Ôn tập Tin sinh học thực hànhhhhhhhhh.pptx

mmmmmmm

1. ÔN TẬP TIN SINH HỌC THỰC HÀNH METAGENOMICS Từ Buổi 3 – Buổi 4 Giảng viên: TS. Ngô Vương Quốc Hoàng Người soạn: Kiều Công Trí

2. THỰC HÀNH Metagenomics Metabarcoding 16S – Short reads Dữ liệu được cho:  DNA từ mẫu ủ Methanol đã được giải trình tự nhưng chưa xử lý Mục tiêu thực hành: Biết được hệ vi sinh nuôi ủ trong Methanol thay đổi như thế nào? Gồm những vi sinh vật gì? Số lượng ra sao? Mối quan hệ tương tác như thế nào?

3. metadata

4. Quy trình chung giải trình tự trên Galaxy.fr Thông qua các bước và giai đoạn như sau: Preprocess  Clustering  Chimera  Filter  Affiliation  ... (Tùy mục đích)

5. Giai đoạn làm sạch trình tự Giai đoạn phân tích tin sinh, phân tích thống kê Một quy trình Tin sinh học gồm có:

6. Quy trình tối thiểu khi phân tích trình tự hệ vi khuẩn 16S Bacteria

7. Quy trình tối thiểu khi phân tích trình tự hệ vi nấm

8. Các công cụ FROGS sử dụng để phân tích tin sinh học

9. OTU = Cluster = Nhóm trình tự có tương đồng = 1 loài nghi ngờ ASV = Cluster = Nhóm trình tự có tương đồng = 1 loài, đã trải qua lọc nên độ chính xác cao hơn Abundance có nghĩa chung là “số lượng”, có lúc thể hiện cho số lượng trình tự sequence, có lúc thể hiện cho số lượng nhóm (cụm) trình tự cluster.

10. Amplicon sequencing là: 👉 Giải trình tự các đoạn DNA được nhân bản (amplicon) bằng PCR . Amplicon : là đoạn DNA đặc hiệu được khuếch đại bởi PCR từ một vùng mục tiêu (ví dụ: vùng gene 16S rRNA của vi khuẩn, ITS của nấm, hay gene COI của động vật). Amplicon sequencing : sau khi PCR khuếch đại các vùng mục tiêu, các amplicon này được đưa vào máy giải trình tự (thường là công nghệ NGS như Illumina, Ion Torrent…) để đọc hàng loạt. 📌 Trong sinh học môi trường và metagenomics: Amplicon sequencing thường dùng 16S rRNA gene (cho vi khuẩn), ITS (cho nấm), hoặc 18S rRNA gene (cho sinh vật nhân thực). Nó cho phép xác định đa dạng vi sinh vật trong mẫu mà không cần phải nuôi cấy. Ví dụ: Nghiên cứu cộng đồng vi sinh trong nước thải, đất, ruột người bằng cách giải trình tự vùng 16S rRNA.

11. Các công cụ FROGS sử dụng để phân tích thống kê

12. Chức năng của các FROGS Mỗi FROGS sẽ có: Lý thuyết Đọc kết quả và biện luận

13. FROGS_0: Demultiplex reads

14. FROGS_1: Pre-process Merging → Ghép cặp (trộn/ghép đọc) Dùng để ghép read trước và sau (forward & reverse reads) trong dữ liệu giải trình tự đôi (paired-end sequencing) thành một chuỗi đầy đủ. Denoising → Khử nhiễu Loại bỏ lỗi ngẫu nhiên sinh ra trong quá trình giải trình tự, giúp phân biệt đâu là biến thể thật sự của trình tự ADN và đâu chỉ là lỗi kỹ thuật. Dereplication → Khử trùng lặp (gom nhóm trùng lặp) Gom các trình tự giống hệt nhau thành một, đồng thời ghi nhận số lần xuất hiện. Điều này giảm kích thước dữ liệu và tăng hiệu quả xử lý.

15. Thực hành

16. Danh sách mồi 16S primers

17. Output: Gom các trình tự giống nhau thành một Kết quả Số lượng trình tự ở các mẫu

18. dereplicate.fasta

19. count.tsv

20. report.html

21. FROGS_2: Clustering swarm 👉 Phân cụm liên kết đơn trên các chuỗi (trình tự) Single-linkage clustering : phương pháp phân cụm liên kết đơn (còn gọi là nearest neighbor clustering ), trong đó khoảng cách giữa hai cụm được định nghĩa bằng khoảng cách nhỏ nhất giữa một cặp điểm thuộc hai cụm. On sequences : áp dụng trên các chuỗi (ví dụ: chuỗi DNA, RNA, protein, hoặc dữ liệu dạng chuỗi ký tự/thời gian) .

22. Số bản sao gene trải rộng hơn một bậc độ lớn , từ 1 đến khoảng 15 ở vi khuẩn (Bacteria), nhưng chỉ tối đa 5 ở vi khuẩn cổ (Archaea). Chỉ một phần nhỏ bộ gene vi khuẩn chứa các bản sao gene 16S rRNA giống hệt nhau. Độ đa dạng trình tự tăng khi số bản sao gene tăng lên. Trong khi một số taxon chứa các gene 16S rRNA khác biệt nhau, thì những nhóm khác lại có các trình tự chung cho nhiều loài. Số lượng bản sao gene 16S biến đổi . Có sự đa dạng trình tự trong cùng một loài . Một số trình tự 16S là đặc trưng chung cho nhiều loài , và mức độ đa dạng trình tự khác nhau giữa các ngành (phyla) .

23. Quy trình 2 bước để "Gain time!" và "Remove false positives!" FROGS thực hiện phân cụm theo hai bước để tăng tốc độ và loại bỏ các kết quả dương tính giả (false positives). 1. 1st run for denoising: (Lần chạy đầu tiên để khử nhiễu) Swarm with d = 1 -> high clusters definition: Lần chạy đầu tiên sử dụng khoảng cách rất nhỏ ( d=1 ). Mục đích: Để tạo ra các cụm ban đầu với định nghĩa rất chặt chẽ. Các trình tự khác biệt chỉ một nucleotide (điểm khác biệt) sẽ được nhóm lại. Bước này được coi là "khử nhiễu" (denoising) vì nó loại bỏ các lỗi đọc trình tự nhỏ nhất. linear complexity : Quá trình này rất nhanh. 2. 2nd run for clustering: (Lần chạy thứ hai để phân cụm) Swarm with d = 3 on the seeds of first Swarm: Lần chạy thứ hai sử dụng khoảng cách lớn hơn ( d=3 ) nhưng chỉ trên các trình tự "hạt giống" (seed sequences) đã được tạo ra ở bước đầu tiên. Mục đích: Nhóm các cụm nhỏ đã được tạo ra ở bước 1 thành các cụm lớn hơn, dựa trên khoảng cách d=3 . Vì nó chỉ hoạt động trên các trình tự hạt giống (số lượng ít hơn nhiều so với dữ liệu ban đầu), quá trình này hiệu quả hơn nhiều. quadratic complexity : Mặc dù phức tạp hơn lần chạy đầu, nhưng vì số lượng dữ liệu đầu vào đã giảm đi đáng kể, nó vẫn hiệu quả. Kết quả: Gain time! (Tiết kiệm thời gian!): Thực hiện hai bước này giúp quá trình phân cụm nhanh hơn đáng kể so với việc chạy trực tiếp với d=3 trên toàn bộ dữ liệu thô. Remove false positives! (Loại bỏ dương tính giả!): Bước khử nhiễu ban đầu giúp loại bỏ các trình tự lỗi do sai sót trong quá trình giải trình tự, dẫn đến kết quả phân tích chính xác hơn.

24. Thực hành

25. Output: Ba tệp này là kết quả của công cụ FROGS Clustering swarm trong Galaxy.fr, một công cụ phổ biến để phân tích dữ liệu giải trình tự 16S rRNA. Tóm lại, các tệp này dùng để nhóm các trình tự DNA (reads) giống nhau thành các đơn vị phân loại (như OTUs hoặc ASVs) và ghi lại thành phần cũng như độ phong phú của chúng. swarms_composition.txt Tệp này cung cấp thông tin chi tiết về thành phần của từng nhóm (swarm) hoặc cụm. Nó liệt kê các trình tự DNA riêng lẻ đã được gộp lại để tạo thành một cụm duy nhất. Mỗi dòng trong tệp thường chứa ID của một trình tự đại diện (seed sequence) và các ID của tất cả các trình tự con đã được nhóm vào cụm đó. Tệp này hữu ích để kiểm tra các trình tự nào đã được nhóm lại với nhau, giúp bạn hiểu rõ hơn về cách các cụm được hình thành. clustering_abundance.biom Đây là tệp quan trọng nhất. Tệp .biom (Biological Observation Matrix) là một định dạng chuẩn được sử dụng trong sinh học để lưu trữ dữ liệu đa dạng sinh học. Tệp này chứa một ma trận độ phong phú (abundance matrix) cho biết số lượng trình tự (reads) của mỗi đơn vị phân loại (OTU/ASV) có trong mỗi mẫu. Hàng (Rows): Đại diện cho các đơn vị phân loại (OTUs hoặc ASVs). Cột (Columns): Đại diện cho các mẫu (samples) của bạn. Các giá trị trong ma trận: Thể hiện số lượng (abundance) của một đơn vị phân loại cụ thể trong một mẫu cụ thể. Tệp này là đầu vào chính cho các bước phân tích tiếp theo, chẳng hạn như phân loại loài (taxonomy assignment) và tính toán đa dạng sinh học (diversity analysis). seed_sequences.fasta Tệp này chứa các trình tự đại diện (representative sequences) cho mỗi cụm đã được tạo ra. Khi các trình tự được nhóm lại thành một cụm, một trình tự "hạt giống" (seed sequence) sẽ được chọn làm đại diện cho toàn bộ cụm đó. Tệp này có định dạng FASTA, nghĩa là mỗi trình tự DNA được bắt đầu bằng một dòng tiêu đề (thường là ID) và theo sau là chính trình tự đó. Tệp này thường được sử dụng làm đầu vào cho bước phân loại loài (taxonomy assignment) để xác định loài tương ứng với từng cụm.

26. seed sequence.fasta Dòng cuối cùng trong file Word gần 3700 trang xuất từ file seed sequence Lưu ý: Số lượng cluster không đếm được trong file này, mà xác định bằng cách khác. Số lượng trình tự vẫn giữ nguyên so với ban đầu vì FROGS_2 là bước tạo nhóm các trình tự. Đừng tải file, tải thì đợi 10-15 phút để ổn định

27. clustering abundance.biom

28. swarms composition.txt Cứ mỗi dòng là 1 cluster (nhóm trình tự)

29. FROGS_3: Remove chimera 👉 Loại bỏ các sản phẩm lai giả (chimera) do PCR tạo ra trong từng mẫu PCR chimera : là các trình tự lai giả được hình thành khi các đoạn DNA từ những bản sao khác nhau gắn nhầm với nhau trong quá trình PCR. Remove … in each sample : loại bỏ chúng ra khỏi từng mẫu dữ liệu hoặc từng mẫu thí nghiệm.

30. Chiến lược phát hiện Chimera (Chimera detection strategies) Dựa trên cơ sở dữ liệu tham chiếu (Reference based): so sánh với một cơ sở dữ liệu các trình tự “chuẩn xác” (genuine sequences). De novo: so sánh với các trình tự có tần suất phong phú trong mẫu. Sử dụng thiết kế thí nghiệm thông minh (Using a smart experimental design): áp dụng khi có thể.

31. Tỷ lệ Chimera tồn tại trong mẫu tùy vào chất lượng của mẫu, có thể dao động từ 40% trở lên (số trình tự) theo như bài giảng

32. Thực hành

33. Output: report.html Tệp này là một báo cáo tóm tắt bằng định dạng HTML, trình bày kết quả của quá trình loại bỏ trình tự lai. Báo cáo thường bao gồm: Tổng số trình tự được phân tích. Số lượng và tỷ lệ phần trăm trình tự được xác định là trình tự lai. Số lượng trình tự được giữ lại (trình tự không phải lai). Tệp này giúp bạn nhanh chóng đánh giá hiệu quả của bước loại bỏ trình tự lai và xem có bao nhiêu dữ liệu đã bị loại bỏ. non_chimera_abundance.biom Đây là tệp ma trận độ phong phú (abundance matrix) ở định dạng .biom , nhưng chỉ chứa dữ liệu của các trình tự đã được xác định là không phải lai . Hàng (Rows): Các đơn vị phân loại (OTUs/ASVs) đã được lọc. Cột (Columns): Các mẫu. Giá trị: Số lượng (abundance) của các trình tự không phải lai trong mỗi mẫu. Tệp này là phiên bản đã được "làm sạch" của tệp clustering_abundance.biom từ bước trước, và sẽ được sử dụng cho các phân tích tiếp theo, chẳng hạn như phân loại loài và phân tích đa dạng sinh học. non_chimera.fasta Tệp này chứa các trình tự đại diện (representative sequences) ở định dạng FASTA sau khi đã loại bỏ các trình tự lai. Nó chỉ bao gồm các trình tự "hạt giống" (seed sequences) đã được xác nhận là không phải lai. Tệp này rất quan trọng vì nó là đầu vào cho bước phân loại loài (taxonomy assignment) để gán tên khoa học cho từng trình tự.

34. non chimera.fasta

35. non chimera abundance.biom

36. report.html

37. FROGS_4: Cluster filters 👉 Lọc các cụm dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau . Filters : lọc, chọn lọc, loại bỏ. Clusters : các cụm (ví dụ cụm trình tự, cụm dữ liệu). On several criteria : dựa trên nhiều tiêu chí (ví dụ kích thước cụm, mức độ tương đồng, số lượng trình tự trong cụm…).

38. Thực hành

39. Output: Bốn tệp này là kết quả của công cụ FROGS Cluster filters trong Galaxy.fr, một bước quan trọng để tinh chỉnh dữ liệu sau khi phân cụm và loại bỏ trình tự lai. Mục tiêu là loại bỏ các cụm (clusters) không đáng tin cậy hoặc không mong muốn dựa trên các tiêu chí nhất định, giúp làm sạch dữ liệu để phân tích tiếp theo. Ý nghĩa của từng tệp: 1. report.html Ý nghĩa: Tệp này là một báo cáo tóm tắt bằng định dạng HTML về toàn bộ quá trình lọc cụm. Nó cung cấp thông tin chi tiết về các bộ lọc đã được áp dụng và số lượng cụm (hoặc trình tự) đã được giữ lại và loại bỏ. Mục đích sử dụng: Giúp người dùng nhanh chóng hiểu được có bao nhiêu dữ liệu đã bị loại bỏ ở bước này và các tiêu chí lọc đã hoạt động như thế nào. Ví dụ, nó có thể cho biết có bao nhiêu cụm bị loại bỏ vì quá ít trình tự, hoặc vì quá ngắn/dài. 2. excluded.tsv Ý nghĩa: Tệp này chứa danh sách các cụm (cluster IDs) hoặc trình tự đã bị loại bỏ (excluded) bởi các bộ lọc. Nó thường cung cấp lý do loại bỏ (ví dụ: quá ít trình tự, chiều dài không phù hợp, v.v.). Mục đích sử dụng: Hữu ích để kiểm tra lại những gì đã bị loại bỏ. Nếu bạn thấy quá nhiều cụm quan trọng bị loại bỏ, bạn có thể cần điều chỉnh lại các tham số lọc. 3. clusterFilters_sequences.fasta Ý nghĩa: Tệp này chứa các trình tự đại diện (representative sequences) ở định dạng FASTA, nhưng chỉ những trình tự thuộc các cụm đã vượt qua tất cả các bộ lọc . Nó là phiên bản đã được lọc của tệp non_chimera.fasta từ bước trước. Mục đích sử dụng: Đây là tập hợp các trình tự đáng tin cậy sẽ được sử dụng làm đầu vào cho bước phân loại loài (taxonomy assignment) tiếp theo. 4. clusterFilters_abundance.biom Ý nghĩa: Đây là ma trận độ phong phú (abundance matrix) ở định dạng .biom , nhưng chỉ chứa dữ liệu của các cụm đã vượt qua tất cả các bộ lọc . Các cụm bị loại bỏ sẽ không còn xuất hiện trong ma trận này. Mục đích sử dụng: Đây là dữ liệu độ phong phú đã được làm sạch và tinh chỉnh cuối cùng, sẵn sàng cho các phân tích sâu hơn về đa dạng sinh học, thành phần cộng đồng và so sánh giữa các mẫu. Nó là đầu vào quan trọng cho các công cụ thống kê và trực quan hóa. Tóm lại, bước "Cluster filters" đảm bảo rằng chỉ có các cụm chất lượng cao và đáng tin cậy nhất được giữ lại để phân tích tiếp, giúp giảm thiểu nhiễu và cải thiện độ chính xác của kết quả.

40. report.html Độ phong phú thấp Nằm trong cơ sở dữ liệu tạp nhiễm

41. excluded.tsv

42. clusterFilter sequence.fasta

43. clusterFilter abundance.biom

44. FROGS_5: Taxonomic affliation 👉 Gán định danh phân loại (taxonomic affiliation) cho từng trình tự hạt nhân (seed) của ASV bằng RDPtools và BLAST. ASV (Amplicon Sequence Variant): biến thể trình tự amplicon, đơn vị cơ bản dùng trong phân tích 16S/ITS hiện đại (tương tự OTU nhưng độ phân giải cao hơn). Seed: trình tự đại diện (trung tâm) của một ASV. Taxonomic affiliation: gán tên phân loại (tới cấp loài, chi, họ…) cho trình tự. RDPtools: công cụ phân loại dựa trên cơ sở dữ liệu Ribosomal Database Project. BLAST: công cụ so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu chuẩn (NCBI, SILVA, Greengenes…). 📌 Nói đơn giản: đây là bước so khớp trình tự ASV với cơ sở dữ liệu để xác định nó thuộc vi khuẩn/vi sinh vật nào.

45. Thực hành

46. Output: report.html Ý nghĩa: Tệp này là một báo cáo tóm tắt bằng định dạng HTML về quá trình gán tên phân loại. Nó thường bao gồm: Tổng số cụm/ASV đã được gán tên. Tỷ lệ phần trăm các cụm/ASV được gán ở các cấp độ phân loại khác nhau (ví dụ: đến giới, ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài). Thông tin về cơ sở dữ liệu phân loại đã sử dụng (ví dụ: Silva, Greengenes, RDP). Có thể bao gồm biểu đồ tóm tắt trực quan về sự phân bố của các loài được xác định. Mục đích sử dụng: Giúp người dùng đánh giá chất lượng và mức độ thành công của quá trình gán tên phân loại. Bạn có thể biết được bao nhiêu phần trăm trình tự được gán đến cấp độ loài, hay chỉ dừng lại ở cấp độ ngành, từ đó đánh giá độ phân giải của dữ liệu affiliation_abundance.biom Ý nghĩa: Đây là ma trận độ phong phú (abundance matrix) cuối cùng ở định dạng .biom (Biological Observation Matrix), đã được bổ sung thông tin phân loại. Các hàng (Rows): Bây giờ không chỉ là các ID cụm/ASV mà còn được gắn kèm thông tin phân loại đầy đủ (ví dụ: "k__Bacteria;p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Lactobacillus;s__crispatus"). Các cột (Columns): Vẫn đại diện cho các mẫu. Các giá trị: Thể hiện số lượng (abundance) của từng đơn vị phân loại (được xác định bởi chuỗi phân loại của nó) trong mỗi mẫu. Mục đích sử dụng: Tệp này là đầu ra cuối cùng, đã được chuẩn bị để thực hiện các phân tích sâu hơn về vi sinh vật. Từ tệp này, bạn có thể: Xác định thành phần cộng đồng vi sinh vật của từng mẫu. So sánh sự khác biệt về thành phần và độ phong phú giữa các mẫu. Tính toán các chỉ số đa dạng sinh học (alpha diversity, beta diversity). Thực hiện các phân tích thống kê để tìm ra các loài/nhóm vi khuẩn liên quan đến các điều kiện thử nghiệm. Tóm lại, bước "Taxonomic affiliation" biến các trình tự DNA đã được làm sạch thành thông tin sinh học có ý nghĩa, cho phép bạn hiểu được "ai" có mặt trong mẫu của bạn và với "số lượng" bao nhiêu.

47. report.html

48. affiliation abundance.biom

49. FROGS_6: Affliation stat 👉 Xử lý một số chỉ số/thước đo trên phân loại học (taxonomies). Process : xử lý, tính toán. Metrics : các chỉ số, thước đo (ví dụ: độ đa dạng, mức độ phong phú, tỷ lệ phân bố). Taxonomies : các nhóm phân loại sinh vật (từ giới, ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài). 📌 Nghĩa trong bối cảnh phân tích 16S/metagenomics: thực hiện việc tính toán các chỉ số sinh thái học (Shannon, Simpson, Chao1…), hoặc tần suất xuất hiện ở từng cấp phân loại (genus, species…) dựa trên dữ liệu phân loại vi sinh vật.

50. Thực hành

51. Output:

52. report.html – Mẫu 1 Ngày 0 Ngày 14 Ngày 17

53. report.html – Mẫu 2 Ngày 0 Ngày 14 Ngày 17

54. Kết quả này nói lên điều gì? Điều này chứng tỏ hệ vi sinh vật nuôi cấy có chứa các loài Cổ khuẩn có khả năng phân giải Methanol làm nguồn carbon, chúng là loài có thể sinh trưởng và phát triển mạnh về số lượng trong quần thể. Mạnh hơn so với các loài Vi khuẩn.

55. Vì sao các loài Vi khuẩn có loài có thể không thể tiêu thụ Methanol nhưng vẫn sống sót được đến ngày 17? (Chúng có thể chết do ngộ độc Methanol trước đó) Vì một số loài vi khuẩn sử dụng sản phẩm trao đổi chất từ các loài tiêu thụ được Methanol để duy trì sự sống, kéo dài sự sống.

56. FROGS_Tree Xây dựng cây phát sinh loài

57. Thực hành

58. Output:

59. Output:

60. FROGS_BIOM_to_TSV Chuyển file Biom thành file TSV BIOM (Biological Observation Matrix) : là định dạng chuẩn (JSON hoặc HDF5) thường dùng trong phân tích dữ liệu hệ vi sinh (metagenomics, amplicon sequencing). Nó lưu trữ ma trận đếm OTU/ASV, cùng metadata của mẫu và taxon. TSV (Tab-Separated Values) : là dạng bảng đơn giản, dễ đọc và xử lý bằng Excel, R, Python, hay nhập vào các phần mềm phân tích khác.

61. Output:

62. FROGS_BIOM_to_stdBIOM Chuyển file Biom thành file BIOM chuẩn hóa

63. FROGS_Phyloseq_Import

64. FROGSSTAT Phyloseq Composition Visualisation

65. FROGSSTAT Phyloseq Alpha Diversity