itse
järjestänyt, ja kaikiksi ajoiksi se oli ratkaissut kysymyksen, pysyisikö
se slaavilaisena maana.
Habsburgin huone.
Hajanaisesta Saksasta syntyi tosin uudelleen maailman valtakunta,
mutta se ei tapahtunut valtiollisen eikä kansallisen kehityksen
pohjalla, vaan avioliittojen kautta. Avioliittojen kautta Habsburgin
huone hankki maita niin laajalti, että kun keisarius sille jälleen joutui,
niin se hallitsi valtakuntaa, joka laajuuden puolesta saattoi kilpailla
Kaarlo Suurenkin maailmanvaltakunnan kanssa. Siihen kuuluivat
Itävallan maat ja Böhmi, Alankomaat, Burgundi, Neapel ja Sisilia,
vieläpä Espanjakin ja näitten välillä kaikki saksalaiset maat, jotka
kuitenkin edelleenkin pysyivät ruhtinassukujensa hallussa, vaikka

tunnustavatkin keisarin ylivallan. Valtakunnan valtiopäivillä olivat
edustettuina ainoastaan ruhtinaat ja osa kaupungeista, hallitsijan
valta edelleenkin pääasiallisesti perustui hänen suoranaisten
sukumaittensa mahtavuuteen. Valtakunnan eri osia hallittiin
itsenäisesti. Ei edes sotalaitos ollut sille kannalle järjestetty, että se
olisi hallitsijalle taannut varman ylivallan. Ruhtinaitten armeijat
edelleenkin pääasiallisesti perustuivat läänityslaitokseen ja
ritaristoon. Tätä armeijaa oli yhä vaikeampi koossa pitää
suuremmissa sotaisissa yrityksissä, ja lisäksi se oli ajan edistyessä
käynyt vanhanaikaiseksi ja kaluttomaksi aseeksi. Sveitsiläiset
ensimäiseksi olivat osottaneet, että pitkillä keihäillä ja kaukoaseilla oli
helppo murtaa ritarien kömpelöt panssaroidut rivit, kaupungit
niinikään olivat useimmiten taistelleet menestyksellä niitä vastaan.
Kaupungeissa oli ensinnä ruvettu tykkejä ja muita ampuma-aseita
käyttämään, joita vastaan ritarien panssaripaidat olivat huono suoja.
Seuraus tästä oli, että ruhtinaat rupesivat, samoin kuin kaupungitkin,
pitämään palkattuja armeijoja; ritariaikaa seurasi "maanihtien" aika.
Keisari Maximilian Alankomailla sotiessaan ensimäiseksi käytti
suurempia Ylä-Saksasta palkattuja maanihtijoukkoja. Rahoja
armeijansa ylläpitämiseksi ruhtinaat hankkivat pääasiallisesti
vuoriteollisuuden kautta, joka kaikkialla oli ruhtinaitten yksinoikeus.
Se kukoisti varsinkin Böhmissä, Erzgebirgessä, Westfalissa, Tirolissa,
Steiermarkissa, Kärnthissä ja Krainissa. Etupäässä kaivettiin jaloja
metalleja, varsinkin hopeata.
Kaupungit keskiajan lopulla.
Etelä-Saksan kaupungit olivat aikaisemmin menettäneet valtiollisen
mahtinsa, kun niiden liitto hävitettiin. Myöhemmin tuli Hansan vuoro.

Hansa menetti valtansa sekä ulkomaisen kilpailun että kaupunkien
sisällisen eripuraisuuden vuoksi. Mutta ylä-Saksan kaupungit
säilyttivät edelleenkin kauppansa sekä Välimeren maihin, että
Alankomaihin, vieläpä ottivat osaa Intiankin kauppaan, kun meritie
sinne oli löydetty, hyötyen varsinkin maustekaupalla. Tämä tuottava
kauppa kävi Rheiniä myöden. Samalla kauppa kehitti uusia muotoja.
Korkokanta aleni ja rahakauppa kävi entistä vilkkaammaksi. Pääomia
alkoi olla yhä enemmän liikkeessä ja niitä käytettiin erinomaisen
tuottavasti erilaisiin yrityksiin. Samalla alkoi rahoja hämmästyttävän
nopeaan kokoontua yksiin käsiin. Siten syntyivät aikansa ensimäiset
rahamahdit, Fuggerit, Welserit, Höchstätterit y.m., jotka ensinnä
alkoivat rahallisesti vallita kukin kaupunkiaan, ostaa köyhtyneen
aatelin maat, jopa usein rahanlainaajina vaikuttivat ruhtinaittenkin
politikaan. Fuggerien pankki hallitsi v:n 1500 vaiheilla Rooman koko
silloista rahaliikettä ja oli tärkeä tekijä Europan politikassa. Nämä
huoneet vähitellen kukistivat keskiajan sosialistis-ammattikunnallisen
kehityksen. Tämä pääomallinen kehitys sen vuoksi vaikutti
perinpohjaisen muutoksen ammattikuntien oloihin. Se hävitti
kokonaan ammattikuntien perustukset. Yksityiset mestarit
muuttuivat tehtailijoiksi, vaikeuttivat mestariksi pääsyä yhä
enemmän. Kisällit puolestaan liittyivät yhteen laajemmiksi
yhdistyksiksi, ja yrittivät jo työlakkojen kautta vaikuttaa
palkkausoloihin.
Tämän uuden taloudellisen kehityksen kautta omaisuus
kaupungeissa tuli entistä epätasaisemmin jaetuksi, mutta siitä
huolimatta kaupunkien varallisuus yleensä kohosi. Mutta semmoisia
suurkaupunkeja kuin Parisi, Firenze tai Venezia, ei Saksassa ollut
ainoatakaan. Viidennentoista vuosisadan keskivaiheilla oli
Nürnbergissä, Saksan suurimmassa kaupungissa, noin 20,000
asukasta, Strassburgissa 16,000, Baselissa noin 15,000, Frankfurtissa

suurenmoisista markkinoistaan huolimatta vain 7,000, Mainzissa
5,000, Rostockissa 14,000 ja Danzigissa yli 16,000 asukasta. Melkein
kaikki kaupungit vielä harjottivat melkoista maanviljelystä. Tätä
laajempaakin piiriään ne tavallisesti suojelivat muureilla ja haudoilla
ja vartijatorneilla. Kaupunkeja itseään ympäröivät valtaavat
kaksinkertaiset muurit tornineen, portteineen, etuvarustuksineen.
Kadut olivat epäsäännölliset, ahtaat, torit niinikään, paitsi itäisissä
uudismaissa, joissa alunpitäen oli rakennettu suorakatuisia
kaupungeita. Talot, joitten kapeat päädyt antoivat katuun päin, olivat
yleensä puusta rakennetut aina neljännelletoista vuosisadalle saakka.
Alikerroksessa oli kellarien päällä verstaat, ylemmissä kerroksissa
asuinhuoneet ja varastohuoneet. Vasta myöhemmin alkoivat
varakkaammat porvarit rakentaa tiilestä tai luonnonkivestä ja
varustaa taloihinsa lasiakkunoita. Hitaammin edistyi sitä vastoin
kiveämättömien katujen puhdistaminen tunkioista ja karjasta ja niitä
ruvettiin siivoomaan ja valaisemaan. Mutta vaikka yksityisten
asunnot olivat näin yksinkertaiset, niin sitä komeammat olivat
julkiset rakennukset, sekä raatihuoneet että kirkot ja luostarit.
Ammattikunnat mieluimmin asuivat yhdessä samain katujen varsilla,
juutalaiset pakosta omassa erikoisessa kaupunginosassaan.
Maalaisolot keskiajan lopulla.
Kaupunkien hyötyessä maaseutu keskiajan lopulla oli tyhjempi
kuin konsanaan. Käsiteollisuus ja kauppa oli melkein kokonaan
kaupunkien hallussa, jota vastoin sekä aatelin että talonpoikain
toimeentulo perustui kokonaan luonnontalouteen. Rahan
lisääntyessä maantuotteitten hinta halpenemistaan halpeni, eivätkä
tästä kärsineet ainoastaan talonpojat, vaan myös maalla asuva
aateli. Sadottain joutuikin sen vuoksi vanhoja aatelissukuja rappiolle

ja heidän tiluksensa siirtyivät kaupunkien rahaylimystön käsiin.
Aatelin sotakuntoisuuskin oli huonontunut, he eivät enää kyenneet
kaupungeille puoliaan pitämään, ja ruhtinaatkin alkoivat tulla
toimeen ilman heitä. Yhä useampi sen vuoksi antautui rosvouteen,
häiriten teillä kaupunkilaisten kauppaa ja korjaten kavalilla
hyökkäyksillä anastetun saaliin linnoihinsa.
Raskaimman kuorman alaisina elivät tällä murrosajalla talonpojat.
Jo kauan he olivat olleet aseettomia ja turvattomia, muutamia
erikoisia maakuntia lukuun ottamatta. Väestön lisääntyessä oli maa
jaettava yhä pienempiin palstoihin. Maanviljelijät joutuivat
koronkiskurien käsiin, vajosivat maaorjuuteen. Siitä kehittyi
viidennellätoista vuosisadalla vaarallinen maalaisköyhälistö. Ritarit
lisäämistään lisäsivät talonpoikainsa verotaakkaa, sitä myöden kuin
heidän oma velkataakkansa kasvoi. Kamalimmilla rangaistuksilla
kiellettiin talonpoikaa vahingottamasta suurta metsänriistaa, vaikka
se tuhosi hänen vainioitaan ja karjojaan.
Tosin oli sekä järkeviä suurtilain omistajia että varakkaita
talonpoikiakin, mutta yleensä talonpoika kuitenkin tällä ajalla oli
kaikista yhteiskuntaluokista turvattomimmassa asemassa. Oman
kotikylänsä ahtaassa piirissä elämäänsä viettäen, kaikesta
korkeammasta sivistyksestä osattomana, hän vielä joutui yleisen
pilkankin alaiseksi, sen ajan kaupunkilainen kirjallisuus kuvaa häntä
kaiken tyhmyyden ja raakuuden perikuvaksi. Ranskassa ja
Englannissa oli talonpoika vähitellen osannut hankkia itselleen
vapautta ja itsenäisyyttä, Böhmin talonpojat varstoillaan voittivat
panssaroidut ritarijoukot, Sveitsissä he väkisin anastivat vapautensa
ruhtinaitten loistavilta ritarijoukoilta, mutta Saksassa he olivat
ylimystön orjia.

Ylenmäärin sorrettuna maalaisväestö sen vuoksi alkoi tehdä
kapinoita, aluksi varsinkin Lounais-Saksassa, jossa se ensinnä pääsi
maanihtinä vakinaisissa armeijoissa palvelemaan ja jälleen oppi
aseitten käytäntöä! Samoin kuin hussilaisuus, samoin nämäkin
kapinat perustuivat raamattuun. Kaikkialla syntyi salaliittoja,
saarnattiin väkivaltaista mullistusta, ruhtinaitten kukistamista ja
voimallisen keisarikunnan perustamista, joka suojelisi talonpoikia,
mutta kaikkialla nämä yritykset säälimättä tukahutettiin.
Mutta ne osottivat vallanpitäjille, että yhteiskunnan alimmissa
kerroksissa kiehui, ja että tämä liike vihdoin puhkeisi väkivaltaisiin
mullistuksiin. Kansan syvät rivit olivat kuitenkin vielä syvästi
uskonnollisia, ja siitä syystä tämä kumousliike sai uskonnollisen
luonteenkin. Sekin oli valmistanut tietä uskonpuhdistukselle. Toisia
syitä olivat tieteen ja valistuksen elpyminen yliopistoissa ja kirkon
yhä räikeämmäksi käyvä sisällinen rappeutuminen.
Uskonpuhdistuksen aika.
Samaan aikaan kuin Lounais-Europassa Espanjalaiset ja
Portugalilaiset löysivät uuden maailman ja meritien Intiaan, kuin
Italiassa paavilaisuus vahvisti maallista valtaansa, Roomaan
kohosivat komeat palatsit, taide kehittyi loistavimpaan
kukoistukseensa, tapahtui Saksassa uskonpuhdistus. Paavilaisuuden
monet väärinkäytökset olivat herättäneet sekä valistuneen tieteen,
että terveen kansan vihan, ja tällä pohjalla Martti Lutherin opetukset
levisivät, sytyttivät mielet, synnyttivät virtauksen, joka tempasi sekä
säädyt että ruhtinaatkin mukaansa.

Uskonpuhdistus.
Habsburgien valtakunta oli Kaarlo V:nnen aikana mahtavimmillaan.
Siihen kuuluivat Espanja, Burgundi, Italia ja Alankomaat ja lisäksi
Saksan valtakunta, joka kuitenkin jäi melkein sivumaaksi, koska
keisari yritti tehdä Espanjasta valtansa päämaan. Kaarlo V oli
katolisen uskon harras kannattaja. Mutta Saksan valtakunnan
hallitus, joka tähän aikaan sijaitsi Nürnbergissä, edisti siitä
huolimatta uskonpuhdistusta, ja jotenkin yksimielisesti asettuivat
säädyt samalle kannalle. Varsinkin Pohjois-Saksassa asetettiin kirkko
puhdistetun uskon pohjalle, katolisen kirkon laajat tilukset otettiin
takavarikkoon ja jaettiin protestanttisen kirkon, valtioitten ja
ruhtinaitten kesken. Mutta kun keisarin valta oli voitollisten sotien
kautta vahvistunut, niin aljettiin Lutherin saarnaamaa oppia vainota
ja Kaarlo V:nnen järkähtämätön aikomus oli saattaa Saksassa kaikki
ennalleen. Aluksi se hänelle onnistuikin. Mutta hallituksensa
loppuajalla hänen kuitenkin täytyi, vaikka vastahakoisesti, tunnustaa
Saksanmaan valtioille sisällinen uskonvapaus. Itse hän tappionsa
masentamana luopui vallasta, jakaen valtakuntansa siten, että hänen
veljensä Ferdinand sai Itävallan perintömaat ja Saksan keisarivallan,
hänen poikansa Filip Espanjan, Burgundin ja Italian. Saksanmaa
siten pääsi vapaaksi yhteydestään Italian ja Espanjan kanssa, joka
oli ollut sen sisälliselle kehitykselle turmioksi. Mutta sen kautta, että
uskonpuhdistus, joka oli koko kansan, varsinkin Pohjois-Saksan
omantunnon asia, oli keisarivallan puolelta kärsinyt kaikkea
mahdollista vastustusta, pienempäin maanruhtinaitten voimasta sitä
vastoin lopullisesti voittanut, juurtui Saksassa hajaannus yhä
syvemmin, saaden nyt sekä uskonnollista että kansallista tukea.
Saksan sisälliset olot.

Uskonpuhdistuksen ajalla sai Saksan kirjakieli varsinaisen
perustuksensa. Siinäkin oli Luther raamatunkäännöksensä ja
uskonnollisten kirjainsa, vieläpä uskonnollisen runoutensakin kautta
uran aukaisijoita. Tämä kirjakieli rakentui osaksi eteläsaksan kielelle,
jota keisarin hovissa käytettiin, osaksi Keski-Saksan ruhtinashoveissa
käytetylle keskisaksan kielelle. Mutta aivan suureksi ei saksankielen
valta kirjallisuudessa alkuaikoina päässyt, kauan piti latina puoliaan
niissäkin piireissä, jotka olivat hyväksyneet evankelisen opin.
Riippumatta uskonpuhdistuksesta kehittyivät tähän aikaan Italiasta
tulleitten vaikutusten nojalla monet taiteet. Rakennustaide alkoi
luopua kotiutuneesta gootilaisesta tyylistä ja italialainen
renessanssitaide, joka nojautui vanhoihin klassillisiin malleihin, alkoi
Saksassakin nopeaan levitä, muodostuen kuitenkin suuressa määrin
Saksan olojen mukaiseksi. Saksassa säilytettiin entisen
rakennusmallin korkeat harjat ja pystyt päädyt, nurkkaparvekkeet ja
tornit, ja ainoastaan rakennuksen jäsentely ja koristeet mukailivat
renessanssin muotoja. Baijeria hallitsevat Wittelsbachit rakensivat
sen tyylisiä linnoja Landshutiin, Müncheniin ja Heidelbergiin,
Württembergin ruhtinaat Stuttgartiin, Habsburgit varsinkin Praagiin,
Saksia hallitsevat Wettinit Torgauhin, Dresdeniin ja Augustusburgiin,
Hohenzollerit Berliniin, Mecklenburgin ruhtinaat Wismariin, ja
aatelikin, varsinkin yläsaksilainen, rakensi itselleen uusia upeita
linnoja, osasta Erzgebirgen ylempiin metsäseutuihin saakka.
Vanhoista kaupungeista varsinkin Augsburg etelässä ja Danzig
pohjoisessa rakennettiin suureksi osaksi uudelleen renessanssiajan
malliin. Tähän aikaan elivät myös Saksan kuuluimmat maalarit,
Dürer Nürnbergissä ja Holbein nuorempi Augsburgissa, Lukas
Cranach Frankissa. Erinomaisen korkealle kehittyi kaikenlainen
taideteollisuus, huoneitten sisustus, huonekalut, aseet, vaatteet,
kaikki sai entistä siromman taiteellisen käsittelyyn.

Mutta siitä huolimatta Saksanmaan taloudellinen elämä alkoi yhä
enemmän tyrtyä. Saksanmaa menetti kuudennentoista vuosisadalla
asemansa maailmankaupassa. Alkutuotanto tosin pysyi edelleenkin
melkoisena. Metsiä aljettiin paremmin hoitaa ja niistä saatiin
suunnattomat määrät puutavaroita. Vuoriteollisuus pysyi tuottavana
vuosisadan loppupuolelle saakka, mutta ehtyi sitten, kun jalommat
metallit oli jotenkin loppuun kaivettu. Mutta maanviljelystä alkoi yhä
enemmän rasittaa talonpoikain sorrettu tila, joka v. 1559
oikeudellisestikin joutui suuressa osassa Saksaa maaorjuuden
kannalle. Länsi-Saksan suurtilalliset, jotka etupäässä elivät
talonpoikain suorittamilla veroilla, lisäsivät veroja yhä enemmän.
Itäisissä uudisasutusmaissa taas ritaristo yhdisti talonpoikain maat
tiluksiinsa ja alkoi harjottaa suurviljelystä. Talonpoikainen väestö
menetti siellä viljelysvapautensakin, se oli maaomaisuuteen kuuluvaa
irtaimistoa.
Kaupungeissa käsiteollisuus riutui, sitä myöden kuin ulkomainen
kauppakin katosi. Siitä syystä ammattikunnatkin alkoivat yhä
tarkemmin rajottaa jäseniensä lukua ja vainota kaikkea vapaata
käsityötä. Sisämaan kaupassa vanhat suuret kauppa- ja
markkinapaikat, kuten Nürnberg, Frankfurt, Leipzig, Magdeburg,
Lüneburg, Hampuri, Breslau ja Stettin, taistelivat vanhan tie- ja
tapulioikeutensa puolesta. Mutta monen täytyi sitä varten entistä
enemmän turvautua ruhtinaihin, jotka muutoin uhkasivat kuristaa
kaupungit, erottamalla ne maaseudusta.
Keskiajalla oli maailmankauppa suureksi osaksi kulkenut Italiasta
Saksaan, saaden siellä syntymään suuria kauppakaupungeita,
niinkuin olemme ennen nähneet. Amerikan ja Intian meritien löydön
kautta kaupan suunnat muuttuivat. Espanjasta ja Portugalista tuli
Europan tärkeimmät kauppamaat. Saksanmaan kaupungit ottivat

alussa menestyksellä osaa sekä Amerikan että Intian kauppaan,
vaikka vasta toisessa kädessä. Tämä kauppaliike yhä vilkastui, kun
Saksa ja Espanja Kaarlo V:nnen aikana valtiollisestikin kuuluivat
yhteen. Welser-suku, Augsburgin rikas ylimyssuku, joka oli yhdessä
Fuggerien kanssa lainannut keisarille kaksitoista tynnöriä kultaa,
muun muassa sai Venezuelan espanjalaiseksi läänitykseksi. Fugger-
suku taas vallitsi Espanjan vuoriteollisuutta ja lainanantajina sen
rahamarkkinoitakin. Venezuela kuitenkin neljännesvuosisadan
kuluttua luovutettiin takaisin Espanjalle ja kun Lissabonin
kauppamahti aleni, Espanjan vallotettua Portugalin, niin Welser-suku
seitsemännentoista vuosisadan alkupuolella kukistui.
Alankomaat sitä vastoin, edullista maantieteellistä asemaansa
hyväkseen käyttäen, anastivat yhä suuremman sijan
merentakaisessa kaupassa. Brüggen jälkeen, jonka satama hiekottui,
oli Antwerpen kohonnut erinomaisen tärkeäksi kauppakaupungiksi,
Espanjalaisten kukistettua Antwerpenikin, Amsterdam.
Pohjoismaissakin alankomaalaisten kauppa nopeaan kehittyi, kun
Skandinavian maat olivat sen verran voimistuneet, että ne saattoivat
tehdä lopun Hansan pakollisesta kauppaylivallasta. Ruotsi uhkasi
katkaista saksalaisten kauppatiet, laskemalla valtansa alle yhä
enemmän Itämeren rantamaita. 1600:n vaiheilla Hollannin
kauppalippu vallitsi Itämerellä. Mutta Hollanti oli jo kokonaan
vieraantunut Saksan valtakunnasta. Hollannin ohella alkoi Englanti
voimistua ja liikkua merillä. Englantilaiset alkoivat nyt vuorostaan
tehdä kauppaa Saksan merisatamissa. Nämä koettivat saada sen
valtakunnan välityksellä estetyksi ja lainasivat Espanjalle laivoja ja
sotatarpeita Englannin nousevan kauppamahdin kukistamiseksi. Siitä
suuttuneena kuningatar Elisabeth v. 1597 sulki Hansan viimeisenkin
suuren kauppatoimiston, Lontoon teräshovin. Vanhoista
Hansakaupungeista piti puoliaan ainoastaan Hampuri, joka ei oman

etunsa vuoksi suuria välittänyt muusta Saksasta, ynnä Danzig, joka
ei edes valtakuntaan kuulunut, vaan eli Puolan turvissa.
Kahdeksi ja puoleksi vuosisadaksi Saksa siten suljettiin pois
maailmankaupasta. Tämä Saksan tulevaisuudelle tuhoisa kehitys oli
seurauksena valtakunnan heikontumisesta ja maanruhtinaitten vallan
vahvistumisesta.
Saksan maitten hallinnossa tapahtui tähän aikaan kuitenkin
edistyksiä. Oikeudenkäyttöä koetettiin saada yhtenäisemmälle
kannalle. Lait alkoivat ulottua kaikille elämän aloille, omaisuuden ja
hengen turvallisuus alkoi olla entistä parempi, virkamiehistö
muodostua ja hallinto kehittyä kirjalliselle pohjalle, syntyä
keskusvirastolta, jotka valvoivat virkamiesten toimia. Mutta
paikallishallinto pysyi edelleenkin enimmäkseen säätyjen käsissä.
Kaupungeissa sitä hoitivat kauppaylimykset, jotka alkoivat yhä
enemmän omistaa kirjallistakin sivistystä, maaseudulla aateli, jolla
varsinkin itäisissä osissa oli alempi hallinto-oikeus ja tuomarivalta,
kirkkojen ja koulujen isännyys, ja evankelisissa maissa suureksi
osaksi katolisen kirkon entinen omaisuuskin. Mutta vanhasta
sotilaallisesta itsenäisyydestään ja vaino-oikeudestaan aatelin täytyi
vähitellen luopua. Eri valtioissa olot kuitenkin kehittyivät suuressa
määrin eri tavalla. Varsinaisella kansalla vaan ei ollut missään mitään
oikeuksia.
Suurisuuntaiseen politikaan, jota Saksa silloin olisi tarvinnut,
tämmöinen valtakunta oli kykenemätön. Ei ollut yhteisiä päämääriä,
eikä yhteisiä keinoja niiden saavuttamiseksi. Sisälliset vastakohdat
saivat vapaasti versota. Vanhan valtiollisen yhteytensä, suurvalta-
asemansa menettänyt Saksan kansa joutui musertavan
kohtaloniskun uhriksi.

Uskonvainot. Kolmenkymmenen vuoden sota.
Evankelinen usko oli Kaarlo V:nnen hallituksen viimeisinä vuosina
saanut suurimmassa osassa Saksaa suvaitun aseman, Pohjois-
Saksassa siitä oli tullut maanuskonto. Seuraavina aikoina valtasi
mieliä lamaannus, evankelisissakin piireissä pääsivät valtaan sisälliset
uskonriidat, maalliset pyyteet heikonsivat taistelun synnyttämää
siveellistä voimaa. Sitä ankarammin katolilaisuus näinä jälkiaikoina
varustausi taisteluun, voittaakseen takaisin menetetyn valta-
asemansa. Jesuiittain veljeskunta perustettiin yksinomaan sitä
varten, ja pian se sai keisarin hovissa Wienissä ratkaisevan
vaikutusvallan. Mutta vielä enemmän keisarit valtiollisista syistä
rupesivat katolisen kirkon puolustajiksi. Kaarlo V:nnen lähimmät
seuraajat tosin koettivat ylläpitää uskonnollista rauhaa. Mutta
seitsemännentoista vuosisadan alussa oli jännitys kuitenkin kasvanut
niin pelottavaksi, että evankeliset ruhtinaat tekivät liiton yhteisiä
etuja puolustaakseen, katolilaiset taas liigansa, jonka tarkotus oli
katolinuskon palauttaminen kaikkialla. Evankelisten ruhtinaitten
puolella oli Ranska, katolisten Espanja. Kahden ulkovallan vaikutus
kilpaili Saksassa. V:sta 1608 evankeliset säädyt eivät enää ottaneet
osaa valtiopäivien töihin.
Kolmenkymmenen vuoden sota alkoi Böhmissä, jossa keisarit
väkivallalla koettivat tukahuttaa evankelisen opin. V. 1619 oli
Ferdinand II noussut valtaistuimelle ja hän otti katolilaisuuden asian
kokonaan omakseen. Böhmissä katolilaisuus asevoimalla saatettiin
kaikkialla jälleen voimaan. Sitten keisarin armeijat lähtivät Etelä-
Saksan evankelista kirkkoa tukahuttamaan. Protestanttinen liitto
nousi sopimuksensa mukaan uskoa puolustamaan, mutta sen toimet
olivat epäröiviä ja puuttuivat yksimielisyyttä ja tarmoa. Wallenstein
vallotti keisarin armeijan ylipäällikkönä vielä suurimman osan

Pohjois-Saksastakin ja suunnitteli jo sotaretkeä Ruotsiakin vastaan.
Keskellä näitä suuria tuumiaan hän kuitenkin kateellisten katolisten
ruhtinaitten vaatimuksesta sai eronsa. Tämän kautta keisarin
sotatoimet lamaantuivat, ja lisäksi saivat Saksan hätääntyneet
protestantit apua Ruotsilta. Kuningas Kustaa II Adolf nousi v. 1630
maihin Pommerin rannalle. Saksan evankelisetkin ruhtinaat
kuitenkin, epäillen Ruotsin valtiollisia tarkotuksia, kannattivat häntä
alussa heikosti. Breitenfeldtin loistava voitto, jossa Tilly perinpohjin
lyötiin, muutti yhdellä iskulla aseman Ruotsin eduksi. Koko Pohjois-
Saksa oli samalla vapautettu keisarillisesta sotaväestä, joka oli sitä
julmasti hävittänyt ja ryöstänyt. Sota siirtyi Böhmiin ja Etelä-
Saksaan. Entistä tehokkaammin ryhtyivät Pohjois-Saksan evankeliset
ruhtinaat nyt auttamaan Ruotsin armeijoja. Toiselta puolen Ranska,
jonka kanssa samat ruhtinaat olivat jo aikaisemmin silloin tällöin
olleet välipuheissa, teki Ruotsin kanssa liiton, auttaen sitä alussa
rahallisesti, myöhemmin armeijoillaankin. Se ei suinkaan tapahtunut
uskonpuhdistuksen harrastuksesta, vaan valtiollisista syistä.
Ranskalla oli etua siitä, ettei keisarivalta päässyt Saksassa
vahvistumaan, se sen vuoksi, mikäli saattoi, ylläpiti Saksan sisällistä
hajanaisuutta. Samaa politikaa on Ranska myöhemminkin uskollisesti
noudattanut.
Ruotsin armeijat — niiden mukana suomalaisetkin — vallottivat
pian koko Saksan ja uhkasivat jo keisarin perintömaita ja Wieniä.
Hädissään keisari silloin teki sovinnon Wallensteinin kanssa, tämä
kokosi armeijan ruotsalaisten selkäpuolella, Kustaa II Adolfin täytyi,
Nürnbergin pelastettuaan, kääntyä takaisin Saksiin, jossa hän
Lützenin kentällä (v. 1632) sai surmansa voitollisessa tappelussa.
Sodan seuraavassa vaiheessa pohjoissaksalaiset ruhtinaat,
etupäässä Brandenburg ja Saksi, pysyivät erillään sodasta,

heikontaen siten suuressa määrin Ruotsin sotatoimia. Sitä
tehokkaammin antoi kuitenkin Ranska apuaan. Vaihtelevalla onnella
käytiin sen jälkeen sotaa yli puolentoista vuosikymmentä, Saksan
maita kamalimmin hävitettiin. Sota oli, Ranskan siihen sekaannuttua,
saanut kokonaan valtiollisen luonteen. Lopulta keisari Ferdinand III
joutui niin ahtaalle, että hänen täytyi suostua rauhaan, joka tehtiin
Westfalin Münsterissä ja Osnabrückissä v. 1648. Tässä rauhassa
vakuutettiin Saksassa uskonnonvapaus, keisarin perintömaita lukuun
ottamatta, joissa katolinuskon väkivaltaista palauttamista jatkettiin.
Ranska sai osan Elsassista, Ruotsi Saksan valtakuntaan kuuluvana
läänityksenä osan Itämeren etelärannikosta, muun muassa Oderin
suistamon ja Stettinin kaupungin. Alankomaitten ja Sveitsin
itsenäisyys lopullisesti tunnustettiin. Saksalaisten ruhtinaittenkin
alueita jonkun verran vaihdeltiin, Brandenburg sai Taka-Pommerin,
Magdeburgin ja pienempiä alueita, Baijeri Ylä-Pfalzin. Mutta
tärkeämpi oli se seikka, että heille myönnettiin oikeus tehdä
ulkovaltain kanssa liittoja. Tosin säilytettiin valtakunnan valtiopäivät,
joissa paitsi vaaliruhtinaita ja muita maallisia ja hengellisiä ruhtinaita
ainoastaan valtakunnankaupungeilla oli edustajia, mutta valtiopäivät
olivat vielä entistäkin enemmän heikontuneet.
Ainoastaan nimi ja käsite oli Saksan valtakunnasta jäänyt jäljelle.
Todellisuudessa se ei enää ollut valtakunta, eikä edes valtioliittokaan.
Seuraavina aikoina näiden muutosten vaikutukset tulivatkin väleen
näkyviin. Brandenburg alkoi ennen muita esiintyä itsenäisesti
ulkomaitakin kohtaan ja voimistua voimistumistaan, kunnes siitä
varttui Preussin kuningaskunta.
Hävitetty Saksa.

Suunnattoman hinnan oli Saksan kansa saanut maksaa
uskonvapaudestaan. Se oli menettänyt kaiken valtiollisen mahtinsa,
joutunut naapurivaltain holhouksen alaiseksi, ja lisäksi se oli niin
perinpohjin hävitetty, että väestö oli vähentynyt kolmasosaan
entisestään. Suunnattomat määrät omaisuutta oli menetetty,
kokonaisia ammatinhaaroja oli saanut surmaniskun, kauhistuttava
raaistus päässyt valtaan, ulkomaalaisuus kaikilla aloilla tunkeutunut
ensi sijalle. Valtakunnassa, jossa 1620:n vaiheilla vielä oli 13
miljonaa asukasta, oli v. 1650 tuskin neljää miljonaa. Enemmän kuin
kaksitoistatuhatta kylää ja kaupunkia oli hävitetty. Monesta ei ole
meidän päiviimme nimeäkään säilynyt. Varsinkin Baijeri, Böhmi,
Schlesia, Württemberg, Elsass, Franki ja Hessi olivat sodan kautta
kärsineet. Pitkillä matkoilla ei ollut jäljellä ainoatakaan kylää. Vielä v.
1700 oli enemmän kuin kolmas osa ennen viljellystä maasta
mahona. Työvoimia puuttui melkein kaikkialla, raha ja tavara oli
maasta viety. "Ei koskaan ole suuri uudenaikainen kansa joutunut
niin kamalan kohtalon uhriksi!" huudahtaa eräs historiankirjottaja.
Kolmenkymmenen vuoden sota oli Saksan "Iso viha". Hansa oli
menettänyt mahtinsa tähteetkin; samoin kuin Hansa ennen
Pohjoismaissa, samoin nyt Pohjoismaat isännöivät Saksan rannoilla.
Danzig menetti suuren viljakauppansa. Etelä-Saksan kaupunkien
täytyi lakata kauppaa käymästä Italian kaupunkeihin. Näihin aikoihin
elpyi Rheinillä suurenmoinen tukinuitto, kun Alankomaitten rikkaat
kaupungit alkoivat tuottaa Schwarzwaldista puita laivain
rakentamiseen. Mutta melkein kokonaisen vuosisadan olikin tämä
tukinuitto melkein ainoa liike, mitä ennen vilkas Rhein välitti.
Kuitenkin olivat kaupungit sodan kautta kärsineet verraten
vähemmän kuin maaseutu. Muutamat Ylä-Saksan ja Rheinin
kaupungit olivat sodan kautta hyötyneetkin koronkiskomisen ynnä

sotamiesten ryöstämän tavaran ostamisen ja myymisen kautta.
Ryöstetty tavara myytiin hyvällä voitolla Alankomaihin.
Seuraavana pimeänä aikana, jolloin murha ja ryöstö olivat
jokapäiväisiä tapauksia, huolimatta äärettömän ankarista
rangaistuksista, tapahtuivat lukuisat noitain vainot, evankelisissa
maissa melkein vielä säälimättömämmällä julmuudella kuin
katolisissa. Oikeudenkäytössä kidutus kehittyi vielä julmemmaksi
kuin keskiajalla. Yliopistot pikemmin lisäsivät kuin heikonsivat
aikansa taikaluuloa.
Saksan kansan alennuksen aika.
Kolmenkymmenen vuoden sodan jälkeisinä aikoina saavutti
Ranska Saksan läntisissä maissa yhä lujemman jalansijan. Ludvig
XIV saattoi anastaa sekä koko Elsassin että Lothringin ja vielä
kamalammin kuin kolmenkymmenen vuoden sodassa hävittää koko
Ylä-Rheinin laaksoa. Saksan keisari kykeni tätä entistä vähemmän
estämään siitä syystä, että samaan aikaan Turkkilaiset idästä kohden
uhkasivat Habsburgien perintömaita, piirittäen jo Wieniäkin. Puolan
avulla tämä hyökkäys torjuttiin, Unkari vallotettiin takaisin. Saksin
vaaliruhtinas kääntyi katolinuskoon ja sai tämän kautta ajaksi Puolan
valtaistuimen, kunnes Ruotsin kuningas Kaarlo XII pakotti hänet siitä
luopumaan. Brandenburgin vaaliruhtinas v. 1701 kruunasi itsensä
sukumaana perimänsä Preussin kuninkaaksi, mutta piti kuitenkin
edelleenkin Brandenburgin vaaliruhtinaskuntaa varsinaisena
päämaanaan. Hannover sitä vastoin, jonka vaaliruhtinas
perimäoikeuden nojalla v. 1714 nousi Englannin valtaistuimelle,
joutui personali-unioniin Englannin kanssa ja oli vuoteen 1837
muusta Saksasta erotettuna.

Saksan ruhtinashoveissa pääsi 18:lla vuosisadalla yhä enemmän
valtaan ranskalainen ylellisyys, ranskalainen vaateparsi ja tapa,
mutta ne eivät saavuttaneet ranskalaista hienostusta, vaan kuluttivat
alamaisilta kiskomansa rahat ylellisyyteen. Tuhlauksessa varsinkin
Saksi antoi muille esimerkkiä. Preussi kuitenkin oli poikkeus, Preussin
hallitsijat isällisellä huolenpidolla omistivat voimansa maan
taloudellisen tilan parantamiselle. Ja vaikka tämän nousevan
valtakunnan alueet olivat niin hajallaan, jopa aivan toisistaan
erotettuina, niin pääsi se kuitenkin siihen määrään voimistumaan,
että siitä oli tuleva Saksan valtakunnan perustus. Tämä oli varsinkin
"suuren vaaliruhtinaan" Fredrik Vilhelmin ansio (1640-88). Samalla
kuin Preussin hallitsijat noudattivat sekä valtion taloudessa että
omassakin taloudessaan mitä suurinta säästäväisyyttä, he käyttivät
kaikki liikenevät varansa melkoisen armeijan ylläpitämiseen. V. 1740
Preussi Tukholman rauhassa sai Oderin suistamon ja Stettinin
kaupungin. Varsinkin Fredrik II (1740-86) kohotti valtaavasti
Preussin sekä sisäistä että ulkonaista voimaa. Hän kuivatti soita,
levitti asutusta, auttoi alamaisiaan vaikeissa oloissa, mutta kävi
samalla menestyksellä sotia, päämääränään Preussin kohottaminen
Saksan johtavaksi vallaksi. Puolalta hän riisti Länsi-Preussin,
Itävallalta Schlesian. Loistavien voittojensa kautta usein
ylivoimaisista vihollisista, murtumattoman sitkeytensä kautta
raskaimmissakin vastoinkäymisissä Fredrik II kohotti Preussin kansan
itseluottamusta ja kansallistuntoa, teki maastaan suurvallan.
Menestyksellä hän esti Itävaltaa enää saamasta Saksan nimellisessä
valtakunnassa takaisin entistä mahtiasemaansa. Puolan ensimäisessä
jaossa Preussi sai Länsi-Preussin ja osan Suur-Puolaa, toisessa
Danzigin ja Thornin sekä loput Suur-Puolasta. Kansansa
valistumisestakin piti tämä itse erinomaisen valistunut ruhtinas
huolta.

Mutta Fredrik II:sen seuraajain aikana Preussi jälleen rapistui,
vaikkei siihen määrään kuin jotkut muut Saksan pienistä valtioista,
joiden ruhtinaat, saadakseen rahoja ylelliseen hovinpitoon, möivät
alamaisiaan sotamiehiksi ulkomaille, varsinkin Englantiin. Niinpä
myytiin Amerikkaan 30,000 saksalaista tappelemaan Yhdysvaltoja
vastaan. Muista pienistä hoveista oli Weimarin hovi loistava poikkeus.
Se oli Saksan kohoovan runouden suojelija, siellä saivat sekä Schiller
että Göthe että monet muut Saksan klassillisen ajan runoilijat
tyyssijan ja toimeentulon.
Mutta Saksanmaan aineellinen vaurastuminen 18:lla vuosisadalla
yleensä edistyi melkoisesti. Vuosisadan loppupuoliskolla ryhtyivät
valistuneimmat valtiomiehet toimiin maaorjuuden lakkauttamiseksi.
Perustettiin ensimäiset maanviljelysopistot, maanviljelysyhdistykset,
maanviljelyskirjallisuuden perusteet laskettiin. Kaupungit vähitellen
vaurastuivat Kolmenkymmenen vuoden sodan hävityksistä,
vaikkeivät enää saavuttaneetkaan keskiaikaista mahtiansa. Kauppaa
rasittivat sisämaan tullit, joita oli niin tiheässä, että esim. laivan, joka
kulki Rheiniä pitkin Strassburgista Hollantiin, täytyi välillä maksaa
tullia 30 tulliasemalla. Weserillä oli 19, Elbellä 35, Mainilla 33
tulliasemaa. Edullisesti taas vaikutti liikkeeseen se, että
muuttovapaus vähitellen alkoi tulla tunnustetuksi. Sitä ennen ei
alamainen saanut muuttaa toisesta Saksankaan maasta toiseen
ilman lupaa, josta usein vaadittiin melkoinen vero. Saksanmaan
väkiluku kohosi puolessatoista vuosisadassa (1650-1800) 4
miljonasta 26 miljonaan. Mutta Saksalaisilla ei enää ollut samaa
toimintatarmoa kuin edellisinä vuosisatoina. Ennen oli edes
kaupungeilla ollut melkoinen vapaus. Valtioiden kehityttyä täydellisen
itsevaltiuden kannalle ei sitä vapautta enää ollut millään
kansanluokalla.

LC MS in Drug Analysis Loralie J Langman Christine L H Snozek

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

LC MS in Drug Analysis Loralie J Langman Christine L H Snozek

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 3

Slide 4

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

TLE-9-Prepare-Salad-and-Dressing.pptxkkk

LESSON 1 ABOUT MEDIA AND INFORMATION.pptx

GRADE-8-AQUACULTURE-WEEKQ1.pdfdfawgwyrsewru

Feelings PP Game FOR CHILDREN IN ELEMENTARY SCHOOL.pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech_Template.pptx [Autosaved].pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech.pptxvdsvdsvsdvsd