Prenatal Gene Therapy Concepts Methods and Protocols 1st Edition Charles Coutelle Md

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Prenatal Gene Therapy Concepts Methods and
Protocols 1st Edition Charles Coutelle Md
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Prenatal Gene Therapy Concepts Methods and Protocols
1st Edition Charles Coutelle Md Digital Instant Download
Author(s): Charles Coutelle MD, DSc, Simon N. Waddington PhD (auth.),
Charles Coutelle, Simon N. Waddington (eds.)
ISBN(s): 9781617798733, 1617798738
Edition: 1
File Details: PDF, 4.09 MB
Year: 2012
Language: english

METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY™
Series Editor
John M. Walker
School of Life Sciences
University of Hertfordshire
Hat ﬁ eld, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

Prenatal Gene Therapy
Concepts, Methods, and Protocols
Edited by
Charles Coutelle
National Heart and Lung Institute, Molecular and Cellular Medicine Section,
Imperial College London, London, UK
Simon N. Waddington
Institute for Women’s Health, Gene Transfer Technology Group,
University College London, London, UK

ISSN 1064-3745 e-ISSN 1940-6029
ISBN 978-1-61779-872-6 e-ISBN 978-1-61779-873-3
DOI 10.1007/978-1-61779-873-3
Springer New York Dordrecht Heidelberg London
Library of Congress Control Number: 2012937797
© Springer Science+Business Media, LLC 2012
All rights reserved. This work may not be translated or copied in whole or in part without the written permission of the
publisher (Humana Press, c/o Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA),
except for brief excerpts in connection with reviews or scholarly analysis. Use in connection with any form of information
storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or
hereafter developed is forbidden.
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as such, is not to be taken as an expression of opinion as to whether or not they are subject to proprietary rights.
Printed on acid-free paper
Humana Press is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Editors
Charles Coutelle
National Heart and Lung Institute
Molecular and Cellular Medicine Section
Imperial College London
London, UK
Simon N. Waddington
Institute for Women’s Health
Gene Transfer Technology Group
University College London
London, UK

v
Preface
The emerging new ﬁ eld of prenatal gene therapy is based on the rapid scienti ﬁ c and technical
advances in fetal medicine, molecular biology, and gene therapy over the last two decades.
This novel and still preclinical research subject aims at applying gene therapy during preg-
nancy for the prevention of human diseases caused by early onset congenital or gestation-
related conditions. The present volume summarizes the accumulated scienti ﬁ c knowledge
and practical experience over more that 15 years of research by leading scientist in the ﬁ elds
of gene therapy, fetal medicine and medical ethics. It provides a unique and comprehensive
overview of the concept of prenatal gene therapy, its potential target diseases, its advantages
and possible adverse effects and of the ethical and societal implications of this approach.
This book contains detailed protocols for vector production, for breeding and husbandry
of the animal models, for the surgical procedures of gene delivery in large and small ani-
mals, and for the methods of gene transfer analysis. The various chapters are introduced by
overviews covering the different vector systems, animal models and analysis methods used
in basic research on prenatal gene therapy, and in preparation for human application.
Although prenatal disease is the main target of application in this volume, the chapters on
vector generation, production, and testing compiled here provide detailed state of the art
knowledge useful for other gene therapy projects beyond the scope of fetal medicine.
Written for: Gene therapists, obstetricians, specialists in perinatal medicine, human
geneticists, molecular biologists, medical ethicists.
London, UK Charles Coutelle
Simon N. Waddington

vii
Contents
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
1 The Concept of Prenatal Gene Therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Charles Coutelle and Simon N. Waddington
2 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Anna L. David and Simon N. Waddington
3 Vector Systems for Prenatal Gene Therapy: Choosing Vectors for Different
Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Charles Coutelle and Simon N. Waddington
4 Vector Systems for Prenatal Gene Therapy: Principles of Adenovirus
Design and Production. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Raul Alba, Andrew H. Baker, and Stuart A. Nicklin
5 Vector Systems for Prenatal Gene Therapy: Principles of Retrovirus
Vector Design and Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Steven J. Howe and Anil Chandrashekran
6 Vector Systems for Prenatal Gene Therapy: Principles of Adeno-Associated
Virus Vector Design and Production. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Christopher J. Binny and Amit C. Nathwani
7 Vector Systems for Prenatal Gene Therapy: Principles of Non-viral Vector
Design and Production. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Suet Ping Wong, Orestis Argyros, and Richard P. Harbottle
8 Use of Manipulated Stem Cells for Prenatal Therapy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Jessica L. Roybal, Pablo Laje, Jesse D. Vrecenak, and Alan W. Flake
9 Animal Models for Prenatal Gene Therapy: Choosing the Right Model. . . . . . . . . . 183
Vedanta Mehta, Donald Peebles, and Anna L. David
10 Animal Models for Prenatal Gene Therapy: Rodent Models
for Prenatal Gene Therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Jessica L. Roybal, Masayuki Endo, Suzanne M.K. Buckley,
Bronwen R. Herbert, Simon N. Waddington, and Alan W. Flake
11 Animal Models for Prenatal Gene Therapy: The Sheep Model. . . . . . . . . . . . . . . . . 219
Khalil N. Abi-Nader, Michael Boyd, Alan W. Flake, Vedanta Mehta,
Donald Peebles, and Anna L. David
12 Animal Models for Prenatal Gene Therapy: The Nonhuman Primate Model . . . . . . 249
Citra N. Mattar, Arijit Biswas, Mahesh Choolani, and Jerry K.Y. Chan
13 Choice of Surrogate and Physiological Markers for Prenatal Gene Therapy . . . . . . . 273
Juliette M.K.M. Delhove, Ahad A. Rahim, Tristan R. McKay,
Simon N. Waddington, and Suzanne M.K. Buckley

viii Contents
14 Monitoring for Potential Adverse Effects of Prenatal Gene Therapy:
Use of Large Animal Models with Relevance to Human Application . . . . . . . . . . . . 291
Vedanta Mehta, Khalil N. Abi-Nader, David Carr,
Jacqueline Wallace, Charles Coutelle, Simon N. Waddington,
Donald Peebles, and Anna L. David
15 Monitoring for Potential Adverse Effects of Prenatal Gene Therapy:
Mouse Models for Developmental Aberrations and Inadvertent Germ
Line Transmission. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
Charles Coutelle, Simon N. Waddington, and Michael Themis
16 Monitoring for Potential Adverse Effects of Prenatal Gene Therapy:
Genotoxicity Analysis In Vitro and on Small Animal Models
Ex Vivo and In Vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341
Michael Themis
17 Risks, Bene ﬁ ts and Ethical, Legal, and Societal Considerations
for Translation of Prenatal Gene Therapy to Human Application. . . . . . . . . . . . . . . 371
Charles Coutelle and Richard Ashcroft
Index. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389

ix
Contributors
KHALIL N. A BI-NADER Prenatal Cell and Gene Therapy Group , EGA Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK
R
AUL ALBA Institute of Cardiovascular and Medical Sciences,
University of Glasgow , Glasgow , UK
O
RESTIS ARGYROS , PHD Faculty of Medicine, Molecular and Cellular Medicine
Section , National Heart and Lung Institute, Imperial College London , London , UK
R
ICHARD ASHCROFT , PHD School of Law, Queen Mary, University of London ,
London , UK
A
NDREW H. B AKER , PHD Institute of Cardiovascular and Medical Sciences,
University of Glasgow , Glasgow , UK
C
HRISTOPHER J. BINNY Department of Haematology , UCL Cancer Institute ,
London , UK
A
RIJIT BISWAS Experimental Fetal Medicine Group, Department of Obstetrics
and Gynaecology , Yong Loo Lin School of Medicine , Singapore , Singapore
M
ICHAEL BOYD Biological Services Unit , Royal Veterinary College , London , UK
S
UZANNE M.K. B UCKLEY , PHD Gene Transfer Technology Group , Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK
D
AVID CARR Prenatal Cell and Gene Therapy Group , EGA Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK;
The Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen ,
Aberdeen , UK
A
NIL CHANDRASHEKRAN , PHD Department of Surgery and Cancer , Institute
of Reproduction and Development Biology, Hammersmith Hospital,
Imperial College London , London , UK
J
ERRY K.Y. C HAN , MD, PHD Experimental Fetal Medicine Group,
Department of Obstetrics and Gynaecology , Yong Loo Lin School of Medicine ,
Singapore , Singapore; Department of Reproductive Medicine , KK Women’s
and Children’s Hospital , Singapore , Singapore; Cancer and Stem Cell Biology
Program , Duke-NUS Graduate Medical School , Singapore , Singapore
M
AHESH CHOOLANI Experimental Fetal Medicine Group, Department of Obstetrics
and Gynaecology , Yong Loo Lin School of Medicine , Singapore , Singapore
C
HARLES COUTELLE , MD, DSC National Heart and Lung Institute,
Molecular and Cellular Medicine Section , Imperial College London, London , UK
A
NNA L. D AVID , PHD, MRCOG Prenatal Cell and Gene Therapy Group ,
EGA Institute for Women’s Health, University College London , London, UK
J
ULIETTE M.K.M. DELHOVE Gene Transfer Technology Group , Institute for Women’s
Health, University College London , London , UK

x Contributors
MASAYUKI ENDO Department of Surgery, Children’s Center for Fetal Research
and Center for Fetal Diagnosis and Treatment, Children’s Hospital of Philadelphia,
Philadelphia, PA, USA
A
LAN W. F LAKE , MD Department of Surgery, Children’s Hospital of Philadelphia ,
Philadelphia , PA , USA
R
ICHARD P. H ARBOTTLE , PHD Faculty of Medicine, Molecular and Cellular Medicine
Section , National Heart and Lung Institute, Imperial College London , London , UK
B
RONWEN R. HERBERT Department of Surgery, Children’s Center for Fetal Research
and Center for Fetal Diagnosis and Treatment, Children’s Hospital of Philadelphia,
Philadelphia, PA, USA
S
TEVEN J. H OWE , PHD Molecular Immunology Unit, Wolfson Centre
for Gene Therapy , UCL Institute of Child Health , London , UK
P
ABLO LAJE Department of Surgery, Children’s Center for Fetal Research
and Center for Fetal Diagnosis and Treatment , Children’s Hospital of Philadelphia ,
Philadelphia , PA , USA
C
ITRA N. M ATTAR Experimental Fetal Medicine Group, Department of Obstetrics
and Gynaecology , Yong Loo Lin School of Medicine , Singapore , Singapore
T
RISTAN R. MCKAY Department of Endocrinology, William Harvey Research
Institute, Charterhouse Square London EC1M 6BQ
V
EDANTA MEHTA Prenatal Cell and Gene Therapy Group , EGA Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK
A
MIT C. N ATHWANI , MD, PHD Department of Haematology , UCL Cancer Institute ,
London , UK
S
TUART A. N ICKLIN , BSC (HONS) PHD Institute of Cardiovascular
and Medical Sciences, University of Glasgow , Glasgow , UK
D
ONALD PEEBLES , MD Prenatal Cell and Gene Therapy Group , EGA Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK
A
HAD A. R AHIM , PHD Gene Transfer Technology Group , Institute
for Women’s Health, University College London , London , UK
J
ESSICA L. R OYBAL Department of Surgery, Children’s Center for Fetal Research
and Center for Fetal Diagnosis and Treatment , Children’s Hospital of Philadelphia ,
Philadelphia , PA , USA
M
ICHAEL THEMIS , PHD Gene Therapy and Genotoxicity Research Group ,
Brunel University , London , UK
J
ESSE D. V RECENAK Department of Surgery, Children’s Center for Fetal Research
and Center for Fetal Diagnosis and Treatment , Children’s Hospital of Philadelphia ,
Philadelphia , PA , USA
S
IMON N. W ADDINGTON , PHD Institute for Women’s Health, Gene Transfer
Technology Group, University College London , London , UK
J
ACQUELINE WALLACE The Rowett Institute of Nutrition and Health,
University of Aberdeen , Aberdeen , UK
S
UET PING WONG , PHD Faculty of Medicine, Molecular and Cellular Medicine
Section , National Heart and Lung Institute, Imperial College London , London , UK

1
Charles Coutelle and Simon N. Waddington (eds.), Prenatal Gene Therapy: Concepts, Methods, and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 891, DOI 10.1007/978-1-61779-873-3_1, © Springer Science+Business Media, LLC 2012
Chapter 1
The Concept of Prenatal Gene Therapy
Charles Coutelle and Simon N. Waddington
Abstract
This introductory chapter provides a short review of the ideas and practical approaches that have led to the
present and perceived future development of prenatal gene therapy. It summarizes the advantages and the
potential adverse effects of this novel preventive and therapeutic approach to the management of prenatal
diseases. It also provides guidance to the range of conditions to which prenatal gene therapy may be
applied and to the technical approaches, vectors, and societal/ethical considerations for this newly emerging
ﬁ eld of Fetal Medicine.
Key words: Prenatal (in utero, fetal) gene therapy , Fetal Medicine , Prenatal disease , Genetic disease ,
Prevention , Vectors , Animal models , Ethical considerations
Gestation and intrauterine development are closely interrelated
physiological conditions with a high vulnerability to adverse
in ﬂ uences from endogenous fetal and maternal or from exogenous
stress factors. This has led to the development of Fetal Medicine as
a specialty that combines the expertise of many disciplines includ-
ing obstetrics, neonatology, pediatric surgery, and genetics in order
to provide the best scienti ﬁ cally based health care to pregnant
women and their future offspring. Particular emphasis of Fetal
Medicine is placed on early risk detection and prevention or treat-
ment in order to avoid maternal or fetal disease. This book presents
prenatal gene therapy, as a promising concept to achieve this goal.
Both, fetal and maternal conditions, which may bene ﬁ t from this
approach, are outlined in Chapter
2 of this volume.
Many maternal factors, such as preexisting maternal disease or
preeclampsia, impact on fetal development and neonatal outcome.
Advances in maternal and neonatal medical care and better
identi ﬁ cation of pregnancies at risk of these complications have lead
to improvements in intact neonatal survival and long-term out-
comes. Nevertheless in many obstetric complications, the best cur-
rent management lies with elective premature delivery of the fetus.

2 C. Coutelle and S.N. Waddington
With increasing insight into many of these diseases, new therapeutic
strategies may emerge, which could also include genetic therapies.
Fetal risk-factors such as congenital malformations and some
genetic diseases can be identi ﬁ ed by ultrasound scan, amniotic ﬂ uid
or chorionic villus sampling for karyotyping, and more recently,
selected DNA diagnosis in known at-risk-pregnancies.
The rapid progress in human genome analysis has made it pos-
sible to pinpoint the mutations of virtually any monogenetic dis-
ease and to develop methods for DNA diagnosis. The speed by
which DNA sequencing technologies advance gives us con ﬁ dence
to predict that individual genome analysis will soon become part
of modern medical diagnostics and disease prevention including
Fetal Medicine. However, despite these new opportunities for the
detection of many, often early in life manifesting, devastating
genetic diseases, little progress has been made so far to turn the
emerging knowledge of molecular pathogenesis into new thera-
peutic approaches.
At present, prenatal diagnosis of a severe genetic disease con-
fronts the family with the often desperate dilemma to choose
between preparation for postnatal symptomatic care of an affected
child or termination of the pregnancy by abortion. Depending on
the disease and its severity, therapy is frequently not available or
inef ﬁ cient, expensive, and a great burden on the affected individual
and family as well as on society in terms of ﬁ nancial and health care
resources ( 1 ) . Quite obviously new forms of a causal therapy, which
may prevent or cure such devastating diseases, are urgently needed.
Since genetic disease is caused by faults in the DNA sequence,
gene therapy appears as the most logical strategy to treat such con-
dition. Ideally, therapy for a genetic disease would aim to be effec-
tive for a prolonged, if possible life-long, time span after a single
vector application.
The advent of gene cloning in the 1970s and the following
international endeavor to map and sequence the human genome in
the 1980s found one of its practical applications already at the
beginning of the 1990s in experimental and even early clinical
attempts to use these newly developed tools and techniques for the
treatment of genetic disease by postnatal gene therapy. Most pres-
ent gene therapy approaches aim at supplementing the cells of the
affected patients with normal gene sequences in order to reverse
the pathological gene expression caused by the underlying genetic
defect. All clinical gene therapy trials so far have been conducted
postnatally, mostly on adult patients. However, many genetic dis-
eases manifest very early in life and by the time postnatal treat-
ment, including gene therapy, can be applied; the in ﬂ icted damage
to the patient is often irreversible. This may prevent cure even if
normal gene expression were later restored.
The idea that such early and irreversible damage could be pre-
vented if the therapeutic gene sequences could already be delivered

31 The Concept of Prenatal Gene Therapy
prenatally took shape in the early 1990s after the development of
surgical methods for intrauterine intervention on the human fetus
for the treatment of congenital malformations. These interventions
take advantage of scarless healing during fetal life and were ﬁ rst
conducted by open uterine techniques ( 2 ) , followed by fetoscopic
( 3 ) methods. First experiments using ex vivo retroviral gene trans-
fer to mid-gestational cord blood cells followed by reinfusion in
sheep and primates were started in 1985 and provided evidence for
sustained gene transfer in hematopoietic cells for over 2 years ( 4– 6 ) .
Transcutaneous ultrasound guided minimally invasive injection of
fetal liver cells into the umbilical vein was ﬁ rst applied in the early
1990s to treat severe immune de ﬁ ciencies and thalassemia ( 7 ) . By
1995, several studies had also been conducted to explore direct
gene delivery in utero using different routes and vectors to apply
marker genes to the rodent and sheep fetus ( 8– 13 ) .
Subsequently, these techniques have been perfected and
adapted to target different organ systems in several animal models
( 14 ) . Ultrasound guided minimally invasive transcutaneous deliv-
ery techniques, to reach virtually all major fetal organs, which
could be applied to the human fetus, have been developed on the
sheep model ( 15 ) and are beginning to be applied successfully to
nonhuman primates. Proof of principle for therapeutic and even
curative in utero gene therapy has been shown in several rodent
models for human genetic diseases ( 16 ) .
The advances of in utero gene delivery to the fetus were fol-
lowed by gene delivery to extraembryonic and maternal tissues
( 17– 20 ) with a view to treatment of prenatal diseases. Senut et al.
( 21 ) showed already in 1998 that ex vivo genetically modi ﬁ ed cells,
including autologous placenta-derived cells and primary ﬁ broblasts,
transplanted into the placenta, produced a transgenic marker pro-
tein that was detectable in the fetal body and suggested that this
could be used for transient production of therapeutic proteins.
More recently, transient prenatal gene delivery approaches have
been extended to target maternal organs such as the uterus ( 22 ) in
order to prevent fetal or maternal complications during pregnancy
or delivery ( 17, 23 ) .
The envisaged bene ﬁ ts of in utero gene delivery have been
reviewed by us and others ( 16, 24– 29 ) .
In summary, this concept offers a potential (a) to prevent early
onset disease manifestation and tissue damage caused by inherited
diseases or by acquired perinatal maternal and fetal conditions;
(b) to correct genetic disease permanently by the use of integrating
vectors and by targeting the abundant and expanding stem cell
populations present during fetal life or by perhaps repeated trans-
duction of postmitotic tissues with nonintegrating vectors; (c) to
avoid immune reactions against the vector and/or transgenic
protein by administration of the transgene before maturation of
the immune system; and (d) to target organs or tissues, which are

4 C. Coutelle and S.N. Waddington
dif ﬁ cult to access later in life, but which can be easily reached and
have a higher capacity of scarless repair in the fetus. The bene ﬁ cial
ratio of fetal body mass to vector is also a distinctive advantage of
gene application in utero.
Although simple in concept, the ef ﬁ cient and safe application
of gene sequences to the cells of the organism requiring treatment
has turned out to be one of the main challenges of gene therapy
since its beginnings. Various modi ﬁ ed viruses or nonviral nanopar-
ticles are used as vectors to enter the cell and deliver the therapeu-
tic gene sequences. These vectors need to overcome the natural
defense barriers of the recipient organism, including its immune
system, against viruses or foreign particles, nucleic acids, and pro-
teins without compromising these defenses to ﬁ ght off natural
pathogens. The vectors need to reach and enter a suf ﬁ cient num-
ber of cells in the tissue or organ that requires correction, and to
express the therapeutic protein preferentially only in these cells.
One of the main tasks of gene therapy research is therefore the
development and generation of effective, nontoxic gene delivery
vectors in high purity and quantity. Chapters 3 – 7 review those vec-
tors and their properties, which have been most successfully applied
in prenatal applications.
Chapter 8 of this volume presents ex vivo gene therapy meth-
ods to modify isolated autologous stem cell populations in vitro,
which are then been readministered prenatally to achieve a thera-
peutic effect. This alternative approach to direct topical or systemic
vector application aims at overcoming some of the described barri-
ers and avoiding possible adverse effects arising from indiscriminate
vector spread.
Animal studies have played an indispensible role in preparing
for clinical application of in utero gene therapy. Over the last
10 years, many studies on fetal rodents, rabbits, dogs, guinea pigs,
sheep, and more recently on nonhuman primates have been con-
ducted by several groups in order to investigate and improve safety
and ef ﬁ ciency of prenatal transgene delivery and expression and to
develop techniques applicable to the human fetus (for review, see
refs. 16, 30 ) .
However, differences in scale and physiology have often been
the reason for disappointment when trying to translate successful
animal experiments into clinical application. It is therefore impor-
tant to understand the technical and biological advantages and
limitations of the different animal models used in preparation for
human gene therapy application for prenatal gene therapy. Chapters
9 – 12 provide overviews and detailed protocols for the murine,
sheep, and primate animal models, respectively.
The correct choice and critical validation of the different avail-
able physiological and biochemical endpoints, as described in
Chapter 13 , is an important factor for the correct assessment of
therapeutic success in preclinical and clinical gene therapy studies.

51 The Concept of Prenatal Gene Therapy
Despite successful proof of principle of the concept of in utero
gene therapy in animal models, this approach remains presently
still at the stage of preclinical research. Already in 1998, in response
to a pre-proposal to conduct human in utero gene therapy trials for
hemoglobinopathies and Adenosine Deaminase De ﬁ ciency (ADA)
( 31 ) , the US NIH Recombinant Advisory Committee (RAC) con-
cluded that more research into possible adverse effects was needed
before any such trial could be considered ( 32, 33 ) . Indeed, the
potential for adverse effects such as vector-mediated oncogenesis,
germ line transduction, developmental aberrations, or other so far
unknown long-term alterations are frequently cited as reason
against clinical application of in utero gene transfer. The last
10 years have seen the ﬁ rst clinical successes of postnatal gene ther-
apy as well as serious adverse effects ( 34, 35 ) of which particularly
the observation of vector-related oncogenicity ( 36, 37 ) is highly
relevant to prenatal gene application. Chapters 14 – 16 of this book
present on-going research to identify the risks of gene transfer, to
provide a basis for scienti ﬁ c risk assessment, and to increase the
safety of prenatal gene therapy using different animal models.
While the bene ﬁ ts of successful prenatal gene therapy to treat
and potentially even cure genetic disease has been clearly shown in
animal models, a translation to human application will require rig-
orous demonstration of high reliability and long-term safety before
it becomes a realistic alternative option to either the acceptance of
an affected child, abortion, or longer-term family planning for
in vitro fertilization and embryo selection. Especially in the begin-
ning of such translation, this will be a very dif ﬁ cult choice for a
family confronted with genetic disease. The personal, societal, eth-
ically, and legal considerations involved in this decision are dis-
cussed in more detail in the ﬁ nal Chapter 17 of this book.
In conclusion, prenatal gene therapy research has now reached
a stage of maturity, to provide the tools, which can achieve ef ﬁ cient
transgene delivery and therapeutic levels of transgene expression
and could technically be applied to the human fetus. However,
more studies on rodents and larger mammalian animal models are
required to investigate and avoid possible long-term adverse effects
of prenatal vector delivery and to study prenatal gene therapy strat-
egies on a per-disease basis. The scienti ﬁ c background and proto-
cols provided in this book may contribute to the longer-term goal
of clinical application of prenatal gene delivery for the prevention of
severe human genetic diseases and nongenetic prenatal conditions.
References
1. McCandless SE, Brunger JW, Cassidy SB
(2004) The burden of genetic disease on inpa-
tient care in a children’s hospital. Am J Hum
Genet 74:121–127
2. Flake AW, Harrisson MR (1995) Fetal surgery.
Ann Rev Med 46:67–78
3. Harrison MR (2000) Surgically correctable
fetal disease. Am J Surg 180:335–342

6 C. Coutelle and S.N. Waddington
4. Anderson W, Kantoff P, Eglitis M et al (1986)
Gene transfer and expression in nonhuman pri-
mates using retroviral vectors. Cold Spring
Harb Symp Quant Biol 51(Pt 2):1073–1081
5. Eglitis M, Kantoff PW, McLachlin JR et al
(1987) Gene therapy: efforts at developing
large animal models for autologous bone mar-
row transplant and gene transfer with retroviral
vectors. Ciba Found Symp 130:229–246
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9
Charles Coutelle and Simon N. Waddington (eds.), Prenatal Gene Therapy: Concepts, Methods, and Protocols,
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Chapter 2
Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
Anna L. David and Simon N. Waddington
Abstract
Prenatal gene therapy aims to deliver genes to cells and tissues early in prenatal life, allowing correction of
a genetic defect, before irreparable tissue damage has occurred. In contrast to postnatal gene therapy,
prenatal application may target genes to a large population of stem cells, and the smaller fetal size allows a
higher vector to target cell ratio to be achieved. Early gestation delivery may allow the development of
immune tolerance to the transgenic protein, which would facilitate postnatal repeat vector administration
if needed. Moreover, early delivery would avoid anti−vector immune responses which are often acquired in
postnatal life.
The NIH Recombinant DNA Advisory Committee considered that a candidate disease for prenatal
gene therapy should pose serious morbidity and mortality risks to the fetus or neonate, and not have any
effective postnatal treatment. Prenatal gene therapy would therefore be appropriate for life−threatening
disorders, in which prenatal gene delivery maintains a clear advantage over cell transplantation or postnatal
gene therapy. If deemed safer and more ef ﬁ cacious, prenatal gene therapy may be applicable for nonlethal
conditions if adult gene transfer is unlikely to be of bene ﬁ t. Many candidate diseases will be inherited
congenital disorders such as thalassaemia or lysosomal storage disorders. However, obstetric conditions
such as fetal growth restriction may also be treated using a targeted gene therapy approach. In each dis−
ease, the condition must be diagnosed prenatally, either via antenatal screening and prenatal diagnosis, for
example, in the case of hemophilias, or by ultrasound assessment of the fetus, for example, congenital
diaphragmatic hernia.
In this chapter, we describe some examples of the candidate diseases and discuss how a prenatal gene
therapy approach might work.
Key words:   Prenatal gene therapy ,  Congenital disease ,  Pre−eclampsia ,  Fetal growth restriction

Gene therapy came onto the therapeutic scene in the 1980s and
the  ﬁ rst human gene therapy trials began over 15 years ago  (  1  ) .
But in spite of continuous technological progress most clinical
results have been disappointing. The reasons for this are many and
include dif ﬁ culties in targeting the appropriate organ, a robust
immune response to the therapy in adults and low level expression
1. Introduction

10 A.L. David and S.N. Waddington
of the therapeutic gene product. Many of these dif ﬁ culties may be
avoidable by applying the therapy prenatally, and recent preclinical
work has indeed shown proof of principle for phenotypic cure of
congenital disease in animal models using this approach. Selecting
the right diseases for therapeutic intervention will be critical for
clinical translation. Prenatal gene therapy has been proposed to be
appropriate for life−threatening disorders, in which prenatal gene
delivery maintains a clear advantage over cell transplantation or
postnatal gene therapy and for which there are currently no satis−
factory treatments available  (  2  ) . In this chapter we consider the
various congenital diseases and obstetric disorders that might be
suitable for this therapeutic approach.

Congenital disease places a huge burden on the community and
the health service. A study of pediatric inpatient admissions in
1996 in a US children’s hospital found that wholly genetic condi−
tions accounted for one−third of hospital admissions and for 50% of
the total hospital charges for that year  (  3  ) . Thus a preventative
strategy such as prenatal gene therapy could have an important
social and economic impact.
A criticism leveled at a prenatal approach is that gene transfer
to an individual after birth may be as effective, and probably safer,
than prenatal treatment. Indeed current conventional treatment of
some genetic diseases is highly effective. For example, hereditary
hemochromatosis is caused mainly by mutations in the human
hemochromatosis protein but can also be caused by mutations in
hemojuvelin, hepcidin antimicrobial peptide, and the transferrin
receptor 2, amongst others. The disease, which is characterized by
iron overload, results in a variety of pathological changes including
liver cirrhosis, cardiomyopathy, diabetes, and arthritis. Highly
effective treatment consists of regular bloodletting which reduces
iron concentrations to normal. For those who cannot tolerate
phlebotomy iron chelation agents such as Deferoxamine are avail−
able. For many genetic diseases however, treatment is palliative
rather than curative, resulting in patients living longer but with a
reduced quality of life. This has been particularly seen in cystic
ﬁ brosis, in which life expectancy has risen from school age in 1955
to the mid 30s today (Cystic Fibrosis Foundation). To achieve this
however, patients require daily chest physiotherapy, antibiotic
treatment, dietary supplementation, insulin for diabetes mellitus,
and in many cases, lung transplants, which require immunosup−
pressive therapy. Effective treatment in utero could cure genetic
disease, or at least provide partial correction that may have a huge
impact on disease progression.
2. Is There a Need
for Prenatal Gene
Therapy?

112 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy

     1.    Prenatal gene therapy may offer particular bene ﬁ ts in particular
early onset genetic disorders in which irreversible pathological
damage occurs to organs before or shortly after birth  (  4  ) . For
many such diseases, the organ may be dif ﬁ cult to target after
birth, for example the lung in cystic  ﬁ brosis, the brain in urea
cycle disorders, or the skin in epidermolysis bullosa, and prena−
tal treatment may take advantage of developmental changes to
access organs that are inaccessible after birth.
    2.    Certain obstetric disorders may also be suitable for a prenatal
gene therapy approach. Problems of de ﬁ cient uteroplacental
circulation underlie the common obstetric condition, fetal
growth restriction (FGR) in which the fetus fails to achieve
its genetic growth potential and which is currently untreatable.
A targeted local gene transfer to improve the circulation is one
approach that is being studied with some success.
    3.    The fetus has a size advantage in a number of ways for some
congenital diseases, especially where transgenic protein expres−
sion levels may be important. Production of clinical grade
vector is time−consuming and expensive and the small size of
the fetus could lead to increased vector biodistribution at the
same vector dose as an adult.
    4.    The fetus has a functionally immature immune system com−
pared to an adult, which may be to its advantage for treatment
of some diseases. Worldwide up to 50% of adults have preexist−
ing humoral immunity to adenovirus and adeno−associated
virus serotypes from which commonly used gene therapy vec−
tors are derived  (  5  ) . Even in the absence of a preexisting
immune sensitivity, vector administration to adults often results
in the development of an immune response that reduces the
duration and the level of transgene expression. For example,
after intramuscular injection of adenovirus vector containing
the dystrophin gene into adult Duchenne muscular dystrophy
transgenic mice, antibodies to the dystrophin protein were
detected  (  6  ) . This complication is particularly important when
gene therapy is aiming to correct a genetic disease in which
complete absence of a gene product is observed.

As with any potential therapeutic modality, the risks of prenatal
gene therapy are not well characterized and the ef ﬁ cacy is still
undetermined. In this regard, the report of the NIH Recombinant
3. The Advantages
of a Prenatal
Approach for
Some Diseases
4. Candidate
Diseases

12 A.L. David and S.N. Waddington
DNA Advisory Committee  (  7  )  proposed that initial application of
prenatal gene therapy should be limited only to those diseases that:
   Are associated with serious morbidity and mortality risks for
●
the fetus either in utero or postnatally.
  Do not have an effective postnatal therapy, or have a poor
●
outcome using available postnatal therapies.
  Are not associated with serious abnormalities that are not
●
corrected by the transferred gene.
  Can be de ﬁ nitively diagnosed in utero and have a well de ﬁ ned
●
genotype/phenotype relationship.
  Have an animal model for in utero gene transfer that recapitu−
●
lates the human disease or disorder.
Some of the diseases that may be suitable for fetal treatment
are listed in Table  1 .
Preclinical studies of prenatal gene transfer are encouraging.
Fetal application of gene therapy in mouse models of congenital
disease such as hemophilia A  (  8  )  and B  (  9  ) , congenital blindness
(  10  ) , Crigler–Najjar type 1 syndrome  (  11  )  and Pompe disease
(glycogen storage disease type II)  (  12  )  have shown phenotypic
correction of the condition. In the following sections we consider
groups of candidate diseases and discuss the factors that will
in ﬂ uence the success of a prenatal gene therapy approach.
  Inherited blood disorders would be a relatively simple target for
prenatal gene therapy as the fetal circulation can be reached during
its circulation through the umbilical vein (UV) at the placental cord
insertion or the intrahepatic UV, or even via the peritoneal cavity, a
route used successfully to transfuse anemic fetuses. Congenital
blood disorders are relatively common in some populations, and
prenatal screening and diagnostic services are available. Translation
of prenatal gene therapy into man is probably most advanced when
considering congenital blood disorders such as the hemophilias.
Research has progressed from demonstrating proof of principle in
mouse models, into larger animal models such as the sheep and
non−human primate, where delivery techniques, long−term trans−
gene expression and safety can be better addressed (see Table  2 ).
De ﬁ ciency in factor VIII (FVIII) and FIX proteins of the blood
coagulation cascade, result in hemophilias A and B, respectively,
and have a combined incidence of around 1 in 8,000 people  (  13  ) .
Current treatment uses replacement therapy with human FVIII or
FIX which is expensive but effective  (  14  ) . Bene ﬁ cial effects occur
after achieving only 1% of the normal levels of clotting factor.
Unfortunately, a proportion of patients develop antibodies to ther−
apy leading to ineffective treatment and occasional anaphylaxis  (  15  ) .
The complications of hemophilia treatment which include the
major risk of HIV and hepatitis B infections, although less of an
4.1. The Hemophilias

132 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
Table 1
Candidate diseases for prenatal gene therapy
Disease Therapeutic gene product Target cells/organ Age at onset Incidence Life expectancy Cystic  ﬁ brosis  CF transmembrane
conductance regulator
Airway and intestinal
epithelial cells
In utero 1:2,000–4,000  Mid−thirties
Duchenne muscular
dystrophy
Dystrophin  Myocytes  2 years 1:4,500  25 years
Lysosomal storage
disease
Glucocerebrosidase in
Gaucher disease
Hepatocytes  9–11 years 1:9,000 overall <2 years
Spinal muscular
atrophy
Survival motor neuron
protein
Motor neurons In utero in type 0,
6 months in type 1
1:10,000  2 years
Urea cycle defects Ornithine transcarbamylase
in ornithine transcarbam−
alase de ﬁ ciency
Hepatocytes  2 days 1:30,000 overall 2 days (severe neonatal
onset)
Hemophilia  Human factor VIII or IX
clotting factors
Hepatocytes  1 year 1:6,000  Adulthood with treatment
Homozygous
a −thalassaemia
Globin  Erythrocyte
precursors
In utero 1:2,700  Lethal
Severe combined
immunode ﬁ ciency
(SCID)
   g c cytokine receptor
(X−linked SCID);
adenosine toxicity
Haematopoietic
precursor cells
Birth  1:1,000,000  <6 months if no bone
marrow transplant
Epidermolysis bullosa
Type VII collagen Keratinocytes  Birth  1:40,000  Milder forms to adulthood
Severe fetal growth
restriction
Vascular endothelial
growth factor
Uterine arteries In utero 1:100  Adulthood if individual
survives the neonatal
period
Congenital diaphrag−
matic hernia
Lung growth factors Alveoli  In utero 1:2,200  Adulthood if individual
survives neonatal surgery

14 A.L. David and S.N. Waddington
Table 2 Translating fetal gene therapy into man, using hemophilia treatment as an example
Animal model Vector and transgene Vector dose Delivery route Outcome Mouse
Adenovirus
encoding luciferase reporter gene
1 × 10
7
  pfu/fetus
Intrahepatic
High−level luciferase expression in neonatal
liver
(
193
  )

Hemophilia
A mouse
*

Adenovirus encoding
murine FVIII
3.3 × 10
5
  pfu/fetus
IP
Short−term correction of factor VIII
de
ﬁ
ciency in neonatal period
(
8
  )

Mouse
Adenovirus
encoding luciferase reporter gene
1 × 10
7
  pfu/fetus
Intrahepatic to fetus and
reinjection of 3 month−old neonate
Liver expression of luciferase up to 1 month
of neonatal life. Antibodies to vector and protein developed after vector reinjection at 3 months postnatally
(
194
  )

Mouse
Adenovirus
encoding hFIX
2 × 10
11
  pfu/fetus
Vitelline vessel
Induced immune tolerance to exogenous
hFIX protein but only short−term transgenic hFIX protein expression in neonatal mouse plasma
(
195
  )

Hemophilia B
mouse
*

HIV Lentivirus
encoding hFIX
2.0 × 10
10
  p/kg fetus
Vitelline vessel
Permanent cure of hemophilia with immune
tolerance to exogenous hFIX
(
9
  )

Hemophilia B
mouse
*

AAV−1 encoding hFIX
5 × 10
9
  vg/fetus
IM (hindlimb) to fetus and
reinjection postnatally
Induction of tolerance and long−term
therapeutic hFIX expression
(
23
  )

152 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
Animal model Vector and transgene Vector dose Delivery route Outcome Early gestation
sheep
Adenovirus
1.5 × 10
12
  pfu/kg fetus
USS−guided IP or hepatic
injection
Short−term high−level transduction of the
liver after IP compared with intrahepatic injection with therapeutic levels of hFIX expression in the plasma
(
26
  )

Late−gestation
macaque
AAV2 encoding eGFP
8.6 × 10
10
  p/fetus
USS−guided hepatic
injection
Vector genomes in peripheral blood at
birth
(
136
  )

Late−gestation
macaque
Lentivirus
encoding eGFP
1 × 10
7
  p/fetus
USS−guided IP injection
High−level liver transduction for at least
9 months postnatally
(
136–
  138,
  196
  )

Early and late−
gestation sheep
scAAV8 encoding
hFIX
1 × 10
12
  vg/kg fetus
IP injection by USS
hFIX expression in blood up to 6 months
but no immune tolerance
(
28
  )

Late−gestation
macaque
scAAV5 and 8
encoding hFIX
1.0–1.95 × 10
13
  vg/kg
fetus
USS−guided UV injection
hFIX expression in blood and liver for at
least 1 year, non−neutralizing immune response
(
197
  )

  Studies have moved from using short−term expressing vectors such as adenovirus to long−term expressing vectors such as AAV and
lentivirus, in more clinically
relevant animals such as the sheep and non−human primate   hFIX
  human factor IX clotting factor,
AAV
  adeno−associated virus vector,
eGFP
  enhanced green
ﬂ
uorescent protein,
USS
  ultrasound,
IM
  intramuscular,
IP
  intraperitoneal
*
  animal model of disease,
vg
  vector genomes,
p
  particles,
pfu
  plaque forming units,
sc
  self−complementary vector

16 A.L. David and S.N. Waddington
issue now that blood donors are screened effectively, have in some
cases been far worse than the diseases themselves, increasing their
morbidity and mortality  (  16  ) . The clotting proteins are required in
the blood and can be secreted functionally from a variety of tissues,
thus the actual site of production is not so important as long as
therapeutic plasma levels are realized.
Adult gene therapy strategies have concentrated on application
to the muscle or the liver, achieving sustained FIX expression in
adult hemophiliac dogs or mice after intramuscular or intravascular
injection of adeno−associated virus (AAV) vectors  (  17–  19  ) . Chao
et al. observed that the AAV serotype is important. In mice, injec−
tion of AAV serotype 1 resulted in tenfold higher levels of canine
FIX when compared with serotype 2  (  19  ) . In clinical trials using
AAV2hFIX vectors in hemophilia B patients, only short−term and
low level FIX expression was observed, however, which was prob−
ably caused by a cell−mediated immune response to transduced
hepatocytes  (  20,   21  ) . A clinical trial using a self−complementary
AAV8 vector serotype, which may stimulate less of an immune
response, is currently underway in adults with hemophilia B  (  22  ) .
Waddington et al. demonstrated permanent phenotypic cor−
rection of immune−competent hemophiliac mice by intravascular
injection of a lentivirus vector encoding the human Factor IX
(hFIX) protein at 16 days of gestation (term = 22 days)  (  9  ) . Plasma
factor levels remained at 10–15% of normal in treated animals for
their lifetime. Sabatino et al. subsequently demonstrated induction
of tolerance after AAV−1−hFIX administration in Factor IX−de ﬁ cient
fetal mice  (  23  ) .
Translation to large animals has been slower because of the
need for longer−term gene transfer and a higher vector dose when
compared to small animals, but recent studies demonstrate the
potential for this route of delivery. Long−term transduction of
hematopoietic stem cells in the bone marrow and blood could be
demonstrated 5 years after delivery of retroviral vectors into the
peritoneal cavity of early gestation fetal sheep at laparotomy  (  24  ) .
In early gestation, delivery of adenovirus vectors into the umbilical
vein of fetal sheep via hysterotomy resulted in widespread trans−
duction of fetal tissues  (  25  ) . Using ultrasound−guided injection,
systemic vector spread and widespread tissue transduction was
demonstrated after  ﬁ rst trimester intraperitoneal injection of aden−
ovirus vectors into fetal sheep, although direct injection of the
umbilical vein was limited by the procedure−related high mortality
in late  ﬁ rst trimester  (  26  ) .
More recently, using a self−complementary AAV8 vector
expressing the hFIX gene which has a high transduction capacity in
mice and macaques  (  27  ) , long−term hFIX expression has been
demonstrated after ultrasound−guided intraperitoneal injection of
fetal sheep in early and late gestation  (  28  ) . No functional antibod−
ies could be detected against the vector or transgene product and

172 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
there was no liver toxicity observed. Antibodies to the therapeutic
gene were detectable when the animals were challenged at 6 months
of age postnatally with the hFIX recombinant protein, showing
that induction of immune tolerance was not achieved. This is prob−
ably due to the fall in hFIX expression that was undetectable by
1 year after birth and a higher initial vector dose may be required
to maintain hFIX levels. Umbilical vein delivery in fetal non−human
primates of a tenfold higher dose of the same self−complementary
AAV system in late gestation produced clinically relevant levels of
hFIX sustained for over a year, with liver−speci ﬁ c expression and a
non−neutralizing immune response  (  29  ) .
Hemophilia A and B do not usually manifest until after birth.
De ﬁ ciency of some clotting factors, however, can lead to life−
threatening neonatal central nervous system hemorrhage. For
example, congenital factor VII de ﬁ ciency, the most common auto−
somal bleeding disorder, is typi ﬁ ed by severe or lethal bleeding in
around 20% of patients with a homozygous or compounds
heterozygous genotype. They present with <1% of normal levels
and often present bleeding in the central nervous system  (  30,   31  ) .
A therapy delivered during the fetal period could avoid long−term
pathology and provide therapeutic transgene expression for life.
Moreover, increasing expression even above 1% would be consid−
ered enough to substantially improve the risk and incidence of
spontaneous hemorrhage  (  31,   32  ) .
A second bleeding diathesis, which would bene ﬁ t from a fetal
or early neonatal gene therapy approach is congenital factor X
de ﬁ ciency. As per factor VII, factor X is synthesized by hepatocytes
and constitutes a central component of the coagulation cascade. In
its severest form it can present at birth as severe and fatal intracra−
nial hemorrhage  (  33  ) . The Rosen laboratory generated a strain of
mouse with a disruption of the factor X gene, which manifests as
partial embryonic lethality or fatal neonatal bleeding  (  34  ) . The
same laboratory went on to perform fetal injection of wild−type
hepatocytes into factor X−de ﬁ cient recipients and were able to
achieve phenotypic rescue  (  35  ) .
  Inherited abnormalities of hemoglobin (Hb), a tetramer of two
a −like and two  b −like globin chains, are a common and global
problem. Over 330,000 affected infants are born annually world−
wide, 83% with sickle cell disorders and 17% with thalassaemias
(  36  ) . Screening strategies can be premarital and/or antenatal
depending on socio−cultural and religious customs in different
populations and countries. Prenatal diagnosis is available in many
countries from 11 weeks of gestation using chorionic villus sam−
pling or amniocentesis from 15 weeks.
The  b −thalassemias, including the hemoglobin E disorders, are
not only common in the Mediterranean region, South−East Asia,
the Indian subcontinent, and the Middle East but have spread to
4.2. The
Thalassaemias and
Sickle Cell Disorders

18 A.L. David and S.N. Waddington
much of Europe, the Americas, and Australia owing to migration
of people from these regions. Approximately 1.5% of the global
population are heterozygotes or carriers of the  b −thalassemias.
In the most severe form of  b −thalassaemia, Cooley’s anemia or
b −thalassaemia major, there is a profound anemia that if untreated,
leads to death in the  ﬁ rst year of life. Even a mild correction of the
globin chain imbalance in a fraction of maturing erythroblasts
reduces the morbidity caused by ineffective erythropoiesis, and
improves outcome  (  37  ) . Affected children become dependent on
regular blood transfusions, leading to iron deposition, organ fail−
ure, and death. Chelation therapy to remove the circulating iron is
not effective. Postnatal allogeneic haematopoietic stem cell trans−
plantation (HSCT) has been developed over the last 30 years and
can cure the condition with recent results of 90% survival and 80%
thalassaemia−free survival  (  38  ) . However, HSCT is only available
in approximately 30% of cases because of the lack of a suitable
matched donor  (  37  ) , and it is associated with complications such
as Graft Versus Host Disease.
In alpha−thalassemia there is a de ﬁ cit in the production of the
Hb  a  globin chains. Underproduction of  a  globin chains gives rise
to excess  b −like globin chains which form tetramers, called Hb
Bart’s in fetal life and HbH in adult life. Compound heterozygotes
and some homozygotes for  a −thalassaemia have a moderately
severe anemia with HbH in the peripheral blood. Finally, some
individuals who make very little or no  a  globin chains, have a severe
anemia, termed Hb Bart’s hydrops fetalis syndrome which is com−
monly diagnosed prenatally and which, if untreated causes death in
the neonatal period  (  39  ) .
Sickle cell disorders are caused by Hb gene variants that similar
to thalassaemia reduce mortality from falciparum malaria in carriers,
and leads to high carrier levels in malaria endemic countries. The
abnormal HbS cells in the circulation leads to recurrent painful
sickle cell crises. Current treatment relies on a number of strategies
to prevent crises from occurring using, for example, prophylactic
antibiotics, pneumococcal vaccination and good hydration, and
effective crisis management using oxygen and pain−relief  (  40  ) .
Effective gene therapy in thalassaemia and sickle cell disease
will depend on understanding the regulation of the globin genes.
In  b −thalassaemia, for example, the tissue and developmental−
speci ﬁ c expression of the individual globin genes is governed by
interactions between the upstream  b −globin locus control region
( b −LCR) and the globin promoters  (  41  ) . Amelioration or even
cure of mouse models of human sickle cell disease  (  42  )  and
b −thalassemia major  (  43–  45  )  has been achieved using lentivirus
vectors that contain complex regulatory sequences from the LCR
region. Injection of this optimized lentiviral vector into the yolk−
sac vessels of fetal mice at mid−gestation resulted in human alpha−
globin gene expression in the liver, spleen, and peripheral blood in

192 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
newborn mice and expression peaked at 3–4 months reaching 20%
in some recipients  (  46  ) . Expression declined at 7 months of age
(normal lifespan 2–3 years) possibly due to insuf ﬁ cient HSC trans−
duction or the late stage of mouse gestation at which the vector
was introduced. Work is continuing using a lentivirus vector sys−
tem that has a natural tropism for the haematopoietic system by
way of a ubiquitous chromatin opening element (UCOE) aug−
mented spleen focus forming virus (SFFV) promoter/enhancer
(  47,   48  ) . This provides reproducible and stable function in bone
marrow stem and all differentiated, peripheral haematopoietic cell
lineages  (  49  )  and may improve long−term expression.
The potential for an ex vivo gene transfer approach for the
treatment of thalassaemia was recently demonstrated in an adult
patient with severe  b −thalassaemia who had been dependent on
monthly transfusions since early childhood. After autologous trans−
plantation of gene−modi ﬁ ed haematopoietic stem cells using a
lentivirus encoding  b −globin, he became transfusion independent
for at least 21 months. Blood hemoglobin was maintained between
9 and 10 g/dl, of which one−third contained vector−encoded
b −globin. The therapeutic effect is due to dominance of a myeloid−
based cell clone. Integration of the vector into the host chromosomal
site AT−hook 2 (HMGA2) of this clone resulted in transcriptional
activation of high mobility group protein (HMGA2) expression in
erythroid cells and caused truncation of an inhibitory microRNA−
binding site in this gene. The observed cell expansion could be a
stochastic and fortuitous event or the result of dysregulation of the
HMGA2 gene expression in myeloid stem/progenitor cells  (  50  ) .
Further research is needed to determine whether this clone remains
homeostatic or whether its development may be a prelude to
multistep leukemogenesis, a problem that has been observed in
ex vivo autologous stem cell gene therapy for severe combined
immunode ﬁ ciency  (  51  ) .
  The fetal lung is an ideal target for prenatal gene therapy because
transduction of the  ﬂ uid− ﬁ lled fetal lungs may be achieved more
easily than in postnatal life, where there is an air−tissue interface.
Postnatal lung damage also reduces gene transfer  (  52  ) . Candidate
diseases for lung−directed prenatal gene transfer include cystic
ﬁ brosis (CF), alpha−1 antitrypsin de ﬁ ciency, surfactant protein B
de ﬁ ciency, and pulmonary hypoplasia.
Cystic  ﬁ brosis (CF) is a common lethal autosomal recessive
disease in which tissue injury begins in the prenatal period  (  53  ) .
The potential targets for CF lung manifestations are the ciliated
epithelial cells and ducts of the submucosal glands, where the wild−
type CF transmembrane conductance regulator (CFTR) protein is
expressed. Correction of as few as 6% of the defective cells may be
suf ﬁ cient to correct the chloride transport defect  (  54  ) . Although
CF is a multisystem disease, much of the morbidity and mortality
4.3. Cystic Fibrosis

20 A.L. David and S.N. Waddington
derives from the diseased lung. Here the classical gene therapy
target is the ciliated epithelial cells and ducts of the submucosal
glands in the lungs where the wild−type CFTR protein is normally
expressed  (  55  ) . Gastrointestinal manifestations of CF are now
increasingly recognized as an important contributor to morbidity
in those patients who reach adulthood  (  56  ) , as well as affecting
15% of neonates with the life−threatening condition of meconium
ileus  (  57  ) . With the advent of prenatal screening for CF, the pos−
sibility of offering treatment to couples whose fetus is affected
becomes more real  (  58  ) .
Around 400 CF patients have been given gene therapy postna−
tally using viral and nonviral gene transfer agents through mainly
nebulized systems  (  59  ) . Early trials established the safety of adeno−
virus and nonviral vectors but CFTR expression was hindered by
the low transduction ef ﬁ ciency of both vector classes on the respi−
ratory epithelium, partly due to the location of the adenovirus
receptor in the basolateral membrane of the respiratory epithelium
which is isolated from the lumen by tight junctions  (  60  ) . In addi−
tion, a robust immune response caused a dose−dependent
in ﬂ ammation and pneumonia related to the immunogenicity of
the viral proteins that prevented repeat administration  (  61  ) . Based
on these shortcomings other vectors were developed for clinical
use, such as AAV2 which in clinical trials has reduced toxicity and
immunogenicity  (  62,   63  ) . Unfortunately, these phase I/II trials
were in general unsuccessful due to neutralizing antibodies that
prevented reliable repeat vector administration. Other vector sys−
tems that have been investigated for gene transfer to the lung
include AAV1 and  ﬁ ve in the rat  (  64  )  and helper−dependent aden−
ovirus vector, incorporating a human epithelial cell−speci ﬁ c expres−
sion cassette in the rabbit lung  (  65  ) .
The only present clinical trial for CF uses nonviral gene trans−
fer agents such as polyethylenimine (PEI), cationic lipid 67 (GL67),
and DNA nanoparticles which may generate less of an immune
response. Proof−of−principle studies on the nasal epithelium show
a 25% correction of the molecular defect  (  66  )  and expression of
hCFTR is seen in sheep transfected with a human CFTR plasmid,
complexed with GL67  (  67  ) .
One of the barriers to effective gene transfer to the airways in
the adult or neonate with CF is that in ﬂ ammation and damage of
the lung precludes effective gene delivery. This could be overcome
if gene therapy is applied at a stage of prenatal life where no or
minimal lung damage has occurred. Importantly, the fetal lungs
are  ﬂ uid  ﬁ lled and transfection of the  ﬂ uid− ﬁ lled fetal airways may
be more easily achieved. Fluorocarbon liquids such as per ﬂ ubron
have been used to push vector into the distal fetal airways from
injection at the trachea  (  68  )  and have been shown to enhance
adenovirus−mediated gene expression in normal and diseased rat
lungs  (  52  ) . The proliferating cell population in CF airways are

212 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
mainly basal cells  (  69  )  and these would be the best target in any
gene therapy approach.
Initial studies appeared promising, with a report that CFTR−
knockout mice could be cured by prenatal adenovirus administra−
tion into the amniotic  ﬂ uid  (  70  ) . Since the fetus draws amniotic
ﬂ uid into the lungs during fetal breathing movements, intra−amniotic
delivery could provide an ef ﬁ cient route of gene transfer to the
airways. Two further studies using the same vector, delivery method
and mouse strain as well as a different CFTR−knockout mouse
strain have, however, been unable to replicate these  ﬁ ndings  (  71,
  72  ) . The high spontaneous survival rate of the CF−mouse strain
used in Larson’s experiments may explain the initial enthusiasm for
the results observed  (  70  ) . In addition, the inability to cure CF in
this model might be due to the strain of mice used, the vector con−
struct which only gives short−term gene transfer  (  73  ) , or on account
of insuf ﬁ cient fetal breathing movements. Nevertheless, gene
transfer to human fetal lungs is achievable in a xenograft model in
SCID mice with long−term expression in the surface epithelial and
submucosal gland cells observed up to 4 weeks and 9 months after
administration of adeno−associated and lentiviral vectors, respec−
tively  (  74,   75  ) .
Transgene expression in the fetal mouse lung can be improved
by increasing fetal breathing movements using a combination of
intra−amniotic theophylline administration and exposure of the
dam to elevated CO
2
  levels  (  76  ) . Theophylline has a similar effect
on breathing movements in fetal sheep  (  77  ) . Much of the vector
was diluted in the amniotic  ﬂ uid volume and not concentrated in
the organ(s) required for CF therapy as strong gene transfer to the
skin occurred after intra−amniotic delivery  (  76  ) .
In large animals such as the fetal sheep we were unable to pro−
duce signi ﬁ cant airways gene transfer after intra−amniotic adenovi−
rus vector injection in the  ﬁ rst trimester although the nasal passages
were transduced  (  26  ) . Fetal breathing movements are not present
in the  ﬁ rst trimester human or sheep fetus, and the large amniotic
ﬂ uid volume even at this gestation means that a more targeted
approach to the lung may be required in clinical practice.
Several studies have applied adeno−associated virus vectors
(AAV), many using the amniotic route. Injection of AAV2 into rab−
bit amniotic  ﬂ uid transduced the trachea and pulmonary epithelium
of the fetus  (  78  )  and prolonged gene expression was seen in further
studies in mice, rats, and macaques  (  79  ) . Gene delivery to the lung
parenchyma can also be achieved by indirect means using AAV, by
intraperitoneal injection, for example  (  80  ) . Similarly, injection of
AAV1 and AAV2 into mouse muscle, peritoneal cavity, and intrave−
nously gave lung expression of the transgenic protein  (  81  ) .
Local injection of the lung parenchyma is an alternative to the
amniotic route but gives only local gene transfer in fetal rats  (  82,   83  )
and non−human primates  (  84  ) . The stage of gestation is important,

22 A.L. David and S.N. Waddington
with transgene expression more local to the lung after vector
injection in early second trimester (pseudoglandular stage) when
compared to the late  ﬁ rst trimester (embryonic stage)  (  85  ) .
In larger animals, injection of the fetal trachea by transthoracic
ultrasound−guided injection  (  86  )  targets gene transfer to the
medium to small airways  (  68  ) . Increased transgene expression in
the fetal trachea and bronchial tree was seen after complexation of the
virus with DEAE−dextran, which confers a positive charge to
the virus, and pretreatment of the airways with sodium caprate,
which opens tight junctions in the airway epithelia thereby improv−
ing vector access to the coxsackie−adenovirus receptors  (  68,   87  ) .
For gastrointestinal CF pathology widespread intestinal transduc−
tion was achieved using ultrasound−guided gastric injection in the
early gestation fetal sheep  (  88  )  that had an associated low morbid−
ity and mortality. Transgene expression was enhanced after
pretreatment of the fetal gut with sodium caprate after adenovirus
complexation with DEAE−dextran. In addition, instillation of the
ﬂ uorocarbon per ﬂ ubron after virus delivery resulted in tissue trans−
duction from the fetal stomach to the colon.
Another potentially important application of prenatal gene
therapy to the lung lies in fetuses affected with congenital dia−
phragmatic hernia (CDH), a condition where lung hypoplasia
causes signi ﬁ cant morbidity and mortality. Adenovirus−mediated
prenatal CFTR expression enhanced saccular density and air space
in the lungs of a rat model of CDH  (  89  ) . Short−term expression of
growth factors at a critical stage of lung growth may be useful for
this serious condition. After surgical creation of CDH in fetal
sheep, nonviral vector expression of keratinocyte growth factor in
the trachea lead to increased surfactant protein B synthesis in the
lungs suggesting better maturation of the regrowing lung  (  90  ) .
  Early lethal genetic diseases of the nervous system are individually
rare, yet collectively lead to a large disease burden, and in some
populations have a high prevalence  (  91  ) . Conditions can directly
affect the nerves themselves, such as spinal muscular atrophy
(SMA), a disease primarily of the peripheral nervous system.
Alternatively, enzyme de ﬁ ciencies can lead to a damaging buildup
of lysosomal substrates that damage neurons, as well as other
organs in the body. Examples include the lysosomal storage dis−
eases such as acute neuronopathic (Type II) Gaucher disease, neu−
ronal ceroid lipofuscinoses, and Niemann–Pick disease type C. In
some cases, these conditions are not recognized during fetal life on
prenatal ultrasound examination. For example, there are a few case
reports that some fetuses with SMA have increased nuchal translu−
cency; however, a recent study in 12 women with affected fetuses
did not  ﬁ nd any association  (  92  ) . In Niemann–Pick disease type C,
however, in utero splenomegaly, hepatomegaly, ascites, fetal growth
restriction, and oligohydramnios (reduced liquor volume) are
common  (  93  ) . Screening programs are available in populations
4.4. Diseases
of the Nervous System

232 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
with high prevalence such as the Ashkenazi Jews, where triple
disease screening for Tay–Sachs disease, type 1 Gaucher disease,
and cystic  ﬁ brosis (CF) are commonly performed together  (  94  ) .
Prenatal diagnosis is available for these conditions via chorionic
villus sampling assuming the gene defect is known.
  The lysosomal storage diseases are inherited de ﬁ ciencies of lyso−
somal enzymes that lead to intracellular substrate accumulation.
In mucopolysaccharidosis type VII (MPS type VII), for example, a
de ﬁ ciency of  b −glucuronidase activity leads to accumulation of gly−
cosaminoglycans in lysosomes  (  95  )  leading to enlarged liver and
spleen, growth and mental retardation, and death from cardiac fail−
ure. Lysosomal storage diseases can manifest during intrauterine
life as nonimmune hydrops  (  96  ) . Although rare, MPS VII has been
a disease of choice to investigate gene therapy because of the avail−
ability of a mouse and dog model. Correction of the MPS pheno−
type theoretically requires only low levels of the therapeutic gene
product  (  97  ) . Neonatal injection of a retrovirus vector in MPS VII
dogs and mice resulted in hepatocyte transduction, with uptake of
the enzyme from the circulation by other organs. The treated ani−
mals did not develop cardiac disease or corneal clouding and skel−
etal, cartilage, and synovial disease was ameliorated  (  98  ) . Nonviral
mediated gene transfer to the liver of MPS I and VII mice also
improved the phenotype  (  99  ) . Still, the major challenge remains to
target the brain which currently requires multiple brain injections
with accompanying risks  (  100,   101  )  and immunosuppression to
prevent pan−encephalitis that develops secondary to an immune
response to the transgene  (  101  ) . Widespread correction of the
pathological lesions in an MPS VII mouse was recently observed
with adeno−associated virus gene transfer  (  102  ) , a vector which
elicits less of an immune response. Prenatal gene delivery is an alter−
native strategy. Injection of adenovirus into the cerebral ventricles
of fetal mice led to widespread and long−term gene expression
throughout the brain and the spinal cord  (  103  ) . In the same study,
delivery of a therapeutic gene to the cerebral ventricles of fetal MPS
type VII mice prevented damage in most of the brain cells before
and until 4 months after birth. A similar study using an AAV vector
had comparable results but with longer expression  (  104  ) .
From a translational perspective, direct vector administration
into the fetal brain or ventricles for prenatal gene transfer is unap−
pealing. There are technical dif ﬁ culties in injecting the fetal brain
through the skull using minimally invasive injection techniques,
although this has been achieved in non−human primate  (  105  )  and
sheep (A.L. David, unpublished work) under ultrasound guid−
ance. In contrast, ultrasound−guided access to the human fetal cir−
culation is commonly used for fetal blood sampling and transfusions
in clinical practice, with minimal fetal loss rate or complications
(  106  ) . This triggered the hunt for vectors that could cross the
blood/brain barrier.
4.4.1. The Lysosomal
Storage Diseases

24 A.L. David and S.N. Waddington
Recently, AAV vectors of serotypes 2/9 have been shown to
have an astonishing ability to transduce cells of the nervous system,
achieved not by intracranial but via intravenous injection in neona−
tal mice  (  107,   108  ) , cats  (  108  ) , and non−human primates  (  109  ) .
The ability of the vector to cross the blood–brain barrier may
depend on speci ﬁ c populations of receptors within the brain that
facilitate transfer for particular AAV serotypes  (  110  ) . A recent study
describing fetal intravenous injection of AAV 2/9 in either single−
stranded or self−complementary format showed comprehensive
transduction of the central nervous system, including all areas of
the brain and retina, and the peripheral nervous system including
the myenteric plexus. Interestingly, the single stranded version,
containing a woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regula−
tory element (WPRE) achieved far higher and more comprehen−
sive levels of expression than the self−complementary vector lacking
WPRE  (  111  ) .
Prenatal gene transfer has also been applied with some success
in glycogen storage disease type II (GSDII), which is caused by a
de ﬁ ciency in acid  a −glucosidase (GAA). This leads to lysosomal
accumulation of glycogen in all cell types and abnormal
myo ﬁ brillogenesis in striated muscle with death from respiratory
failure. Delivery of the AAV− GAA  vector by intraperitoneal injec−
tion to the mouse embryo in knockout models gave high−level
transduction of the diaphragm and restoration of its normal con−
tractile function  (  12  ) .
Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs), known collectively as
Batten disease, are autosomal recessive lysosomal storage diseases
which have lead to signi ﬁ cant central nervous system pathology.
Infantile NCL, caused by mutations in the CLN1 gene, results in
de ﬁ ciency in palmitoyl protein thioesterase 1 (PPT1). Patients with
the disease are born with no pathological manifestations but by
12 months of age they show signs of mental retardation, motor
dysfunction, and visual problems  (  112  )  and survive only to 6 years
of age, on average. A mouse model of this disease shows many of
the same pathological symptoms and premature death occurs by
8.5 months  (  113  ) . Although there have been no attempts as yet at
treating this model by fetal gene therapy, there is a strong case to
be made for this in a preclinical and clinical setting.
  Spinal muscular atrophy (SMA) is characterized by degeneration of
the lower motor neurons in the anterior horn of the spinal cord
and the brainstem. Although rare (incidence 1:10,000)  (  114  ) ,
SMA is invariably fatal after a course of progressive muscle weak−
ness and atrophy. It is caused by homozygous loss or mutation in
the telomeric survival motor neuron gene 1 (SMN 1) with subse−
quent neuronal cell death through apoptosis. Affected individuals
can be partially protected by the presence of an increased copy
number of the SMN2 gene  (  114  ) , a nearly identical copy gene of
4.4.2. Spinal Muscular
Atrophy

252 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
SMN1, that produces only 10% of full−length SMN RNA/protein.
This suggests that SMN2 may play a disease−modifying role and
could be a target for gene therapy of the disease.
The childhood forms which are all autosomal recessive can be
divided into three types depending on their severity  (  115  ) . The
fetal form of the disease, type 0, presents in utero with diminished
fetal movements and arthrogryposis  (  116  ) . Neuronal degeneration
and loss in SMA type I begins during intrauterine life which makes
prenatal gene therapy an attractive option  (  117  ) . Vectors derived
from adenovirus, herpes simplex virus (HSV), adeno−associated
virus (AAV), and lentivirus are capable of transducing neurons
in vitro and in vivo  (  115  ) . Neuroprotective factors such as car−
diotrophin 1  (  118  )  or anti−apoptotic proteins such as Bcl−xL can
be used, for example, adenovirus Bcl−xL has been shown to inhibit
neuronal cell death in rat cell cultures  (  119  ) . SMN gene replace−
ment is also possible. Multiple intramuscular injections of a RabG–
EIAV lentivirus vector containing the human SMN gene increased
SMN protein levels in SMA type 1  ﬁ broblasts and in SMA mice
and reduced motor neuron death  (  120  ) .
Lower motor neurons can be targeted by direct injection of
the spinal cord which, although successfully achieved in the rat and
mouse postnatally  (  121,   122  ) , is technically risky in the adult
human. Injection of an AAV8 containing the human SMN gene
into the CNS of SMA mice improved mortality  (  123  )  although
they still died prematurely despite continual, high−level expression
from the viral vector, which may have been due to a failure to cor−
rect the autonomic system that regulates cardiac function.
An alternative is remote delivery, and motor neuron gene
expression has been achieved by intramuscular or intra−axonal injec−
tion with subsequent retrograde axonal transport in small animals
(  124,   125  ) . A therapeutic effect was documented after intramuscu−
lar injection of adenovirus−cardiotrophin 1 in a mouse model of
SMA  (  118  ) . It is not clear, however, if remote delivery will be effec−
tive in larger animals or an affected human where the peripheral
nerves are much longer and retrograde transport is impaired sec−
ondary to the disease. Fetal application in this context may provide
the advantage of a shorter and healthy axon and recent results in
mice suggest that a fetal approach is feasible. Using lentivirus vec−
tors, that are ef ﬁ cient at infecting nondividing cells Rahim et al.
observed transduction of multiple dorsal root ganglia and efferent
nerves following intrathecal injection of an EIAV (equine infectious
anemia virus) lentivirus vector into fetal mice at 16 dpc  (  126  ) .
Systemic delivery using AAV vectors is probably the way for−
ward and might also correct the cardiac dysfunction that occurs.
Foust et al. incorporated SMN cDNA into the 2/9 vector serotype
and showed that neonatal intravenous injection of this vector into
the corresponding mouse model of SMA resulted in an unprece−
dented improvement in survival and motor function  (  127  ) . Using

26 A.L. David and S.N. Waddington
a self−complementary AAV9 vector containing a codon−optimized
SMN1 sequence injected intravenously on day 1 postnatal,
Dominguez et al. achieved 100% rescue of a mouse model of severe
SMA, completely corrected motor function and reduced the weight
loss associated with this model  (  128  ) .
  The inherited inborn errors of metabolism result from enzyme
de ﬁ ciencies in different metabolic pathways. One of the  ﬁ rst meta−
bolic disorders targeted by gene therapy is the defect in the urea
cycle, ornithine transcarbamylase de ﬁ ciency (OTC), an X−linked
condition which results in accumulation of ammonia with resul−
tant repeated episodes of hyperammonemia within 1 week of
life, damaging the central nervous system and jeopardizing life
(  129,   130  ) . A phase I trial targeting the liver through intra−arterial
adenovirus injection ended with low level gene transfer and a fatal
immune reaction in one of the 17 patients  (  131,   132  ) . Subsequent
investigation in small animals focused on less immunogenic vectors
and showed that long−term correction of the metabolic defect in
OTC de ﬁ ciency could be achieved using a helper−dependent aden−
ovirus vector  (  133  )  and AAV  (  134  ) . Because of the dif ﬁ culties with
postnatal OTC de ﬁ ciency gene therapy and the severity and very
early onset of the complete form, fetal gene therapy may be a good
approach.
A notable success in small animal models is in the long−term
correction of bilirubin UDP−glucuronyltransferase de ﬁ ciency in
fetal rats using a lentivirus vector  (  11  ) . Humans who suffer from
this defect are classi ﬁ ed as having Crigler–Najjar type 1 syndrome
and suffer severe brain damage early in childhood due to the inabil−
ity to conjugate and excrete bilirubin. A rat model of Criggler–
Najjar was injected with a lentivirus vector carrying the gene for
bilirubin UDP−glucuronyltransferase. The treated rats sustained a
45% decrease in serum bilirubin levels for more than a year, a level
that would be considered therapeutic in the human  (  11  ) . Despite
the long−term expression, these rats developed antibodies against
bilirubin UDP−glucuronyltransferase  (  135  ) , which may be related
to the fact that the fetal injection was done late in fetal life and to
the unusual immunogenicity of the transgenic protein.
Intravascular vector delivery in small animals can give excellent
liver transduction but in larger animals such as the fetal sheep, the
intraperitoneal route seems to be the best route to target gene
transfer to the fetal liver  (  26  ) , and no immune response to the
transgenic protein was detected after injection of adenovirus vec−
tors in early gestation. Direct intrahepatic injection resulted in low
level gene transfer with necrosis of the liver around the injection
site, which was thought to be due to a direct toxic effect of adeno−
virus vector on hepatocytes  (  26  ) . Studies of intrahepatic injection
using other vectors such as lentivirus or AAV show better results.
4.4.3. The Urea Cycle
Defects

272 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
In the non−human primate, intrahepatic or intraperitoneal (IP)
vector injection resulted in widespread gene transfer and particu−
larly to the liver, with no transplacental transfer to the mother
(  136–  139  ) . In one of these studies, however, IP injection of lenti−
virus vector at the end of the  ﬁ rst trimester showed that a subset of
female but not male germ cells were transduced  (  137  ) . In the
ovary, meiosis begins in the innermost areas of the cortex during
the 12th and 13th weeks of gestation, while proliferating primor−
dial germ cells forming the oocytes are found in the most super ﬁ cial
areas of the cortical region of the developing ovary, and these may
be vulnerable to lentiviral gene transfer when delivered early in
gestation via the IP route. Since IP injection is a relatively safe and
well−studied ultrasound−guided fetal injection method  (  140  ) , this
is likely to be the route of choice when compared to liver injection,
which is used rarely in fetal medicine for diagnosis of congenital
liver disease. The risk of germline gene transfer in female fetuses
will need to be evaluated carefully.
Metabolic diseases other than ornithine transcarbamylase
de ﬁ ciency and bilirubin UDP−glucuronyltransferase de ﬁ ciency that
could bene ﬁ t from fetal gene therapy to the liver are phenylketo−
nuria, galactosemia, and long−chain acyl−CoA dehydrogenase
de ﬁ ciency.
  Targeting the muscle for gene delivery could be a successful strat−
egy for treatment of muscular dystrophies. Duchenne muscular
dystrophy (DMD) is the commonest form and is X−linked.
Abnormal or absent dystrophin leads to progressive muscle weak−
ness in early childhood, culminating in death secondary to respira−
tory or cardiac failure during the third decade of life. For a one
step prenatal gene therapy, the striated muscles in the limbs and
chest, and the cardiac muscle would need to be transduced.
Prenatal diagnosis is available, and carriers can be screened for the
presence of a male fetus using noninvasive prenatal diagnosis,
avoiding the need for invasive tests and the associated miscarriage
risk in 50%  (  141  ) .
In adult clinical trials, dystrophin gene transfer to striated mus−
cle using viral  (  142  )  and nonviral vectors  (  143  )  has been hampered
by low ef ﬁ cacy because of the development of cellular and humoral
immunity to the transgenic dystrophin gene  (  144,   145  ) . This could
be avoided by prenatal application, which would also target a rap−
idly proliferating population of myocytes that are present in the
fetus. Satellite cells that are capable of regenerating muscle  ﬁ bers
are transduced after intramuscular lentivirus vector delivery to fetal
mice  (  146  ) . Importantly, inducible dystrophin expression begun
during fetal life corrected the phenotype in a DMD mouse model,
where postnatal expression did not  (  147  ) , supporting a fetal
approach.
4.5. Muscular
Dystrophy

28 A.L. David and S.N. Waddington
Intramuscular fetal injection of an adenovirus containing the
full−length murine dystrophin gene in the mdx mouse model of
DMD conferred effective protection from cycles of degeneration
and regeneration normally seen in affected muscle  ﬁ bers  (  148  ) ,
but gene transfer level was low. More ef ﬁ cient gene transfer to all
necessary muscle groups was seen after delivery of lentivirus vec−
tors to fetal mice using multiple routes of injection. Systemic deliv−
ery targeted the heart, direct injection transduced the limb
musculature and intraperitoneal injection reached the diaphragm
and innermost costal musculature. Expression lasted for over
15 months and did not stimulate any immune response  (  149  ) .
Large animal muscle gene transfer has been investigated. Gene
delivery to the hindlimb musculature of the early gestation fetal
sheep using ultrasound−guided injection of adenovirus vectors
resulted in highly ef ﬁ cient gene transfer with a low procedure com−
plication rate  (  26  ) . A clinically relevant method for respiratory
muscle gene transfer has also been evaluated in early gestation fetal
sheep and showed that transduction of intercostal muscles occurred
after ultrasound−guided creation of a hydrothorax into which
adenovirus vectors were introduced  (  150  ) .
There has been considerable recent success using AAV vectors
to transduce fetal musculature. Early studies on AAV showed long−
term local transgenic protein expression following direct injection
into fetal mouse muscle  (  151  )  and transduction of the diaphragm
after IP injection  (  152  ) . Using this route to administer AAV1,
Rucker and colleagues restored acid  a −glucosidase activity to the
diaphragm in a mouse model of Pompe disease  (  12  ) . This was the
ﬁ rst demonstration that fetal gene transfer could correct a model of
congenital muscle pathology. More recently, studies on intraperi−
toneal delivery of AAV8 into normal fetal mice show high levels of
marker gene expression in all the muscle groups affected by con−
genital muscular dystrophies  (  153  ) , and in the mdx mouse model
of DMD, delivery of an AAV containing dystrophin signi ﬁ cantly
improved the dystrophic phenotype  (  154  ) . Postnatal application of
AAV6 containing full length and micro−dystrophins in neonatal
mice can almost entirely prevent and partially reverse the pathol−
ogy associated with DMD, but only near the site of injection  (  155  ) .
In late−gestation macaques, umbilical vein injection of AAV9 results
in very high levels of transgenic protein expression in many tissues
including skeletal and cardiac muscle  (  29  ) . Systemic delivery
of AAV vectors in the fetus may  ﬁ nally provide a solution to target
the necessary muscle groups for muscular dystrophy therapy.
However, the packaging capacity of AAV is restricted to delivery of
truncated dystrophin minigenes which may negatively counteract
the ef ﬁ ciency of this vector system.
Exon skipping is another strategy that is proving quite
successful. An antisense oligonucleotide is used to modify splicing,

292 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
such as skipping of the mutated exon 51, which allows a partly
functional dystrophin protein to be produced from the muscle.
This therapy has been successful in the  mdx  mouse and a dog
model of DMD, and there are currently three phase III trials inter−
nationally  (  156  ) .
  The genodermatoses are a group of genetic skin diseases that may
be associated with signi ﬁ cant morbidity and mortality. Examples
include the epidermolysis bullosa (EB) disorders, the ichthyotic dis−
orders, and disorders of pigmentation such as oculocutaneous albi−
nism. Methods of prenatal diagnosis are varied. Where the molecular
defect is known, amniocentesis or chorionic villus sampling is com−
monly used. X−linked ichthyosis is associated with low levels of
unconjugated estriol, one of the markers used for Down’s syndrome
screening, and this can prompt prenatal diagnosis in the mother.
When the gene mutation is unknown, however, fetal skin biopsy is
necessary that unfortunately carries a slightly higher fetal loss than
other invasive tests (1–3%), may result in scarring, and may need to
be performed at quite late gestations  (  157  ) . Ultrasonography can be
used in the diagnosis of a few of these disorders. In harlequin ich−
thyosis, for example, typical sonographic features include echogenic
amniotic  ﬂ uid, large joint and digital contractures and facial dys−
morphism, including  ﬂ at face and wide mouth with thickened lips.
The genodermatoses may be good candidates for prenatal gene
therapy, where gene transfer to the skin via the amniotic  ﬂ uid may
provide obvious advantage to cumbersome postnatal therapy.
Transgenic protein expression is seen in the skin after intra−amni−
otic delivery of adenoviral vectors to mice (12 days postconception
(dpc))  (  76  ) , and sheep in the early  ﬁ rst trimester (day 33 of 145 days
of gestation) using ultrasound−guided injection  (  26  ) . In a mouse
model of Herlitz junctional epidermolysis bullosa, a lethal skin dis−
ease, a combination of adenovirus and AAV vectors injected into
the amniotic cavity of fetal mice (14 dpc) led to expression of the
laminin−5 transgenic protein although only a minor increase in the
lifespan of treated mice was seen  (  158  ) . In all these studies, only
the most super ﬁ cial layers of the skin, the periderm and epidermis
were transduced. Several strategies have been used in small animals
to target the deeper layers, such as intra−amniotic injection with
subsequent electroporation  (  159  )  or application of microbubble−
enhanced ultrasound (shot−gun method)  (  160,   161  ) . Translation
to clinical practice will be challenging. Earlier in gestation, epider−
mal stem cell populations are accessible for gene transfer using the
intra−amniotic delivery route. Injection of lentivirus vectors
between day 8 and 12 dpc in fetal mice resulted in long−term trans−
genic protein expression in basal epidermal stem cells into adult−
hood  (  162  ) . Using a skin−speci ﬁ c keratin 5 promoter instead of the
cytomegalovirus promoter also improved epidermal gene transfer.
4.6. The
Genodermatoses

30 A.L. David and S.N. Waddington
  The primary immune de ﬁ ciencies result from inherited mutations
in genes required for the production, function or survival of speci ﬁ c
leukocytes such as T, B or NK lymphocytes, neutrophils and
antigen−presenting cells, or are caused by cytotoxic metabolites.
The leukocytes are produced from the pluripotent hematopoietic
stem cells (HSC) in the bone marrow, and therefore allogeneic
bone marrow transplantation (BMT) from a healthy donor into an
affected patient can restore the immune system. Successful BMT
has been achieved in de ﬁ ciencies such as Wiskott–Aldrich Syndrome
(WAS), Chronic Granulomatous Disease (CGD) and Adenosine
Deaminase De ﬁ ciency where there is toxicity rather than a defect
of the proliferation gene and in X−linked Severe Combined
Immunode ﬁ ciency (SCID). With the exception of X−SCID all of
the other primary immune de ﬁ ciencies require extra therapeutic
steps such as pre−transplant conditioning, marrow cytoreduction
to “make space” in the marrow for the transplanted HSC and
immune ablation to prevent rejection of the donor HSC. These
strategies carry risks for the patient and in some cases, a haploiden−
tical donor is unavailable. Gene therapy has therefore been devel−
oped for treatment of some patients.
Postnatal gene therapy using in vitro transduced autologous
HSCs with subsequent transplantation into the same patient has
been used successful in adenosine deaminase de ﬁ cient SCID  (  163,
  164  ) , X−linked SCID  (  165,   166  ) , and CGD  (  167  ) . Despite the
encouraging results, 4 out of 26 subjects subsequently developed a
T−cell leukemia−like condition which may have been related to
integration of the retroviral vector near a suspected proto−onco−
gene  (  168  ) . Newer approaches to decrease this risk have used len−
tivirus vectors that have been studied in non−human primates
(  169  ) . Also, semi−viral systems have been developed with the aim
to offer stable gene transfer along with a favorable pattern of inte−
gration  (  170,   171  ) . These semi−viral systems are still limited by
their low transduction ef ﬁ ciency as in the case of the sleeping
beauty transposon  (  170,   171  ) .
Prenatal gene therapy in early gestation before the maturation
of the immune system could, theoretically, eliminate the need for
marrow conditioning or the restriction to an HLA−matched donor.
Prenatal treatment with hematopoetic stem cell transplantation has
been attempted for a variety of immunode ﬁ ciencies and hemoglo−
binopathies using IP transfer of paternal or maternal hematopoi−
etic cells or fetal liver  (  172  ) ; however, the clinical successes were
mainly in cases of X−linked SCID  (  173,   174  )  where no immune
response to the transplanted cells could be mounted.
An autologous stem cell gene transfer approach  (  175  )  using
fetal stem cells from a number of sources within the fetus including
the blood, liver, amniotic  ﬂ uid (AF), and placenta could be adopted.
Fetal liver or blood sampling at an early gestational age carries a
signi ﬁ cant risk of miscarriage  (  176,   177  ) . It is now apparent that
4.7. Primary Immune
De ﬁ ciencies

312 Candidate Diseases for Prenatal Gene Therapy
pluripotent stem cells can be readily derived from fetal samples
collected at amniocentesis  (  178  )  or chorionic villus sampling
(  179,   180  ) , procedures that have a low fetal mortality. Human
AFS cells have the potential to differentiate into a variety of cell
types and can be transduced easily without altering their character−
istics  (  178,   181,   182  ) . Recent work in sheep described good fetal
survival after autologous AF mesenchymal stem cell (MSC) trans−
plantation using ultrasound−guided amniocentesis, and subsequent
IP injection of selected, expanded, and transduced AFMSCs into
the donor fetus. Widespread cell migration and engraftment, par−
ticularly in the liver, heart, muscle, placenta, umbilical cord, and
adrenal gland was seen  (  183  ) .
Prenatal diagnosis of the primary immune de ﬁ ciencies is avail−
able where the gene mutation is known. For example, it has been
applied in families that have been identi ﬁ ed to be at risk of these
conditions, such as those harboring mutations in both of the
recombination−activating genes RAG1 and RAG2 that are involved
SCID syndromes  (  184  ) .
  Prenatal gene delivery looks promising in eye and ear diseases but
translation to man will be challenging. In animal models of Leber
congenital amaurosis, a severe retinal dystrophy, fetal gene therapy
using AAV or lentivirus vectors resulted in an ef ﬁ cient transduction
of retinal pigment epithelium and restoration of visual function
(  10,   185  ) . Similarly, AAV was able to ef ﬁ ciently transfect the devel−
oping cochlea in fetal mice  (  186  ) . All these previous studies relied
on injection into the developing sensory organ itself, which will be
dif ﬁ cult to achieve in clinical practice. Vector delivery via the amni−
otic cavity early during embryonic development depends critically
on the stage of gestation. For example, intra−amniotic delivery of
lentivirus speci ﬁ cally at day 8 dpc resulted in gene transfer to the
mouse retina  (  187  )  but later delivery time points were only able to
target the lens and cornea. Greater tissue speci ﬁ city and safety can
probably be accomplished by the use of tissue−speci ﬁ c promoters,
or regulated transgene expression, but there will still be the need
for accurate prenatal diagnosis at a time of gestation equivalent to
3–5 weeks in human pregnancy, something that will be dif ﬁ cult to
achieve with current diagnostic techniques.
  Prenatal gene therapy is also being investigated for treatment of
obstetric disorders. Severe fetal growth restriction (FGR) affects
1:500 pregnancies and is a major cause of neonatal morbidity and
mortality. The underlying abnormality in many cases is uteropla−
cental insuf ﬁ ciency, whereby the normal physiology process of tro−
phoblast invasion that converts the uterine spiral arteries into a
high− ﬂ ow large conduit for blood, fails to occur. Currently, there is
no therapy available that can improve fetal growth or delay delivery
to allow fetal maturity. FGR is commonly diagnosed on routine
4.8. Diseases
of the Sensory Organs
4.9. Fetal Growth
Restriction

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studi professati. Ora questi studi riacquistano la loro patria,
risorgono rianimati, vivificati; il loro culto si svolge quotidianamente
sotto gli occhi del principe, alla portata delle sue orecchie, dei suoi
occhi, del suo esempio
[302]. E il mondo intellettuale romano torna ad
essere quale il principe dimostra nuovamente di volerlo.
VI.
Successore di Traiano fu, com’è noto, P. Elio Adriano. È ben difficile
forse trovare in tutta la storia romana un uomo politico, il quale,
come Adriano, chiuda nel proprio pensiero un senso ed un concetto
della vita, in cui insieme, e quasi organicamente e perfettamente, si
fondano l’ideale della vita greca e quello della vita romana, l’anima
pagana e l’anima cristiana, le tendenze spirituali dell’età vecchia e
quelle dell’età nuova; un uomo, che egualmente abbia unito in sè la
molteplicità dei più svariati talenti.
Poeta e prosatore, latinista e grecista, pittore e cultore di arti
plastiche, filosofo e oratore, artista e scienziato, mistico e realista,
superstizioso e scettico, generoso e implacabile, uomo di pensiero e
uomo d’azione, egli fermò il piede su tutti i campi dello scibile,
accolse e subì tutte le suggestioni, di cui è capace la grande anima
umana, e da ogni disciplina, da ogni ispirazione, scoccò una scintilla
per il suo ingegno, rilevò un tratto per la sua complessa personalità.
[303]
Chi dunque meglio di lui, chi meglio dell’imperatore letterato
[304],
rappresentante del genio greco del tempo — genio letterario,
oratorio, didascalico, filosofico — chi meglio di Adriano avrebbe
potuto fissare uno scopo sovranamente pedagogico al suo governo?
Chi meglio di lui avrebbe potuto proporsi quella creazione spirituale
delle generazioni future, ch’era l’ideale sommo degli antichi politici
greci? Chi non attenderebbe da lui un’orma assai più profonda, o
pari almeno a quella, che, nella storia della educazione nazionale
romana e italica, avevano lasciata e Augusto e Domiziano e lo stesso

Nerone? Eppure, quando noi ci rechiamo sott’occhio tutto il quadro
della politica scolastica di Adriano, troviamo che, se essa perfezionò
l’opera dei predecessori e ne colmò le lacune, non può tuttavia
aspirare a quel merito, che dall’uomo, che la curava, ci saremmo
attesi, poichè riesce a stento ad assumere una figura sua propria.
VII.
Aurelio Vittore, nelle sue biografie dei Cesari, narra che Adriano,
paragonabile in ciò ai grandi statisti della Grecia, fu il primo ad
inaugurare, in Roma, dei locali per l’educazione fisica e a interessarsi
dei maestri di discipline intellettuali
[305].
Come abbiamo visto, tale opera ha ben altri precursori e, per quanto
grande possa essere stato il merito di Adriano, esso certamente non
può dirsi originale. Ma questo non significa punto che noi non
dobbiamo soffermarci a studiare i particolari di questo frammento
dell’opera di lui.
Una sua costituzione assai notevole, che ci viene in parte riferita in
un’altra di Commodo, regola in tutti i particolari la materia delle
immunità ai retori, ai grammatici, ai filosofi, etc. Di essa non
torneremo ora ad occuparci, essendocene lungamente intrattenuti in
molte pagine di uno dei precedenti capitoli
[306], e basterà solo
rilevare come la caratteristica delle disposizioni ivi contenute fosse
quella di specificare minutamente la portata di una concessione, che
aveva già una esistenza e che vantava un’anteriore cronologia di
origine, probabilissimamente fin dall’ultimo degli imperatori Claudii.
Ma l’onore, accordato da Adriano agli uomini di lettere e di scienze,
non si limita alla riconferma delle immunità. Le frasi, che il
Panegirico di Plinio adoperava per definire il mecenatismo di Traiano,
sono da altri scrittori ripetute in forma poco diversa, per Adriano.
Egli ebbe in sommo onore e in somma intimità ogni genere di dotti:
filosofi, grammatici, retori, matematici, poeti, pittori, astrologi
[307], e

raramente, come sotto Adriano, il mecenatismo esercitò sì largo
campo di influenze e di azione; raramente i detti occuparono in tanto
numero le maggiori cariche dello Stato
[308].
Ma fece anche l’imperatore qualcosa di più, come taluno ha ritenuto?
[309] Istituì cioè delle cattedre pubbliche di retorica, di grammatica,
di filosofia, etc.? O, per lo meno, estese ad altri maestri ciò che
Vespasiano aveva largito ad uno o a più retori? L’autore della
biografia di Adriano nella Historia Augusta accenna a due generi di
atti, cioè ad onori resi da Adriano ai grammatici, ai retori e agli
oratori, anzi a tutti i docenti, che egli avrebbe eziandio arricchiti, e al
provvedimento, ancora più salutare, di avere esentato
dall’insegnamento, anzi di avere vietato l’insegnamento ai maestri,
che, per età o per malattia, ne apparissero ormai incapaci
[310].
Or bene, da questi due passi, sembra sufficientemente chiaro che
non si tratta di istituzione di cattedre ufficiali, ma, nella migliore
ipotesi, di stipendi vitalizii a maestri di grammatica, di retorica, di
filosofia etc., o anche, semplicemente, di larghi donativi del principe,
e di assegni straordinari, conferiti loro, specie all’istante del
collocamento a riposo. Nè tale interpretazione manca dall’essere
confermata da un passo delle Biografie dei sofisti greci di Filostrato,
il quale, in una lunga narrazione, che pur si occupa, e di proposito,
dei professori di eloquenza e della istituzione delle relative cattedre
ufficiali in Grecia, dice, di Adriano, soltanto che egli «fu fra gli antichi
imperatori il più disposto ad incoraggiare il merito»
[311].
Ma un altro più grave motivo ci induce a non attribuire a questo
principe quell’istituzione di cattedre pubbliche, che si è pensata. Se
così egli avesse fatto, se cioè i suoi «incoraggiamenti» a filosofi,
grammatici, retori, matematici, pittori, astrologi etc., fossero da
identificarsi con la istituzione di cattedre ufficiali, queste non
potrebbero limitarsi alla retorica e alla filosofia, come è stato fatto da
chi ha accolto tale interpretazione, ma dovrebbero riguardare
eziandio la grammatica, l’astrologia, la matematica, la pittura, tutti
cioè gli insegnamenti, che, noi positivamente sappiamo, furono
protetti da Adriano
[312] — ipotesi questa assolutamente inverosimile,

come l’ulteriore svolgimento della politica scolastica degli imperatori
assicura senza lasciare alcun dubbio.
Adriano dunque sarebbe stato il grande incoraggiatore degli studii e
dei loro diffonditori, avrebbe, a più riprese, specie nel caso di
incapacità ad un ulteriore lavoro, sovvenuto largamente i maestri più
bisognosi e più meritevoli; ma nulla induce a pensare che egli sia
stato l’autore di provvedimenti, con cui si istituivano in Roma, o
altrove, delle cattedre pubbliche per le discipline più notevoli, che
erano allora oggetto di insegnamento.
La sua opera rimane così limitata entro la cerchia delle idee e delle
misure adottate dal primo dei Flavii. Vespasiano, infatti, dicemmo,
non istituì una o più cattedre di retorica in Roma, ma solo uno
stipendio personale e vitalizio in favore di taluni retori. Coi successori
la sua iniziativa aveva subito un improvviso arresto. Con Traiano, par
certo, gli assegni vitalizi ad personam non andarono più a favore di
alcuno. Ora Adriano — saggiamente — ne riprende l’idea, che i
bisogni e le circostanze stesse imponevano, e la riprende con i
ritocchi e nella misura, che la nuova politica e la interrotta tradizione
imponevano. Egli estende il beneficio ad altri insegnanti, che non
fossero soltanto quelli di retorica; sostituisce talora, all’assegno
vitalizio, incoraggiamenti, più o meno larghi, più o meno ripetuti, ma
sempre irregolari; ne mette a parte anche i docenti delle province;
[313] fissa quelli che oggi si direbbero dei limiti di età alla carriera dei
maestri, o, piuttosto, dei limiti di carriera, quando l’età aveva fatto
manifesta l’insufficienza didattica dell’insegnante, e, in tal caso,
assicura ai maestri la restante esistenza con abbondanti assegni
vitalizii. Tutto questo è certamente meritorio, e costituisce un
progresso di fronte a Vespasiano; ma non è ancora la istituzione di
vere e proprie cattedre pubbliche, che andassero a formare un primo
nucleo di scuole medie, o superiori, o primarie, nelle varie località
dell’impero.
VIII.

Invece di una pubblica scuola, Adriano creò per essa, in Roma, un
grande locale apposito. Fin allora, grammatici, retori e filosofi erano
costretti ad appigionare dei locali, ove impartire l’insegnamento. Solo
forse i giureconsulti — come a suo luogo accennammo — avevano a
propria disposizione dei locali pubblici forniti dallo Stato.
Egualmente, i conferenzieri, i poeti, i tragici, tutta l’innumerevole
serqua dei lettori pubblici dell’età imperiale, erano, volta per volta,
costretti anch’essi a procurarsi il locale necessario alla loro pubblica
produzione letteraria. Adriano ebbe in animo — e l’ispirazione venne
a lui certamente dal mondo ellenico ed ellenistico — di innalzare un
tempio dell’insegnamento e della pubblica coltura. In Atene,
esistevano parecchi locali destinati all’insegnamento superiore:
l’Accademia, lo Stoa, il Palladion, l’Odeion, il Lyceion, il Cynosarges, il
Diogeneion, il Ptolemaion.
[314] In Alessandria, due almeno delle sale
dei due Musei erano destinate a lezioni e a conferenze scientifiche.
Come mai Roma avrebbe potuto mancarne? Sorse, così, da questa
ispirazione e con questo intendimento, l’Athenaeum romanum, un
ludus ingenuarum artium, una scuola delle discipline destinate
all’istruzione dei liberi in Roma.
[315]
Era desso un ampio auditorium in forma di anfiteatro,
[316] eretto
probabilmente sul Campidoglio,
[317] che i letterati trovavano a loro
disposizione per leggervi pubblicamente i propri scritti, e i maestri,
per impartirvi le loro lezioni.
Ma quali categorie di maestri? Tutti i passi della Historia Augusta,
che accennano all’Athenaeum, discorrono di letture di poeti o di
lezioni di retori greci e latini
[318].
Ma quell’auditorium non poteva essere aperto a questi soli docenti.
Un antico — abbiamo visto — lo chiamava ludus ingenuarum artium.
A suo dire, dunque, tutte le arti libere avrebbero potuto trovarvi
accesso, e la retorica e la grammatica e la musica e la filosofia. Ma
sarebbe inesatto dire che la natura dell’Athenaeum ci permetta una
così larga interpretazione. L’Athenaeum, attraverso tutta la sua
storia, ci appare invece come un edificio destinato a conferenze e a

lezioni, di cui il grande pubblico dei giovani e degli adulti avesse
potuto fruire. Come tale, noi dobbiamo escludere dal novero delle
arti liberali, che vi avevano accesso, la musica, che in pubblico non
poteva dar luogo a lezioni, ma solo a concerti, istrumentali e vocali,
e verso cui grandi erano le ripugnanze della pedagogia romana, la
geometria, che in Roma aveva uno scopo strettamente
professionale,
[319] ed era, non già insegnamento fondamentale, ma
una disciplina sussidiaria — lontanamente sussidiaria — di quell’arte,
che assommava in sè quasi tutti gli scopi e gli sforzi della pedagogia,
l’oratoria,
[320] e da ultimo, forse, o almeno per ora,
[321] la
grammatica, disciplina, che si rivolgeva soltanto a dei giovanetti e
faceva parte di quell’insegnamento secondario, che non può
occupare l’attenzione dei più. L’Athenaeum, qualche cosa tra
l’Università popolare moderna e la sala di conferenze, doveva
rimanere estraneo a tutto ciò; doveva, specie nelle sue origini,
essere luogo di coltura pubblica, generalissima, non istituto di
insegnamenti speciali o d’insegnamenti secondarii inferiori, ma,
sopratutto, un luogo, in cui si dispensava quella cultura, che, senza
essere impartita per ufficiale volontà superiore, era tuttavia, da
numerose condizioni, tratta ad apparire, e ad essere, oggetto di
insegnamento ufficiale. Ed è appunto perciò che noi, sebbene le
fonti, di cui disponiamo, non ce ne parlino, dobbiamo supporre che
fin da Adriano, nell’Athenaeum, insieme con l’insegnamento della
retorica, venissero impartiti quelli della filosofia e della
giurisprudenza, della quale ultima, del resto, vedremo anche più
innanzi.
È assai probabile che, all’Ateneo, Adriano abbia aggregato una
biblioteca. Forse poche circostanze erano state altrettanto favorevoli
all’idea di una simile fondazione. Un locale di istruzione pubblica, ove
si adunavano discenti e maestri, non avrebbe potuto rispondere
degnamente al suo ufficio senza una collezione di libri a portata di
mano e a disposizione degli studiosi. E poichè grande è il numero
delle biblioteche pubbliche romane, di cui non riusciamo a
rintracciare i fondatori o la cronologia della fondazione, e poichè noi
possediamo esplicita menzione di una biblioteca Capitolina
[322], di

una biblioteca, cioè, avente sede negli stessi paraggi
dell’Athenaeum, la sua origine può, fra le tante ipotesi che si sono
fatte, essere preferibilmente riferita al regno di Adriano.
[323]
Ma la politica di Adriano arrecò del pari nuovo incremento allo studio
del diritto. La carriera dei giuristi acquista fin d’ora un valore assai
maggiore che non nel passato. Anzitutto le prerogative e l’efficacia
dei responsa dei giuristi patentati crescono ancora di un grado.
Questi non hanno più un peso soltanto morale. I responsa, se
concordi, assumono valore di leggi
[324], e, solo in caso di disparità di
pareri, l’imperatore si riserva di giudicare e decidere egli stesso con
l’assistenza del suo Concilium. Ma è noto quale innovazione questo
Concilium principis avesse subìto ai tempi di Adriano. Esso, che fin
allora era stato in maggioranza un consiglio di senatori, delegati dal
senato, accoglie ora, stabilmente, nel suo seno, quali membri
ordinarii, dei giureconsulti
[325].
La carriera giuridica aperse così i migliori orizzonti ai giovani studiosi
di Roma e delle provincie, come la produzione dei giuristi riscosse,
dal governo centrale, una sollecitudine e, direi, un incoraggiamento
maggiore che nel passato. Esistevano già in Roma (e il grammatico
Gellio, riferendosi alla sua giovinezza, ne parla come di consuetudine
saldamente costituita) delle stationes ius publice docentium aut
respondentium
[326]. Come è stato notato, anche il vocabolo statio
suole indicare località pubblica ed ufficiale. Esse erano quindi
località, non private, ma proprietà del populus o del princeps
[327]. Al
tempo dunque di Adriano, ve n’era un gran numero. Ma questi —
naturalmente — dovette pensare ad assegnare, anche ai giuristi,
l’uso del nuovo stabilimento, il grande Athenaeum imperiale, nè, per
concludere in tal senso, fa bisogno di attendere una diretta
testimonianza delle fonti.
IX.

La fondazione dell’Athenaeum è certamente il tratto più caratteristico
dell’opera di Adriano, nei rapporti con l’istruzione pubblica. Ma nello
stesso campo un’altra parte della sua attività è anche notevole,
specie in quanto essa riguarda i primi provvedimenti imperiali, che si
interessino sul serio dell’istruzione pubblica nelle province.
Fino a quel giorno, per questo riguardo, la politica imperiale cadeva
ancora sotto la censura formulata nell’epistola di un filosofo, diretta a
dei magistrati romani: «Dei porti, degli edifici, dei portici, dei
passeggi pubblici taluno di Voi ha avuto cura; ma dei fanciulli, che
sono nelle città, o dei giovani, o delle donne, nè Voi, nè le leggi
romane s’interessano»
[328]. Adriano fu il primo a rompere questa
tradizione di noncuranza verso tutto ciò che non riguardasse la vita
esteriore e materiale delle città sparse nelle provincie. Ma, come
sempre in tutti gli esordi delle opere umane, ciò ch’egli fece valse
meno a creare degli utili effettivi, che ad aprire una via, che i
successori avrebbero largamente percorsa.
Le sue cure si rivolsero all’ordinamento scolastico e agli istituti di
istruzione pubblica nei due centri maggiori del mondo intellettuale di
quel tempo: Atene ed Alessandria.
In Atene, Adriano raccolse, e fondò, una splendida biblioteca, che
aggiunse all’altra del Ginnasio di Tolomeo, nonchè un nuovo
Ginnasio, la cui importanza maggiore non consiste nelle cento
colonne di pietra libica, di cui ci discorrono i touristes dell’antichità,
[329] ma nel fatto che uno dei ginnasii greci, divenuti ormai istituti
d’educazione intellettuale, oltre che fisica
[330], sorgeva, questa
volta, per le cure del governo romano.
Ma Adriano fece anche di più e di meglio: s’ingerì, con intenzioni
benevole e benefiche, nelle vicende dell’insegnamento superiore
privato di quel tempo. Conosciamo infatti, attraverso un’epigrafe, da
noi precedentemente richiamata, che rimonta al 121 di C.,
[331] un
notevole provvedimento da lui adottato a favore della scuola
filosofica degli Epicurei, e che può dirsi tornasse eziandio a
vantaggio dell’insegnamento filosofico in genere.

Accennammo a suo luogo all’altro provvedimento di Vespasiano, con
cui si vietava che dei cittadini non Romani coprissero l’ufficio di
scolarchi nelle varie scuole filosofiche ateniesi, e ne segnalammo le
deplorevoli conseguenze
[332].
Or bene, nel 121, la madre adottiva di Adriano, Plotina, intercede
caldamente, esponendone le ragioni, affinchè il figliuol suo liberi la
scuola epicurea, di cui ella si palesa seguace, da ogni pastoia, e
conceda allo scolarca ateniese del tempo, e ai suoi successori, di
poter testare — ed in lingua greca
[333] — a favore anche di stranieri;
l’imperatore, se mai, avrebbe potuto riserbarsi il diritto di approvare
e ratificare tali scelte ex lege
[334].
E la sua intercessione fu fortunata: l’epigrafe, che contiene la lettera
commendatizia dell’imperatrice, contiene anche il rescritto
dell’imperatore, che, esaudendo, in tutto e per tutto, l’istanza,
rendeva intera la libertà della scienza e dell’insegnamento alla
filosofia epicurea in Atene.
Fu poscia analoga liberalità largita da Adriano, o dai successori, alle
altre scuole filosofiche? Noi l’ignoriamo. Ma quello che a me sembra
certo si è che non possiamo, con i pochi e dubbi elementi di due o
tre epigrafi, affermare, come si è fatto,
[335] che gli scolarchi delle
altre scuole filosofiche ateniesi continuassero, anche più tardi, a
scegliersi tra i cittadini romani. La serie anzi dei nomi dei titolari delle
future cattedre di fondazione imperiale darebbe, forse, a pensare
l’opposto; e ad un opposto convincimento induce più ancora la
considerazione, che altri imperatori, successi immediatamente ad
Adriano, non potevano certamente desiderare che la scuola degli
Epicurei fosse lasciata in una relativa condizione di privilegio.
Sollecitudini maggiori Adriano dedicò al Museo alessandrino. Da
lunghi anni quell’istituto sembrava vegetare, anzichè vivere, e il più
eccelso favore, che gl’imperatori romani vi usavano, era di

continuare gli assegni necessari al mantenimento suo e dei suoi
pensionati.
Adriano, per quella predilezione, che sempre nudrì verso l’Egitto e
verso quel centro sovrano di cultura intellettuale, che fu Alessandria,
cominciò col curarsene direttamente. Anzitutto vi pose a capo una
delle persone più competenti, il sofista L. Giulio Vestino, autore di
opere filologiche e poscia procuratore delle biblioteche di Roma
[336].
Ma questo fu il meno. Vi apportò eziandio una riforma fondamentale.
Fin allora il Museo era stato un’accolta di dotti, che ivi lavoravano, ivi
erano alimentati, e forse anche abitavano. Adriano largì a parecchi
altri letterati dell’impero, specie greci, il titolo onorifico di membri del
Museo e una pensione relativa, corrispondente all’utile materiale, di
cui la lontananza da Alessandria veniva a privarli. Tra i favoriti, gli
antichi ricordano il sofista Polemone,
[337] il sofista Dionigi di Mileto,
[338] il poeta egizio Pancrate,
[339] il filosofo Elio Dionigi di
Alicarnasso
[340] e altri ancora.
[341]
I posti del Museo sono ora dunque soltanto pensioni, e la sua
mensa, mentre prima serviva ai reali bisogni dei dotti residenti in
quell’istituto, diviene un più o meno lauto stipendio agli uomini, per
speciali meriti illustri, di tutte le parti del mondo,
[342] o a coloro (e
qui risiedeva l’inevitabile pericolo dell’innovazione), che l’imperatore
avesse voluto giudicare tali. Ma fu questo certamente un progresso.
I vantaggi materiali del Museo andavano così a prodigarsi a una più
larga cerchia di persone, la libertà di scelta fu maggiore, e maggiore
il contributo, che, in seguito a codesti benefici, i dotti del mondo
sarebbero stati in grado di arrecare alla scienza.
X.
Assai interessante riesce seguire passo passo, atto per atto, lo
svolgersi e il perfezionarsi degli istituti sociali, attraverso l’opera di
uomini, che ne furono al tempo stesso gli artefici ed i pazienti. Da

Adriano, anzi da Vespasiano a Marco Aurelio, è tutta una lenta
incrostazione di provvedimenti diversi, di cui ciascuno completa, o
modifica insensibilmente, il precedente, la quale alla fine darà il fatto
nuovo, con fisonomia e individualità propria, la specifica creazione
scolastica dell’impero, che sarà l’ordinamento ufficiale dell’istruzione
superiore.
In questo lento, insensibile lavoro, assai più di Adriano, Antonino Pio
ha segnato il suo posto ed il suo ufficio.
La sua opera si inizia con la regolamentazione delle immunità ai
docenti, che raggiunge con lui una precisione ignota negli anni
trascorsi. Probabilmente, le città avevano rilevato degli inconvenienti
nell’ampiezza delle immunità ai sofisti, ai grammatici, ai filosofi in
genere. Probabilissimamente, ogni volenteroso di quel privilegio era
ormai solito dichiarare, senza eccessivo scrupolo di esattezza, la
qualità e la condizione sociale più acconcia a farglielo conseguire.
Probabilissimamente, il numero dei maestri di grammatica, di
retorica, di filosofia e d’altre discipline era, anche in virtù delle
esenzioni tradizionali, cresciuto in misura da arrecare dei danni
sensibili all’erario delle varie comunità. E con ogni probabilità noi
dobbiamo alle loro rimostranze lo schema delle norme, con cui
Antonino Pio ebbe a regolare tale materia, schema pervenutoci
attraverso l’intelligente e autorevole compendio di una costituzione
imperiale, lasciatoci dal giurista Modestino
[343].
Quella costituzione stabiliva che, nelle piccole città, le immunità
dovessero al massimo estendersi a 5 medici, 5 sofisti (maestri di
retorica),
[344] e 3 grammatici; nelle medie, a 7 medici, 4 sofisti e 4
grammatici; nelle grandi città, a 10 medici, 5 sofisti e 5 grammatici.
Dei filosofi, Antonino Pio non stabiliva il numero dei privilegiandi,
[345] ma questo — e lo desumiamo da ciò che egli s’affretta a
soggiungere — non dipendeva da una maggiore liberalità, che egli
avesse voluto usare verso quella categoria di professionisti, sibbene
dalla loro scarsezza numerica. «Io penso», egli avvertiva, «che i
filosofi ricchi offriranno volentieri alla patria le utilità, che loro
derivano dalle ricchezze; chè se, invece, cavillando, mostrassero di

fare troppo conto dei beni materiali, questo solo basterebbe a
provare che essi non sono filosofi.»
[346].
Insieme con tali norme noi possediamo di Antonino Pio altre
disposizioni, relative alla immunità dei docenti, di cui talune sono
frammenti della sopra riferita costituzione, altre sono clausole
speciali, che ne dipendono o la illuminano, cioè: a) che il diritto alle
immunità era strettamente legato al paese di origine del docente, sì
da andare perduto per chi professasse altrove;
[347] b) che però tale
disposizione era passibile di eccezione pei docenti insigni, anche in
soprannumero ed esercenti altrove;
[348] c) che la specificazione
degli oneri, o degli onori, da cui si aveva diritto di andare esenti,
rimaneva sempre quella amplissima, già fissata da Adriano;
[349] d)
che gli insegnanti primarii, di qualunque specie e grado, dovevano
andare esclusi da ogni immunità;
[350] e forse, da ultimo, anche la
norma che, fra i docenti discipline speciali, quelli di calligrafia
(librarii), i quali preparavano ad uffici di segretari, copisti etc., tanto
richiesti dalle amministrazioni pubbliche e private del tempo,
godevano la esenzione dagli oneri più gravi
[351].
Il documento principale si riferiva, in modo speciale, alla provincia di
Asia. Ma è chiaro ch’esso doveva idealmente far parte, e
organicamente connettervisi, di quella larga serie di provvedimenti,
di cui Antonino Pio fu così liberale verso le provincie. Non vi sarebbe
stata coerenza logica a stabilire per l’Asia delle restrizioni e delle
norme in materia di immunità, che poi non dovessero essere
ripetute, o non fossero già state stabilite per altre provincie
dell’impero, o, almeno, per quelle, che uguale necessità ne
risentivano. Questo è infatti il pensiero del giurista, che ci tramanda
la costituzione antonina
[352]; questa, l’opinione, che deve tenersi
come in generale applicabile.
Qualche dubbio invece lascia la qualità delle persone, su cui l’antico
privilegio e le sue recenti limitazioni andavano a raccogliersi.
Si tratta di insegnanti pubblici, ufficiali, sia di retorica che di
grammatica, o di insegnanti privati?

La prima ipotesi è stata fatta, ed è stata portata a sostegno
dell’assunto, che già, con Antonino Pio, si avesse in Atene
quell’abbastanza regolare assetto degli studii superiori, che
chiaramente troviamo dopo Marco Aurelio;
[353] ma essa è
certamente infondata. Ed invero, noi siamo assolutamente sicuri che,
sotto Antonio Pio, nella migliore ipotesi, non ci fu in Atene che un
solo ufficiale docente di sofistica, Lolliano,
[354], la cui cattedra però,
come a suo a tempo diremo, non dovette essere di istituzione
imperiale, e che uno egualmente ce ne fu sotto Marco Aurelio.
[355]
Or bene, pur volendo rammentare che Antonino Pio, nella sua
costituzione, fissava dei massimi, noi, seguendo l’ipotesi sopra
esposta, verremmo ad ammettere che, nel centro maggiore di studii
dell’Oriente (se ne togli Alessandria), là dove la fioritura dei maestri
di retorica fu sterminata, e la ressa dei candidati notoriamente
grande, il numero dei docenti ufficiali di retorica era inferiore perfino
a quello supposto pei più piccoli centri dell’impero. Per quali casi
avrebbe dunque Antonino Pio fissato le sue cifre iperboliche e
considerato financo la probabilità che codesti massimi fossero
raggiunti,
[356] senza che per questo esaurissero la serie degli
aspiranti al privilegio?
D’altro canto, di cattedre ufficiali di grammatica, in Atene, non
abbiamo — almeno per ora — nessuna menzione; forse di istituite
dagli imperatori non ve ne furono mai.
[357] Eppure, secondo
l’interpretazione, dianzi accennata, della costituzione di Antonino Pio,
al suo tempo, Atene avrebbe dovuto contarne tante quante ne
contava di retorica!
E che dire dei docenti di filosofia, che la costituzione di Antonino Pio
farebbe evidentemente supporre inferiori di numero ai sofisti e ai
grammatici, mentre poi, sotto Marco Aurelio, ne troviamo
probabilmente due per ogni scuola, e cioè otto nella sola Atene?
[358].
L’ipotesi dunque che i docenti, immuni da oneri, siano stati
professori ufficiali riesce, sotto ogni rapporto, insostenibile.

Ma v’è proprio necessità d’identificare i privilegiati della esenzione,
con dei professori ufficiali? Tra le immunità e l’insegnamento ufficiale
non esiste nessun legame diretto, e come, fin da Augusto, noi
abbiamo assistito a una dispensa notevole di immunità, senza che
per questo le persone, che via via avevano a goderne, fossero
menomamente fornite di incarichi ufficiali, così ora possiamo con
sicurezza concludere che, quando Antonino Pio limita il numero dei
docenti beneficiati, egli non si riferisce all’insegnamento ufficiale, ma
all’insegnamento in genere,
[359] e che la limitazione sua è provocata
soltanto dal danno, che l’erario delle singole città risentiva dalla
pletora dei privilegi.
Un altro problema, dinanzi a cui ci pone la su riferita costituzione
imperiale è quello del criterio occorrente per classificare le città
dell’impero in città di primo, di secondo, di terzo grado. Ce ne dà la
soluzione il commento del giureconsulto Modestino, il quale informa
come città di primo grado fossero le μητροπόλεις τῶν εθνῶν, cioè,
sin dal II. secolo, le principali città delle province, onorate
ufficialmente del titolo di metropoli;
[360] di secondo grado, le sedi di
un conventus iuridicus (αὶ ἔχουσαι ὰγορὰς δικῶν); di terzo, tutte le
altre. E questa interpretazione, fornitaci da un antico, è, per molte
ragioni, tra cui questa ch’essa proviene da un’età, in cui le norme di
Antonino Pio erano ancora in vigore la più accettabile sovra ogni
altra.
Ma la limitazione, introdotta dal principe nel numero dei privilegiati,
insinua un concetto giuridico affatto nuovo nei rapporti tra questi e il
governo, che privilegiava. In realtà, non siamo più dinanzi a un
onore conferito ad personam, e neanche dinanzi a un privilegio
conferito ad una classe di persone; siamo dinanzi a un privilegio
conferito a delle comunità, che sole possono esentare da determinati
oneri un certo numero di persone, le quali le ricambiano di
determinati utili, morali o materiali
[361].
Con tutto questo concorda perfettamente un’altra disposizione —
che però non è chiaro se Modestino ce la riferisca come ordinata,
anch’essa, da Antonino Pio, o come una sua propria illazione —

secondo cui il Senato locale, se non poteva accrescere il numero
degli esenti, poteva però, con una sua disposizione interna, fissare
un massimo inferiore a quello stabilito dall’imperatore.
[362] Di guisa
che, per l’ammissione al privilegio, non sarebbe bastata più la
dichiarazione della professione, ma occorreva invece un decreto del
Senato, dichiarante che, date le oggettive condizioni volute dalla
disposizione imperiale — accolta integralmente, o limitata, da un
successivo provvedimento interno — la persona o le persone, che
avevano avanzato domanda di immunità, potevano essere ammesse
a goderne
[363].
Quali criteri si seguissero in caso di eccesso di domande; in base a
quali elementi i rimandati di oggi venissero, alla prima vacanza,
ripresi in considerazione, è assai difficile dire, nell’assenza di ogni
indicazione che ci illumini. I criteri potevano essere parecchi: o
l’ordine delle domande, o l’anzianità, o il merito speciale, o un
criterio misto, che tenesse conto dei varii elementi. Ma, in rapporto a
tutte le nuove norme seguite da Antonino Pio, s’impone un quesito
pregiudiziale. Eran desse delle clausole, per cui si richiedeva
un’applicazione immediata, o delle disposizioni generali, che
dovevano applicarsi gradualmente? In una parola (ed è qui
l’importanza della questione) i diritti acquisiti sarebbero stati
rispettati, anche se venivano, in tutto o in parte, a urtare contro le
nuove disposizioni?
La risposta, a mio avviso, non può essere che positiva.
A parte il principio, costantemente seguito dalla legislazione
imperiale, di non arrecar mai detrimento ai diritti acquisiti,
[364]
troppo grave sarebbe stata la lesione degli interessi individuali e
collettivi, qualora i nuovi criterii si fossero voluti imporre
immediatamente, turbando tutti gli antichi rapporti. Ma, a parte
questo e a parte il valore di precedente, che ogni beneficio
accordato recò per il successore, noi sappiamo che taluni maestri
ebbero adesso ripetute dall’imperatore in persona le antiche
immunità,
[365] e che altri non ismarrirono quel diritto.
[366] Le
disposizioni di Antonino Pio si sarebbero dunque applicate

gradualmente, e sarebbero entrate in pieno vigore solo alla morte di
tutti quelli, che fin allora avevano conservato l’antico privilegio.
XI.
Quale fu l’opera di Antonino Pio riguardo alla statizzazione
dell’insegnamento privato nelle città dell’impero? Eccoci dinanzi a
uno dei più tormentosi problemi del suo governo. La biografia sua,
contenuta nella Historia Augusta, narra che egli «conferì onori
(honores) e stipendi (salaria) ai retori e ai filosofi residenti nelle
provincie».
[367] Non ostante la organica fallacia della fonte, da cui si
è costretti ad attingere,
[368] la notizia, per quella parte che
possiamo controllare su altri elementi, è esatta. Ed invero gli
honores, accordati da Antonino Pio, furono, in massima parte, le
esenzioni dai pubblici carichi, di cui abbiamo precedentemente
discorso, che vennero largite ai retori, ai grammatici e ai medici. Ma
è la notizia ugualmente esatta per la parte che riguarda gli stipendi,
fossero pure limitati, come la nostra fonte li vuole, ai retori e ai
filosofi? Le ragioni del dubbio esistono, sebbene i moderni studiosi
dell’argomento, intenti piuttosto a seguire lo sviluppo della scuola,
che a indagare quanta parte di merito, o di responsabilità, risalga a
questo o a quell’imperatore, abbiamo preferito sorvolarvi.
Ed invero, mentre nessuna fonte discorre di filosofi nominati e
stipendiati da Antonino Pio, dall’elenco dei retori, i quali insegnarono
in Atene, per tutta l’età degli Antonini, che si ricava dalla Biografie
dei sofisti di Filostrato — opera tanto più attendibile della Historia
Augusta — noi apprendiamo che il primo insegnante, il quale,
stipendiato dall’imperatore, abbia salito la cattedra di retorica in
Atene, fu il sofista Teodoto, nominato, non già da Antonino Pio, ma
dal suo successore, Marco Aurelio.
[369]
Tale notizia contraddice categoricamente al passo della Historia
Augusta dianzi citato. Se non che, quasi tale contraddizione non
bastasse, lo stesso Filostrato, altrove, informa che il primo a salire la

cattedra di retorica in Atene fu invece Lolliano di Efeso
[370], il quale
fiorì sotto Antonino Pio — essendo stato scolaro di Iseo, sotto
Traiano,
[371] e maestro di Teodoto — e raggiunse la pienezza della
sua gloria sotto Marco Aurelio
[372].
Per uscire da questa e dalle precedenti difficoltà, si sono tentate
parecchie vie. Non si è certamente potuto supporre che, a proposito
di Lolliano, si parli di una cattedra privata, giacchè, in tal caso, non
lo si sarebbe detto «il primo maestro di retorica in Atene», ma si è
pensato che egli ricoprisse una cattedra ufficiale senza stipendio, e
che Marco Aurelio avesse per primo applicato in Atene delle
disposizioni, che Antonino Pio avrebbe emanate per tutte le
provincie, relative agli stipendi dei retori e dei filosofi
[373].
La prima parte dell’ipotesi è per se stessa risibile: una cattedra
ufficiale senza stipendio è un non senso, e, in ogni modo, essa
contraddice all’introduzione dei salaria, vantata dal biografo di
Antonino Pio. Nè più valida è la seconda. O il provvedimento di
Antonino Pio fu tradotto parzialmente in pratica, e nessuna città
poteva essere da lui presa in considerazione prima di Atene, o non lo
fu, ed allora tanto la dizione della Historia Augusta, quanto il passo
di Filostrato contraddicono all’assunta interpretazione.
Eppure, è assai più difficile pensare che Filostrato, avendo
sott’occhio fonti abbastanza prossime agli avvenimenti illustrati,
abbia errato e si sia grossolanamente contradetto, anzichè
ammettere che noi ci sbagliamo nell’interpretare la sua compendiosa
esposizione, tanto più facilmente intelligibile ai suoi contemporanei.
E, se Filostrato non ha errato, la soluzione, o mi inganno, non può
essere che quella sola, la quale parmi risulti anche dal confronto dei
suoi due passi in discorso: il sofista Teodoto fu il primo ad ascendere
una cattedra ufficiale, istituita e stipendiata dall’imperatore, dietro
nomina imperiale; Lolliano, invece, fu il primo a salire una cattedra,
anch’essa ufficiale, ma non di fondazione imperiale, bensì di
fondazione comunale
[374].

Così noi siamo in grado di conciliare i due passi di Filostrato fra loro
e con quello della Historia Augusta, interpretando da un lato che fu
solo Marco Aurelio il primo a istituire delle cattedre sovvenute dallo
Stato, e sulle quali più direttamente si esercitò l’ingerenza del
principe; dall’altro, che Antonino Pio impose a talune città il dovere,
o concesse la facoltà, di istituire un certo numero di cattedre e di
stipendiare all’uopo dei retori e dei filosofi, come ci dicono e la sua
biografia e la biografia di Lolliano in Filostrato.
Cotale imposizione di cattedre, in qualche municipio, era certamente
nelle normali attribuzioni dell’imperatore, ma spettava egualmente a
lui concedere ai municipii di istituirne delle altre. Come troveremo
più tardi chiaramente formulato per legge,
[375] i comuni non erano
autorizzati a spese, che non fossero consentite dal governo centrale.
Siffatta impacciante tutela era per essi cominciata fin dal regno di
Traiano, e il suo sistema si affinò ancor più sotto Antonino Pio.
Quando per ciò gli storici lodano questo imperatore di avere, nei
rispetti della pubblica istruzione, praticato, per le provincie, gli stessi
criteri che per Roma e di avere conferito stipendi ai retori ed ai
filosofi colà residenti, essi fanno uno dei migliori elogi
dell’amministrazione provinciale di Antonino Pio, che per la prima
volta avrebbe iscritto, come spese obbligatorie, nei bilanci comunali,
quelle relative al mantenimento delle scuole.
Ma la nostra interpretazione ci conduce a risolvere un altro
problema, che il succinto e fugace accenno della Historia Augusta
poneva: i salaria, istituiti fin da Antonino Pio, furono prelevati sul
fisco imperiale — come un tempo, sotto Vespasiano, lo stipendio ai
retori di Roma — o sul bilancio delle singole città?
Le due opinioni sono state ugualmente sostenute.
[376] Ma ciascuna
di esse risponde soltanto a una parte della verità. I salaria furono,
attraverso la loro non breve istoria, prelevati ora sul fisco imperiale,
ora sull’erario delle singole città. Ma, nell’età di Antonino Pio, non ci
troviamo ancora di fronte a delle istituzioni imperiali, onde, a
sopportare il peso di quegli stipendii, dovettero essere appunto gli
erarii comunali. Tutt’al più, specie dato il grande interessamento del

principe per il benessere delle provincie e per la cultura dell’impero,
egli potè, con le risorse del fisco, sovvenire talora i bilanci, esigui o
stremati, dei singoli municipii.
XII.
Ciò che Vespasiano aveva appena iniziato, ciò, a cui taluno ha
creduto che Adriano e Antonino Pio avessero dato mano, in Roma e
nelle provincie, o in qualcuno dei centri più notevoli dell’impero, ha
la sua piena attuazione con Marco Aurelio.
Di lui narrano i suoi biografi com’egli ripetesse sovente il detto di
Platone che le città sarebbero state fiorenti solo quando avessero
regnato i filosofi, o quando i principi fossero stati filosofi
[377]. Come
tutte le anime profondamente intellettuali, egli nudrì infatti una
grande fiducia, e una più grande illusione, nella potenza della
ragione, nell’opera educativa della scienza, nell’efficacia pratica del
magistero dell’insegnamento. Questa sua fede è anzi tutto palese dal
culto, ch’egli ebbe per coloro, che l’avevano educato ed istruito. Egli
amò di un amore infinito il suo maestro Frontone, spirito mediocre,
moralmente e intellettualmente, e a lui, come segno tangibile di quel
ricordo, consacrò una statua nei locali del Senato. Elevò Procolo alle
supreme cariche del governo, e onorò di ricordi marmorei Giunio
Rustico, altro suo intimo, spirituale confidente. Di tutti Marco Aurelio
custodiva le immagini fra quelle dei suoi Penati, e a loro, quando essi
non furono più, offeriva voti e sacrifici.
[378] Ma il più durevole
monumento, in loro onore, è consegnato nelle pagine dei suoi
Pensieri, ove egli scolpì nell’oro della prosa, moralmente più bella di
tutta l’antichità classica, le virtù e gl’insegnamenti, di cui essi gli
erano stati esempio e maestri
[379].
Di un principe, che così fortemente sentiva la virtù
dell’insegnamento, dovevano attendersi grandi rinnovamenti nel
campo della pubblica istruzione. Nè l’aspettativa dei contemporanei
rimase delusa.

Sino a Marco Aurelio, dall’età gloriosa di Atene, l’insegnamento
superiore era quivi rimasto cosa privata, in mano di privati scolarchi,
nel cui magistero lo Stato entrava solo per offrire il luogo di
convegno necessario alle lezioni. Ma nel 176, narra lo storico Dione
Cassio, Marco Aurelio, venuto in Atene, dopo essersi iniziato nei
Misteri Eleusinii, vi istituì cattedre ufficiali, con docenti pubblici per
ogni disciplina, retribuiti di regolare stipendio annuo
[380]. La data è
forse inesatta. Nel 176, Marco Aurelio aveva certamente istituito, già
da tempo, una cattedra di retorica, ed egli, venuto in Atene, aveva
potuto intrattenersi in dotte dispute col retore, che allora l’occupava,
e che non era il primo. La cronologia va dunque spostata a qualche
anno innanzi
[381]. Ma non è neanche esattissimo il riferimento di
cattedre istituite per ogni disciplina (ἐπὶ πάσης λόγων παιδείας), di
cui è fonte lo stesso Dione.
Noi sappiamo in verità di cattedre imperiali di retorica e di filosofia,
inaugurate in Atene da Marco Aurelio e continuate dai successori. Ma
nè di lui nè degli altri ci rimane menzione alcuna di cattedre di
grammatica, di medicina, di musica etc., quali noi aspetteremo dalla
dizione dello storico romano. Sebbene non sia sempre prudente
concludere da un argomento ex silentio, è tale, nel caso presente, la
copia delle circostanze favorevoli, e la natura delle altre fonti
sussidiarie, che noi possiamo essere sicuri che quelle due soltanto
furono le discipline, per cui Marco Aurelio ebbe ad istituire in Atene
delle cattedre imperiali.
La cattedra di retorica, istituita dall’imperatore, fu una sola, e primo
titolare, da lui direttamente nominato, fu il sofista Teodoto. Ma ebbe
questi l’incarico di insegnare tutta la materia, che vi si atteneva, o
non piuttosto una parte di essa, la materia pertinente all’oratoria
civile e giudiziaria, a quello, che si diceva il λόγος πολιτικὸς e
δικανικὸς?
[382]
Questa seconda opinione, accolta dai più, è, secondo il mio modo di
vedere, l’effetto di un equivoco nell’interpretazione di Filostrato.
Filostrato, invero, dice che l’imperatore «propose ai giovani Teodoto
per la sua celebrità, dichiarandolo atleta τῶν πολιτικῶν λόγων», ma

lo dice anche «decoro dell’arte retorica»
[383], e soggiunge che
Teodoto visse altri cinquanta anni, tenne la cattedra per due, e,
quanto all’arte del dire, riuscì pari così nel genere giudiziale (τοῖς
δικανικοῖς) come nel più alto genere sofistico (καὶ τοῖς
ὐπερσοφιστεύουσιν). Or bene, da questo — o io m’inganno —
consegue chiaramente che la cattedra, il θρόνος, occupato da
Teodoto, non fu soltanto un θρόνος λόγων πολιτικῶν, ma un θρόνος
σοφιστικὸς nel più largo senso della parola.
Ma la cattedra di retorica non fu la sola, nè la più importante tra
quelle istituite dal secondo degli Antonini. La vera, la grande
innovazione riguarda invece l’insegnamento della filosofia. Marco
Aurelio istituì parecchie cattedre di questa disciplina; quante con
precisione non è noto; ma la cifra più ragionevole è ancora quella di
otto,
[384] due per ciascuno dei quattro principali indirizzi filosofici del
tempo, il peripatetico, il platonico l’epicureo, lo stoico. Ed invero,
poichè, per queste scuole soltanto, noi sappiamo che furono
nominati dei docenti ufficiali,
[385] poichè sappiamo che di
peripatetici ve ne furono precisamente due,
[386] non è possibile
pensare, come si è fatto, che Marco Aurelio avesse reso ai restanti
indirizzi filosofici (tra cui era anche lo stoico, quello al quale egli
stesso aveva consacrato la sua vita) meno onore che al peripatetico.
Se anzi una diversa illazione fosse da ricavare, essa sarebbe questa:
che le cattedre imperiali di filosofia, in Atene, potevano magari, per
qualche scuola, essere superiori a due, e, nella loro cifra totale,
superiori ad otto.
Era ben difficile che il regno di Marco Aurelio, quel suo governo, che
fu definito di filosofi, avesse una più tangibile espressione della sua
intima essenza. L’Università ateniese, così come egli ebbe a
concepirla, fu quasi interamente una facoltà filosofica. Secondo il suo
pensiero, i giovani dovevano essere anzitutto largamente istruiti nelle
discipline filosofiche; solo in via secondaria, nelle discipline
puramente letterarie; lo scopo professionale, poi, non doveva
trovarvi, come non vi trovava, quartiere.

Gli stipendi assegnati dall’imperatore furono, per la cattedra di
retorica, 10.000 dramme,
[387] e 10.000 dramme ancora per ciascuna
delle varie cattedre di filosofia
[388]. Indubbiamente, queste somme
venivano prelevate dal fisco imperiale, e di ciò, non solo ci avverte la
natura particolare dell’istituto, che è tutta una personale volontaria
creazione dell’imperatore, ma lo dichiarano eziandio le fonti da noi
conosciute, e in una maniera così esplicita da non dar luogo a
discussioni o a diversità d’interpretazione
[389].
XIII.
La prima nomina dei docenti di retorica e di filosofia in Atene era
stata fatta dall’imperatore, o direttamente o per mezzo di persona di
sua fiducia, che, in quel caso speciale, fu il celebre sofista Erode
Attico, a cui appunto era stata delegata la scelta dei primi maestri
ufficiali di filosofia
[390]. Ma subito dopo erano state redatte delle
norme definite, il primo regolamento per le prime ammissioni
nell’insegnamento superiore, la cui importanza è, fra l’altro,
notevole, per essere rimasto, nei secoli di poi, la pietra angolare di
tutti i giudizii del genere, e perchè i suoi criterii fondamentali restano
saldi ed immutati ancor oggi.
Di tutto questo ci informa un brillante dialogo di Luciano; ma nè
questo, nè altro ci specifica quale sia stato l’atto imperiale, che
quelle norme aveva fissate ed imposte. Era stato un editto, un
rescritto, una circolare (mandatum)? Di ciò non possediamo, pur
troppo, nessuna particolare indicazione, e sappiamo solo che,
vivente ancora Marco Aurelio, in seguito alla morte di uno dei due
filosofi peripatetici, erano già state iniziate le operazioni per la
nomina del successore, ed era stato bandito quello che precisamente
si dice oggi un concorso.
La commissione giudicatrice — informa Luciano — era composta
«dei migliori fra i personaggi più anziani e più sapienti di Atene».

[391] Si trattava dunque di tutti «i migliori» (nel senso classico della
parola)? O, in caso diverso, quali ne erano le limitazioni, e chi aveva
regolato, e regolava, la cernita?
È legittimo presumere che la lista degli ἄριστοι, i cittadini, cioè, in
quel tempo, in Atene, eleggibili alle pubbliche cariche, non
coincidesse perfettamente con l’elenco dei membri della
commissione giudicatrice, alla quale spettava il giudizio in merito al
valore dei concorrenti. Una cernita tra gli ἅριστοι ateniesi era
probabilissima, e la condizione dell’età e della capacità dei giudicanti
(πρεσβύτατοι καὶ σοφώτατοι) è proprio — o io mi inganno — nel
passo di Luciano, il criterio limitativo del numero degli ottimati. Ma,
se questo imponeva una riduzione, mi sembra ancor più probabile
che il loro numero venisse d’altra parte accresciuto con quello di tutti
i competenti, che risiedevano da tempo nella città (σοφώτατοι τῶν
ὲν τῆ πόλει) e ch’erano ormai considerati come degni e capaci di
portare i loro lumi nel giudizio
[392].
La Commissione giudicatrice sarebbe stata dunque formata dei
cittadini più anziani dell’aristocrazia del censo e dell’intelligenza
ateniese e avrebbe compreso anche i pubblici e privati professori
della città. Vi era, fra quelli e questi, fra i cittadini non docenti e gli
altri, una diversità o un diverso grado di funzioni, diremo così,
giudicatrici?
Un acuto storico delle scuole filosofiche ateniesi, lo Zumpt,
[393] ha
pensato che i secondi non avessero che un voto meramente
consultivo perchè, in caso contrario, — egli ragiona — ci troveremmo
dinnanzi all’assurdo di filosofi, giudicanti candidati di scuole contrarie
alla loro.
Tale obbiezione è, in verità, infondata, prima di tutto perchè a scuole
contrarie potevano appartenere anche i σοφώτατοι non docenti; in
secondo, perchè tale appartenenza non mutava il valore del giudizio,
in quanto — come vedremo a momenti — nel concorso, non si
trattava di valutare il merito delle dottrine di una scuola in confronto
di quelle d’un’altra, ma solo il merito di ciascuno dei concorrenti di
una stessa scuola. Ma ciò che decide in modo assoluto è il testo

medesimo di Luciano. Per l’umorista greco, i δικαστα
ψηφοφοροῦντες sono tutti insieme οί ἅριστοι καὶ πρεσβύτατοι καὶ
σοφώτατοι
[394], e i diritti dell’intero corpo giudicante non vengono
menomamente graduati in due ordini diversi.
Ma chi fissava, volta per volta, il numero e le persone? A chi spettava
il diritto della scelta? Chi presiedeva la commissione giudicatrice?
Neanche di tutto questo siamo direttamente informati. Ma, se la
scelta delle persone doveva dipendere da uno di questi tre enti, o il
governatore della provincia o l’Areopago o il Senato, dal primo, come
rappresentante l’imperatore, dagli altri, come delegati dal primo, in
grazia di una tradizione, che ne faceva i due corpi cittadini, supremi
sorveglianti della educazione e della istruzione pubblica ateniese,
[395] la presidenza della commissione giudicatrice di un concorso,
per ogni cattedra imperiale, non poteva spettare che al governatore
della provincia.
Passando ora dai giudici ai giudicandi, notiamo subito che la schiera
di questi soggiaceva ad assai minori limitazioni dei primi. Anzi non ne
conosceva che una sola: l’omogeneità delle dottrine con il filosofo
estinto da surrogare. Non limiti di età, non limiti di condizioni sociali,
neanche forse di sesso,
[396] e neanche, per ora, requisiti morali e
fisici imprescindibili.
[397] Tutto questo poteva essere un elemento
negativo o positivo, che entrava a pesare, favorevolmente e
sfavorevolmente, nel giudizio dei commissarii, non mai condizione
assoluta d’incapacità, d’indegnità, d’inammissibilità. E di tanta
liberalità è anche prova il comico caso, che dà materia al dialogo di
Luciano, la fonte precipua di queste nostre informazioni.
La prova pubblica del concorso consisteva in una discussione tra i
candidati, interrotta probabilmente da interrogazioni ed osservazioni
dei commissarii, nella quale ciascuno dimostrava la propria perizia
nelle dottrine di quella scuola, per cui si ricercava il titolare.
[398]
Finita la prova, la Commissione discuteva, e alla discussione seguiva
il voto. Non doveva essere necessaria la unanimità, ma, qualora i
giudici si fossero trovati dinanzi a casi e a condizioni impreviste,
qualora i pareri fossero stati molto varii e divisi, o, insieme con i due

fondamentali dell’approvazione e della disapprovazione, altri minori
se ne fossero tenacemente manifestati, il giudizio veniva sospeso e
rimesso in definitiva all’imperatore.
[399]
La esposizione del processo, che abbiamo tentato, è, nonostante le
inevitabili lacune, abbastanza completa. Solo ci rimane qualche lieve
dubbio. Anche in caso normale di giudizio compiuto e di proposte
concrete della Commissione, era riserbato all’imperatore un ulteriore
giudizio e piena libertà di scegliere e di deliberare, anche in senso
contrario alle designazioni della Commissione giudicatrice? Aveva,
oltre l’imperatore, anche la città dei diritti sulla nomina del titolare a
qualche determinata cattedra, fondata dal governo centrale? Le
norme, che finora abbiamo esposte, erano limitate ai filosofi, o si
adattavano, anche in quest’età, ai sofisti? E quali variazioni subivano
in tal caso? A queste domande, per quanto la tradizione taccia, noi
possiamo fornire risposte abbastanza sicure e definitive.
Il giudizio ultimo dell’imperatore è da ammettersi assolutamente. In
realtà, la Commissione non ha poteri, se non in quanto essa ne è,
volta per volta, investita. L’imperatore potrebbe anche farne a meno
(i successori di Marco Aurelio, anche i più costituzionali, faranno
talora così), e nulla impone il convincimento che Marco Aurelio,
appena agli inizii della pratica dei concorsi, dovesse rinunziare a
cotale sua prerogativa. Viceversa, per queste cattedre di fondazione
imperiale, noi ignoriamo assolutamente, e potremmo anzi escluderla,
l’esistenza di diritti speciali della città.
D’altra parte, le clausole fissate da Marco Aurelio, fermo restando
ogni privilegio dell’imperatore, devono potersi applicare anche ai
sofisti. Astrazion facendo dalla analogia con l’età immediatamente
successiva
[400], ce lo suggerisce la verisimiglianza intrinseca della
cosa. Perchè un concorso per i filosofi e non anche per i sofisti?
Come avrebbe altrimenti l’imperatore potuto giudicare e scegliere,
ove le domande fossero venute anche da concorrenti stranieri, di
pari grido e valore, o magari da ateniesi a lui ignoti? Per i sofisti
però, stante la diversa natura dell’insegnamento, non doveva
trattarsi di una discussione fra i candidati, ma di una o più prove

oratorie su temi determinati da svolgere, estemporaneamente o in
seguito a preparazione, esperimento questo, per cui gli ἄριστοι
πρεσβύτατοι σοφώτατοι ateniesi erano allora, a dir vero, più
competenti che non a giudicare di dibattiti filosofici
[401].
XIV.
Tutto questo, e cioè l’istituzione di cattedre imperiali, la
regolarizzazione delle nomine dei docenti, fu fatto solo in Atene, o fu
da Marco Aurelio ripetuto in altre città, già fiorenti e gloriose per
studii, tanto quanto la capitale della Grecia? Ad onta della
verisimiglianza di questa seconda ipotesi, a noi non è rimasta la
menoma menzione di un tal fatto. Ciò che di certo sappiamo si è
che, parallelamente alla gloria della scuola ateniese, s’accresce in
questo tempo il prestigio e l’importanza dell’Athenaeum romano.
Esso è ormai il luogo, dove impartiscono regolarmente lezioni i
docenti di Roma e, con uguale frequenza, docenti venuti, talora
chiamati, dall’estero, specie dalla Grecia, i quali ultimi non si può
perciò dubitare che godessero ormai di uno stipendio fisso da parte
dell’imperatore.
Dobbiamo quindi supporre, anche nell’Athenaeum, una costellazione
di cattedre ufficiali. Quante per adesso, e con quali stipendii,
l’ignoriamo. Certo, quelle cattedre, almeno per la retorica, sono
considerate come superiori alle corrispondenti ateniesi, e, dei migliori
insegnanti, che di là, o d’altrove, sono chiamati a coprirle, si dice
appunto che si recano a occupare una cattedra «superiore» (ὁ ἄνω
θρόνος). Non sappiamo però se anche per Roma occorresse alle
varie nomine un concorso, o se queste della capitale dell’impero
dipendessero, per ora almeno, direttamente dall’imperatore.
Nell’assoluta mancanza di dati, ogni soluzione sicura è impossibile.
Forse però, non soltanto il luogo di residenza dell’istituto, che si
trovava sotto la diretta sorveglianza del principe e dei suoi ministri,
ma anche il fatto che quelle cattedre venivano occupate da

insegnanti già sperimentati in concorsi, e, per lo più, già provetti
nell’insegnamento ufficiale, rende maggiormente probabile l’ipotesi
di una diretta e immediata nomina dell’imperatore.
Grande dunque è stata la via percorsa fin da Vespasiano, e dallo
stesso Adriano, a Marco Aurelio. Da uno o più stipendi largiti in
Roma a determinate persone, i due principali centri di cultura
dell’impero possono ora vantare cattedre d’istituzione imperiale o
municipale, insegnanti di retorica, di filosofia, di giurisprudenza,
forse di grammatica. Abbiamo, in Atene e in Roma, tutta una serie
ufficiale di cattedre, anzi, in Atene, una vera e propria facoltà
filosofica, e nell’una, se non nell’altra città, un apposito istituto per il
libero insegnamento, superiore o medio-superiore. Possiamo con
questo dire di trovarci dinnanzi al fatto compiuto di una statizzazione
dell’istruzione pubblica? Nulla di più errato di tale affermazione.
Dall’insegnamento ufficiale sfuggono interamente e l’insegnamento
medio inferiore e il primario. Lo stesso insegnamento superiore e il
medio-superiore contano un numero esiguo di cattedre ufficiali,
rispetto all’abbondanza degl’insegnanti e delle cattedre private
[402].
Mentre oggi, nel nostro paese, le Università libere e le così dette
Università popolari rappresentano l’eccezione, queste, nell’età di
Marco Aurelio, sono ancora la regola. Solo l’imperatore, scegliendo
dalla grande folla, ha assegnato dei docenti di più scrupolosa
elezione e godenti la sua fiducia, a una serie di cattedre, le quali
recavano seco la stabilità, che proveniva dalla loro natura e dalla loro
origine.
Ma, a rigore di termini, non si può neanche, per ora, parlare di
Università, e neanche, forse, di vere Facoltà universitarie. Cotali
nostri istituti presuppongono necessariamente un piano didattico e
amministrativo, che presieda al loro funzionamento, un
insegnamento integrale ed organico, un vincolo collegiale. Nulla di
tutto questo troviamo, almeno per adesso, in Atene od in Roma. Ci
sono cattedre, ci sono insegnanti; manca la scuola; o, se scuola c’è,
la determina la tradizionale, non l’ordinamento imperiale. Nessun
rapporto lega fra loro i maestri, nessun obbligo gli scolari. La scuola

pubblica, in quanto organicamente costituita, non esiste, e la sua
impronta ufficiale si farà attendere ancora per oltre un secolo.
XV.
Questo per l’insegnamento superiore e medio superiore. Meno liete
rimanevano ancora le condizioni dell’insegnamento primario. Ma, se
l’impero non vi imprime ora, come non vi imprimerà mai, alcun
suggello ufficiale, se anzi avrà quasi cura di tenerlo lontano da ogni
contatto di ufficialità, gli Antonini proseguono a favorirlo
indirettamente, calcando le tracce dei due immediati predecessori in
quella parte della loro amministrazione, che riguardò le fondazioni
alimentari.
Sotto Adriano, Antonino Pio e Marco Aurelio, quest’istituto riceve un
assai notevole incremento.
[403] Si fondano speciali corporazioni di
fanciulli beneficati,
[404] se ne avvantaggiano numerosi municipii
italici, se ne regola con maggiore studio il funzionamento e si creano
all’uopo speciali magistrati
[405].
Troviamo così fondazioni alimentari in Liguria, in Lombardia, nel
Veneto, nel Piceno, nell’Umbria, nel Lazio, nei Bruzii, in Lucania, in
Apulia, nel Sannio, in Campania e altrove. Adriano assegna l’ufficio di
praefectus alimentorum ai curatores viarum Italiae, dando così a
vedere che di pueri alimentarii ve n’era per tutte le regioni della
penisola. Marco Aurelio nomina dei praefecti alimentorum di rango
consolare e dei procuratores ad alimenta, risedenti in Roma, creando
così un’amministrazione centrale per quel ramo
[406], mentre, sin dal
suo regno, altri procuratores appaiono come funzionari subordinati e
coadiutori dei prefetti distrettuali
[407]. L’esempio, che veniva così
copioso e così efficace dall’alto, è ora più che mai fecondo di
benefiche conseguenze. Di quest’età noi abbiamo tracce di vistose
fondazioni private in Grecia
[408] in Spagna,
[409] in Africa
[410]. E il
buon volere riceve un grande impulso dalle nuove garanzie e dalle

nuove disposizioni, relative all’amministrazione dei municipii, che
tendono altresì a salvaguardarne gli interessi e ad assicurare loro i
beneficii dei doni e dei lasciti per istituzioni alimentari fatti da ricchi
cittadini.
[411]
Ma quanto grande sia la importanza e il peso di cotali norme
legislative, nei rispetti dell’istruzione primaria, lo prova ancor più il
fatto che i lasciti dei ricchi privati, non soltanto andavano a favorirne
la diffusione, indirettamente, per mezzo delle istituzioni alimentari,
ma più volte vi concorrevano direttamente col mantenimento di
scuole municipali primarie e secondarie. Talora essi sono indirizzati,
come è detto, a vantaggio della istruzione dei fanciulli (eruditione
puerorum)
[412]. Ed anche questi lasciti, con siffatta speciale
destinazione, ricevono fin d’ora, e solo da questo momento, il
beneficio della sicurezza e della tutela dello Stato.
XVI.
In questo periodo, in cui così forti sono gli scambi spirituali col
mondo greco, in cui noi vediamo, in assai maggior misura che nei
secoli trascorsi, trapiantati in Roma metodi e istituti di istruzione
ellenica, in questa, che è l’età di Adriano e di Marco Aurelio, noi non
possiamo non aspettarci — quello che realmente si ebbe — un più
vigoroso incremento dell’istruzione musicale. Il II. secolo di C. è
veramente l’età più gloriosa della musica romana. Le compagnie
liriche e drammatiche — i così detti sinodi dionisiaci — raggiungono
ora il culmine della gloria e della considerazione universale. Le
epigrafi esibiscono, in questa età la maggior copia di agoni, di
giuochi e di premii. I concorsi Pitici ed Olimpici divengono universali;
ogni città di mediocre importanza ha i suoi; ne sorgono di nuovi, si
fregiano dei nomi degli imperatori o dei loro favoriti: Traiani, Adriani,
Antinoi. La mania universale invade anche i privati, che dispensano
alle città grandi somme per giuochi in proprio onore.
[413] Si dispiega
alla luce della storia tutta una ricca, inaudita fioritura di studii

musicali, e questi sono gli anni, che tramandano la maggiore, e la
miglior parte dei trattati teorici di musica dell’evo antico
[414].
Ma dal giorno, in cui gli autori lirici, o drammatici, avevano cessato di
essere anche autori della musica, che accompagnava le loro opere,
lo sviluppo di quest’arte, ormai indipendente da ogni altra, era stato
rapidissimo.
[415] Era quindi divenuto urgente e difficile il problema di
un’istruzione musicale, che valesse a creare dei virtuosi, che
avrebbero poi dato prova di sè, avanti al gran pubblico, ed in ampie
rappresentazioni.
A risolverlo, avevano, fin dall’età alessandrina, cercato di provvedere
i su riferiti sinodi dionisiaci, divenendo ogni giorno più scuole
pratiche, sia pure ametodiche, di musica e di recitazione
[416]. Uno
dei più famosi fu allora quello numerosissimo di Teo, che, ai primi
dell’età imperiale romana, trasporterà la sua sede in Lebedo
[417]. E
non senza rapporti fra loro debbono essere state la presenza del
sinodo in quel paese e l’accurata istruzione musicale, che troviamo
impartita ai fanciulli ed agli efebi del luogo. Noi conosciamo ciò che
oggi si direbbe il programma di questa educazione. Si insegnava ai
fanciulli e ai giovani a suonare gli istrumenti musicali, salvo (strana
eccezione!) gli istrumenti ad aria; si insegnava il canto, la
composizione musicale e l’arte della recitazione. E, insieme con
questo, si impartivano loro nozioni di coltura generale, di letteratura,
di pittura etc.
[418].
Questo di Teo non restò l’unico sodalizio del genere
[419]. Or bene,
gl’imperatori cosidetti senatorii, che furono grandi fautori e
suscitatori di celebri compagnie drammatiche,
[420] erano
implicitamente, e necessariamente, portati a essere promotori, e
protettori, delle scuole professionali di musica, che in quelli si
venivano, o si erano venute, nel progresso dei tempi, formando.
Ma il culto della persona degli Augusti, che in questo periodo si
diffonde per tutto l’impero e che così largamente è provocato
dall’azione individuale degli imperatori, suscita al tempo stesso una
vasta fioritura di speciali collegi di artisti lirici, che, più naturalmente

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