Métodos en microbiología

Es una descripción breve de las condiciones necesarias para el crecimiento de un cultivo de microorganismos y los métodos para su conteo.

1. MÉTODOS EN MICROBIOLOGÍA Aislamiento y cultivo de microorganismos, medios de cultivo, factores que influyen sobre el crecimiento microbiano: requerimientos nutricionales y fisicoquímicos.

2. Nutrición microbiana y medios de cultivo. Cuando necesitamos crecer y analizar los microorganismos requerimos del empleo de los medios de cultivo, los cuáles buscan crecerlo simulando lo mejor posible las condiciones de vida del mismo en el medio natural.

3. Factores ambientales pH. Temperatura: Organismos hipertermófilos (t>75°C), termófilos (t>55°C), mesófilos (20<t<45°C) y psicrófilos o criófilos (t<10°C) Oxígeno: Aerobios, anaerobios facultativos, anaerobios. CO 2 Presencia de agua líquida. Presión atmosférica, hidrostática y osmótica. Radiación electromagnética. Potencial redox . Para el desarrollo de un microorganismo además de los requerimientos nutricionales, existen un gran número de factores ambientales que influyen sobre el crecimiento, supervivencia y actividades metabólicas de los microorganismos.

4. Esterilización. Proceso que permite liberar todos los materiales empleados para el aislamiento y cultivo de microorganismos. Se puede llevar a cabo de varias formas: Agentes antimicrobianos físicos. Agentes antimicrobianos químicos. Calor Radiaciones Filtración Alcoholes y fenoles. Halógenos peróxidos Metales pesados Gases Detergentes

5. Cultivo y aislamiento de microorganismos CULTIVO : poblaciones bacterianas con millones de individuos. CULTIVO MIXTO : Es el que contiene varios tipos de microorganismos creciendo juntos. CULTIVO PURO O AXÉNICO : Es el que contiene una sola clase de microorganismo. AISLAMIENTO : Proceso que permite separar un microorganismo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. Para el aislamiento de microorganismos se pueden emplear medios sólidos o líquidos.

6. Medios de cultivo líquidos : No contienen ningún agente solidificante . El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. Medios de cultivo semisólidos : Contienen una pequeña cantidad de agar, unos 3 g/litro . Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.

7. Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante . Los más utilizados son la gelatina y el agar en una proporción de unos 12-15 g/litro. Son sólidos por debajo de 45 °C. Por encima de esta temperatura de encuentran en estado líquido.

8. Medidas directas del crecimiento microbiano   Recuentos en placa o de colonias Es el método más usado para medir poblaciones bacterianas, ya que a diferencia de otros permite contabilizar el crecimiento de células viables, es decir células que pueden dar una descendencia. Es muy usado en la microbiología de alimentos, pero puede ser impreciso cuando se toman muestras naturales, como por ejemplo el suelo; donde no todos los microorganismos a pesar de estar presentes en la misma muestra podrán crecer en el medio de cultivo seleccionado dado a la diferencia de requerimientos nutricionales.   En la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofía (inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

9. Filtración Es un método muy usado en microbiología de aguas cuando la concentración de bacterias presentes en la muestra es muy baja. Para la filtración por membranas 100 ml de agua atraviesan un filtro con poros muy pequeños que no pueden pasar las bacterias, las cuales se quedan en la superficie del filtro, éste se transfiere a una almohadilla con medio de cultivo donde las colonias pueden crecer y con una incubación previa hacer el recuento. Es una técnica muy usada para detectar y cuantificar bacterias de contaminación fecal ( coliformes fecales).

10.   Método de extensión en placa Se coloca un volumen de inóculo no superior a 0.1 ml (100 µl) sobre la superficie de un medio de cultivo y se extiende uniformemente por toda la placa con un asa o varilla de vidrio estéril hasta que el medio lo absorba por completo, posteriormente se incuba a una temperatura determinada hasta que aparezcan las colonias y así realizar el recuento. Método de placa vertida Sobre una placa estéril sin medio de cultivo se agrega cierto volumen del inóculo (0.1 – 1.0 ml) al que se añade el medio de cultivo con una temperatura de 45 o 50 °C, luego se agita suavemente la placa para mezclar, después que el agar se solidifica y se incuba las colonias crecerán y en la superficie del agar. El principal inconveniente de este método es que ciertos microorganismos sensibles al calor pueden verse dañados por la temperatura del agar fundido.

11. Método de diluciones seriadas Cuando una muestra contenga muchos microorganismos que superen las 300 UFC se recomienda realizar diluciones seriadas que faciliten el conteo y permita obtener resultados confiables; luego de las diluciones se siembran las placas y se procede a hacer el conteo del número de colonias que debe ser multiplicado por el factor de dilución para obtener las UFC por mililitro de muestra original . Método de diluciones seriadas para recuento en placa de colonias (tomado de Tortora et al. 2007).

12. Recuento microscópico directo En esta técnica un volumen definido se coloca en un portaobjetos para luego ser observado al microscopio. El método de recuento de Breed es muy usado en la industria láctea, en éste se colocan 0.01 ml de muestra sobre un portaobjetos con un recuadro de 1 cm 2  que se tiñe con un colorante para luego contar las células observadas con el objetivo de 100X, al final el número de bacterias contadas se multiplica por 100. Los recuentos microscópicos también se realizan usando la cámara de Petroff-Hausser ; estos métodos no requieren tiempo de incubación (Tortora et al. 2007). Entre las principales desventajas del recuento directo tenemos: se pueden contar células muertas y vivas, dificulta el conteo de bacterias móviles, se requieren concentraciones de bacterias adecuadas

13. Medidas indirectas del crecimiento microbiano. L os métod os indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. Entre los más conocidos tenemos:  

14. Recuento de viables en placa. Este método consiste en sembrar cajas de petri con 1 ml de muestra (y de sus diluciones) y agregar de 10 a 12 ml de agar nutritivo estéril fundido (teniendo la precaución de dejarlo enfriar hasta 44-46 grados). Se mezcla rápidamente y, una vez solidificado el agar, se incuban las placas durante 7 días a 20 grados C.

15. Recuento en filtros de membrana.

16. Recuento del NMP: Número más probable. El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes .

17. Tabla 8.7. Métodos de determinación del número de microorganismos. Método Microorganismos para los que se utiliza Tipo de recuento Usos / Limitaciones Indirecto       Turbidez La mayoria de las bacterias y levaduras Total Determina la turbidez con un espectrofotómetro; rápido y reproducible; la suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se requiere una curva patron Peso seco Cualquier microorganismo Total Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible Actividad metabólica Cualquier microorganismo viable Viables Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con materiales complejos Directo       Recuento microscópico Cualquier microorganismo unicelular Total Muy útil para el recuento de un tipo de células de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Recuento electrónico Cualquier microorganismo unicelular Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico ; rápido y preciso; no debe estar presente material extralio Recuento en placa Cualquier microorganismo unicelular viable Viables Muy sensible - puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de colonias Numero más problable Cualquier microorganismo viable Viables Utilizado para microorganismos que son dificiles de cultivar en medio sólido y para determinar contaminación por  Escherichia coli  en aguas; requiere un cierto tiempo Filtración Cualquier microorganismo viable Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeño número de células a partir de grandes volúmenes de un líquido o de un gas

18. Bibliografía y webgrafía . http://www.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/02.pdf http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/exe/leccin_18_medidas_directas_del_crecimiento_microbiano.html aulavirtual.usal.es http://www.faciasuncoma.com.ar/Carreras/Saneamiento%20Ambiental/MicrobiologiaAmbiental/8%20RECUENTO.pdf http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-3.htm http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&id=464&Itemid=526