Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Friedrich Lottspeich (Auth.)

Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Friedrich Lottspeich (Auth.)
Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Friedrich Lottspeich (Auth.)
Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Friedrich Lottspeich (Auth.)

1. Visit ebookfinal.com to download the full version and
explore more ebooks or textbooks
Proteomics Methods and Protocols 1st Edition
Friedrich Lottspeich (Auth.)
_____ Click the link below to download _____
https://ebookfinal.com/download/proteomics-methods-and-
protocols-1st-edition-friedrich-lottspeich-auth/
Explore and download more ebooks or textbook at ebookfinal.com

2. Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Membrane Proteomics Methods and Protocols 1st Edition
Henry Bigelow
https://ebookfinal.com/download/membrane-proteomics-methods-and-
protocols-1st-edition-henry-bigelow/
Clinical Proteomics Methods and Protocols 2nd Edition
Antonia Vlahou
https://ebookfinal.com/download/clinical-proteomics-methods-and-
protocols-2nd-edition-antonia-vlahou/
Renal and Urinary Proteomics Methods and Protocols 1st
Edition Visith Thongboonkerd
https://ebookfinal.com/download/renal-and-urinary-proteomics-methods-
and-protocols-1st-edition-visith-thongboonkerd/
Cancer Genomics and Proteomics Methods and Protocols 1st
Edition Narendra Wajapeyee (Eds.)
https://ebookfinal.com/download/cancer-genomics-and-proteomics-
methods-and-protocols-1st-edition-narendra-wajapeyee-eds/

3. Plant Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Valérie
Méchin
https://ebookfinal.com/download/plant-proteomics-methods-and-
protocols-1st-edition-valerie-mechin/
Quantitative Methods in Proteomics 1st Edition Katharina
Podwojski
https://ebookfinal.com/download/quantitative-methods-in-
proteomics-1st-edition-katharina-podwojski/
Vagabond Vol 29 29 Inoue
https://ebookfinal.com/download/vagabond-vol-29-29-inoue/
Dengue Methods and Protocols 1st Edition Radhakrishnan
Padmanabhan
https://ebookfinal.com/download/dengue-methods-and-protocols-1st-
edition-radhakrishnan-padmanabhan/
Immunoproteomics Methods and Protocols 1st Edition Scott
Mccomb
https://ebookfinal.com/download/immunoproteomics-methods-and-
protocols-1st-edition-scott-mccomb/

5. Proteomics Methods and Protocols 1st Edition Friedrich
Lottspeich (Auth.) Digital Instant Download
Author(s): Friedrich Lottspeich (auth.), Jörg Reinders, Albert Sickmann
(eds.)
ISBN(s): 9781607611561, 1607611562
Edition: 1
File Details: PDF, 5.52 MB
Year: 2009
Language: english

7. For other titles published in this series, go to
www.springer.com/series/7651
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
™
Series Editor
John M. Walker
School of Life Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK

8. Proteomics
Methods and Protocols
Edited by
Jörg Reinders* and Albert Sickmann
†
*University of Regensburg, Institute of Functional Genomics, Joseph-Engert Strasse 9 93053
Regensburg, Germany
†
Institut fϋr Spektrochemie und Angewandte Spektroskopie (ISAS), Bunsen-Kirchoff Str. 11 44139
Dortmund, Germany

9. ISSN: 1064-3745 e-ISSN: 1940-6029
ISBN: 978-1-60761-156-1 e-ISBN: 978-1-60761-157-8
DOI: 10.1007/978-1-60761-157-8
Springer Dordrecht Heidelberg London New York
Library of Congress Control Number: 2009927501
© Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC 2009
All rights reserved. This work may not be translated or copied in whole or in part without the written permission of
the publisher (Humana Press, c/o Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013,
USA), except for brief excerpts in connection with reviews or scholarly analysis. Use in connection with any form of
information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology
now known or hereafter developed is for-bidden.
The use in this publication of trade names, trademarks, service marks, and similar terms, even if they are not identified
as such, is not to be taken as an expression of opinion as to whether or not they are subject to proprietary rights.
Printed on acid-free paper
Springer is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Editors
Jörg Reinders
University of Regensburg
Institute of Functional
Genomics
Joseph-Engert-Strasse 9
93053 Regensburg
Germany
Albert Sickmann
Institut für Spektrochemie und
Angewandte Spektroskopie
(ISAS)
Bunsen-Kirchoff Str. 11
44139 Dortmund
Germany

10. v
Preface
Proteins are essential players in all cellular processes, facilitating various functions as
enzymes and structure-forming or signal-transducing molecules. Their enormous versa-
tility in primary structure, folding, and modification enables a complex, highly dynamic,
but nevertheless robust, network carrying out all the necessary tasks to ensure proper
function of each cell and concerted activity of cellular associations up to complex organ-
isms. Therefore, proteins have always been, and presumably will always be, the target of
all kinds of studies in biological sciences.
Protein purification and separation methods have a longstanding record as they were
a prerequisite for enzymological studies and chemical protein identification methods such
as Edman-sequencing. Thus, various elaborate and mostly time-consuming techniques for
the isolation of distinct proteins have been developed often based on chromatography or
electrophoresis, and the identification of the protein’s primary structure was accomplished
afterwards by no less intricate methods. However, the relatively recent development of
MALDI- and ESI-ionization techniques for mass spectrometric analysis of large and frag-
ile biomolecules enabled protein identification in an automated fashion, thereby speeding
up protein identification by a multiple. This turned out to be a major breakthrough in
protein analysis enabling high-throughput protein identification on a global scale, leading
to approaches to study the entirety of all proteins of a cell, tissue, organ, etc.
In 1995, the term “Proteome” was introduced by Marc Wilkins and Keith Wil-
liams as the entirety of all proteins encoded in a single genome expressed under distinct
conditions representing the turning point in the journey from studying genes to studying
proteins, from “Genomics” to “Proteomics.” Since then, great efforts have been under-
taken to characterize a “healthy” or a “diseased” proteome, but it soon turned out that a
proteome is far too complex and dynamic to be defined by such simple terms. The enor-
mous progress that has been accomplished both technically and biologically has not only
granted deeper insight into the cellular network but has also raised further questions and
set further challenges to proteomic research.
The enormous range of protein abundance, dynamics, and interactions as well as the
spatio-temporal distribution of a proteome gave rise to the evolution of several new fields
like phospho-, glyco-, subcellular, and membrane proteomics, etc. Many techniques have
been developed or significantly increased in these fields and will contribute to the under-
standing of the cellular networks in the future.
Leading scientists have contributed to this volume, which is intended to give an over-
view of the contemporary challenges and possibilities in the various areas of proteomics
and to offer some detailed protocols as examples for successful analysis in proteomics
studies. Therefore, we hope that this book can raise your interest in proteomics and be a
valuable reference book for your laboratory work.
v

11. vii
Contents
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
PART I INTRODUCTION
1. Introduction to Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Friedrich Lottspeich
PART II ELECTROPHORETIC SEPARATIONS
2. High-Resolution Two-Dimensional Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Walter Weiss and Angelika Görg
3. Non-classical 2-D Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Jacqueline Burré, Ilka Wittig, and Hermann Schägger
4. Protein Detection and Quantitation Technologies
for Gel-Based Proteome Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Walter Weiss, Florian Weiland, and Angelika Görg
PART III MASS SPECTROMETRY AND TANDEM MASS
S
PECTROMETRY APPLICATIONS
5. MALDI MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Rainer Cramer
6. Capillary Electrophoresis Coupled to Mass Spectrometry
for Proteomic Profiling of Human Urine and Biomarker Discovery . . . . . . . . . . . 105
Petra Zürbig, Eric Schiffer, and Harald Mischak
7. A Newcomer’s Guide to Nano-Liquid-Chromatography of Peptides . . . . . . . . . . 123
Thomas Fröhlich and Georg J. Arnold
8. Multidimensional Protein Identification Technology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Katharina Lohrig and Dirk Wolters
9. Characterization of Platelet Proteins Using Peptide Centric Proteomics . . . . . . . . 155
Oliver Simon, Stefanie Wortelkamp, and Albert Sickmann
10. Identification of the Molecular Composition of the 20S Proteasome of
Mouse Intestine by High-Resolution Mass Spectrometric Proteome Analysis . . . . 173
Reinhold Weber, Regina Preywisch, Nikolay Youhnovski,
Marcus Groettrup, and Michael Przybylski
PART IV QUANTITATIVE PROTEOMICS
11. Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-Based Quantitative Proteomics. . . . 189
Michael W. Linscheid, Robert Ahrends , Stefan Pieper, and Andreas Kühn

12. 12. iTRAQ-Labeling of In-Gel Digested Proteins for Relative Quantification . . . . . . 207
Carla Schmidt and Henning Urlaub
13. Electrospray Mass Spectrometry for Quantitative Plasma Proteome Analysis . . . . 227
Hong Wang and Sam Hanash
PART V INTERPRETATION OF MASS SPECTROMETRY DATA
14. Algorithms and Databases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
Lennart Martens and Rolf Apweiler
15. Shotgun Protein Identification and Quantification by Mass Spectrometry . . . . . . 261
Bingwen Lu, Tao Xu, Sung Kyu Park, and John R. Yates III
PART VI ANALYSIS OF PROTEIN MODIFICATIONS
16. Proteomics Identification of Oxidatively Modified Proteins in Brain . . . . . . . . . . 291
Rukhsana Sultana, Marzia Perluigi, and D. Allan Butterfield
17. Isotope-Labeling and Affinity Enrichment of Phosphopeptides
for Proteomic Analysis Using Liquid Chromatography–Tandem
Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
Uma Kota, Ko-yi Chien, and Michael B. Goshe
PART VII SUBCELLULAR PROTEOMICS
18. Organelle Proteomics: Reduction of Sample Complexity
by Enzymatic In-Gel Selection of Native Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325
Veronika Reisinger and Lutz A. Eichacker
19. Isolation of Plasma Membranes from the Nervous System
by Countercurrent Distribution in Aqueous Polymer Two-Phase Systems . . . . . . 335
Jens Schindler and Hans Gerd Nothwang
20. Enrichment and Preparation of Plasma Membrane Proteins from
Arabidopsis thaliana for Global Proteomic Analysis
Using Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . 341
Srijeet K. Mitra, Steven D. Clouse, and Michael B. Goshe
PART VIII ANALYSIS OF PROTEIN INTERACTIONS
21. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes
from Mammalian Cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP Tag . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
Christian Johannes Gloeckner, Karsten Boldt, Annette Schumacher,
and Marius Ueffing
22. Sequential Peptide Affinity Purification System for the Systematic Isolation
and Identification of Protein Complexes from Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . 373
Mohan Babu, Gareth Butland, Oxana Pogoutse, Joyce Li,
Jack F. Greenblatt, and Andrew Emili
23. Bioinformatical Approaches to Detect and Analyze Protein Interactions. . . . . . . . 401
Beate Krüger and Thomas Dandekar
Index. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433
viii Contents

13. Contributors
ROBERT AHRENDS Department of Chemistry, Humboldt-Universität zu Berlin,
Brook-Taylor Str. 2, 12489 Berlin, Germany
R
OLF APWEILER EMBL Outstation – Hinxton, European Bioinformatics Institute,
Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK
G
EORG J. ARNOLD Laboratory for Functional Genome Analysis LAFUGA, Gene
Center, Ludwig-Maximilians-University Munich, Feodor-Lynen-Str. 25, 81377
Munich, Germany
M
OHAN BABU Banting and Best Department of Medical Research, University of
Toronto, Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, 160 College
Street, Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1
K
ARSTEN BOLDT Department of Protein Science, Helmholtz Zentrum München,
Ingolstaedter Landstr. 1, 85764 Neuherberg, Germany; Institute of Human
Genetics, Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich, Munich,
Germany; Helmholtz Zentrum München – German Research Center for
Environmental Health, Department of Protein Science, Ingolstaedter Landstr.
1, 85764 Neuherberg, Germany
J
ACQUELINE BURRÉ Department of Neuroscience, The University of Texas
Southwestern Medical Center, 6000 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX,
75390-911, USA
G
ARETH BUTLAND Banting and Best Department of Medical Research, University
of Toronto, Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, 160 College
Street, Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1; Life Science Division, Lawrence
Berkeley National Lab, 1 Cyclotron Road MS 84R0171, Berkeley, CA 94720
D. A
LLAN BUTTERFIELD Department of Chemistry, Center of Membrane Sciences,
and Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY
40506-0055, USA
K
O-YI CHIEN Department of Molecular and Structural Biochemistry,
North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7622, USA
S
TEVEN D. CLOUSE Department of Horticultural Science, North Carolina State
University, Raleigh, NC 27695-7609, USA
R
AINER CRAMER The BioCentre and Department of Chemistry, The University of
Reading, Whiteknights, Reading, RG6 6AS, UK
T
HOMAS DANDEKAR Bioinformatik, Biozentrum, Am Hubland, 97074 Universitaet
Wuerzburg, Germany
L
UTZ A. EICHACKER Universitetet i Stavanger, Centre for Organelle Research,
Kristine-Bonnevisvei 22, 4036 Stavanger, Norway
ix

14. ANDREW EMILI Banting and Best Department of Medical Research, University of
Toronto, Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, 160 College
Street, Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1
T
HOMAS FRÖHLICH Laboratory for Functional Genome Analysis LAFUGA,
Gene Center, Ludwig-Maximilians-University Munich, Feodor-Lynen-Str. 25,
81377 Munich, Germany
C
HRISTIAN JOHANNES GLOECKNER Department of Protein Science,
Helmholtz Zentrum München – German Research Center for Environmental
Health, Ingolstaedter Landstrasse 1, 85764 Neuherberg, Germany
A
NGELIKA GÖRG Technische Universität München (TUM), Life Science
Center Weihenstephan (WZW), Area: Proteomics, Am Forum 2,
85350 Freising-Weihenstephan, Germany
M
ICHAEL B. GOSHE Department of Molecular and Structural Biochemistry,
North Carolina State University, 128 Polk Hall, Campus Box 7622, Raleigh NC
27695-7622, USA
J
ACK F. GREENBLATT Banting and Best Department of Medical Research, University
of Toronto, Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, 160 College
Street, Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1; Department of Medical Genetics and
Microbiology, University of Toronto, 1 King’s College Circle, Toronto, Ontario,
Canada M5S 1A8
M
ARCUS GROETTRUP Division of Immunology, Department of Biology, University of
Konstanz, D-78457 Konstanz, Germany
S
AM HANASH Fred Hutchinson Cancer Research Center, 1100 Fairview Avenue N.,
M5-C800, P.O. Box 19024, Seattle, WA 98109, USA
U
MA KOTA Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina
State University, Raleigh, NC 27695-7622, USA
B
EATE KRÜGER Bioinformatik, Biozentrum, Am Hubland, 97074 Universitaet
Wuerzburg, Germany
A
NDREAS KÜHN Department of Chemistry, Humboldt-Universität zu Berlin,
Brook-Taylor Str. 2, 12489 Berlin, Germany
J
OYCE LI Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto,
Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, 160 College Street,
Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1
M
ICHAEL W. LINSCHEID Department of Chemistry, Humboldt-Universität zu
Berlin, Brook-Taylor Str. 2, 12489 Berlin, Germany
K
ATHARINA LOHRIG Department of Analytical Chemistry, Ruhr-University Bochum,
Universitaetsstr. 150, 44780 Bochum, Germany
F
RIEDRICH LOTTSPEICH Protein Analytics, Max-Planck-Institute of Biochemistry,
Martinsried, Germany
B
INGWEN LU Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute,
La Jolla, CA, USA
L
ENNART MARTENS EMBL Outstation – Hinxton, European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK
x Contributors

15. Contributors xi
HARALD MISCHAK Mosaiques diagnostics GmbH, Mellendorfer Str. 7-9,
30625 Hannover, Germany
S
RIJEET K. MITRA Department of Horticultural Science, North Carolina
State University, Raleigh, NC 27695-7609, USA
H
ANS GERD NOTHWANG Abteilung Neurogenetik, Institut für Biologie und
Umweltwissenschaften, Carl von Ossietzky Universität, 21111 Oldenburg, Germany
R
OBIN PARK Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute,
La Jolla, CA, USA
M
ARZIA PERLUIGI Department of Biochemical Sciences, University of Rome
“La Sapienza”, 00185, Rome, Italy
S
TEFAN PIEPER Department of Chemistry, Humboldt-Universität zu Berlin,
Brook-Taylor Str. 2, 12489 Berlin, Germany
O
XANA POGOUTSE Banting and Best Department of Medical Research, University
of Toronto, Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, 160 College
Street, Toronto, Ontario, Canada M5S 3E1
R
EGINA PREYWISCH Division of Immunology, Department of Biology,
University of Konstanz, Konstanz, Germany
M
ICHAEL PRZYBYLSKI Department of Chemistry, Laboratory of Analytical
Chemistry and Biopolymer Structure Analysis, University of Konstanz,
78457 Konstanz, Germany
V
ERONIKA REISINGER Universitetet i Stavanger, Centre for Organelle Research,
Kristine-Bonnevisvei 22, 4036 Stavanger, Norway
H
ERMANN SCHÄGGER Molekulare Bioenergetik, Zentrum der Biologischen Chemie,
Fachbereich Medizin, Universität Frankfurt, Theodor-Stern-Kai 7, Haus 26,
D-60590 Frankfurt am Main, Germany
E
RIC SCHIFFER Mosaiques diagnostics GmbH, Mellendorfer Str. 7-9, 30625 Hannover,
Germany
J
ENS SCHINDLER Abteilung Neurogenetik, Institut für Biologie und
Umweltwissenschaften, Carl von Ossietzky Universität, 21111 Oldenburg, Germany
C
ARLA SCHMIDT Bioanalytical Mass Spectrometry Group, Max Planck Institute for
Biophysical Chemistry, Am Fassberg 11, 37077 Göttingen, Germany
A
NNETTE SCHUMACHER Department of Protein Science, Helmholtz Zentrum
München, Ingolstaedter Landstr. 1, 85764 Neuherberg, Germany
A
LBERT SICKMANN Institut für Spektrochemie und Angewandte Spektroskopie
(ISAS), Bunsen-Kirchoff Str. 11 44139 Dortmund, Germany
O
LIVER SIMON Rudolf-Virchow-Center, DFG-Research Center for Experimental
Biomedicine, Wuerzburg, Germany
R
UKHSANA SULTANA Department of Chemistry, Sanders-Brown Center on Aging,
University of Kentucky, Lexington, KY, USA
M
ARIUS UEFFING Department of Protein Science, Helmholtz Zentrum München,
Ingolstaedter Landstr. 1, 85764 Neuherberg, Germany; Institute of Human
Genetics, Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich,
Munich, Germany

16. HENNING URLAUB Bioanalytical Mass Spectrometry Group, Max Planck
Institute for Biophysical Chemistry, Am Fassberg 11, 37077 Göttingen, Germany
H
ONG WANG Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA 98109, USA
R
EINHOLD WEBER Laboratory of Analytical Chemistry and Biopolymer Structure
Analysis, Department of Chemistry, University of Konstanz, Konstanz, Germany
F
LORIAN WEILAND Fachgebiet Proteomik, Technische Universität München,
Freising-Weihenstephan, Germany
W
ALTER WEISS Technische Universität München, Fachgebiet Proteomik, Am Forum
2, D-85350 Freising-Weihenstephan, Germany
I
LKA WITTIG Molekulare Bioenergetik, Zentrum der Biologischen Chemie, Centre of
Excellence “Macromolecular Complexes”, Fachbereich Medizin, Johann Wolfgang
Goethe-Universität Frankfurt, Theodor-Stern-Kai 7, D-60590 Frankfurt am Main,
Germany
D
IRK WOLTERS Department of Analytical Chemistry, Ruhr-University Bochum,
Universitaetsstr. 150, 44780 Bochum, Germany
S
TEFANIE WORTELKAMP Institut für Spektrochemie und Angewandte Spektroskopie
(ISAS), Bunsen-Kirchoff Str. 11 44139 Dortmund, Germany
T
AO XU Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute,
La Jolla, CA, USA
J
OHN R. YATES III Department of Chemical Physiology, The Scripps Research
Institute, SR11, 10550 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037, USA
N
IKOLAY YOUHNOVSKI Laboratory of Analytical Chemistry and Biopolymer Structure
Analysis, Department of Chemistry, University of Konstanz, Konstanz, Germany;
Algorithme Pharma Inc., Montreal, Montreal H7V 4B4, Canada
P
ETRA ZÜRBIG Mosaiques diagnostics GmbH, Mellendorfer-Str. 7-9, 30625 Hannover,
Germany
xii Contributors

17. Chapter 1
Introduction to Proteomics
Friedrich Lottspeich
Summary
In this chapter, the evolvement of proteomics from classical protein chemistry is depicted. The challenges
of complexity and dynamics led to several new approaches and to the firm belief that a valuable proteomics
technique has to be quantitative. Protein-based vs. peptide-based techniques, gel-based vs. non-gel-based
proteomics, targeted vs. general proteomics, isotopic labeling vs. label-free techniques, and the importance
of informatics are summarized and compared. A short outlook into the near future is given at the end
of the chapter.
Key words: History , Quantitative proteomics , Targeted proteomics , Isotopic labeling , Protein-based
proteomics , Peptide-based proteomics

In the end of the last century, a change of paradigm from the
pure function driven biosciences to systematic and holistic
approaches has taken place. Following the successful genomics
projects, classical protein chemistry has evolved into a high
throughput and systematic science, called proteomics. Starting
in 1995, the first attempts to deliver a “protein complement
of the genome” used the established high-resolving separation
techniques like two-dimensional (2D) gel electrophoresis and
almost exclusively identified the proteins by the increasingly
powerful mass spectrometry. Soon, fundamental and technical
challenges were recognized. Unlike the genome, the proteome is
dynamic, responding to any change in genetic and environmental
parameters. Furthermore, the proteome appears to be orders of
magnitude more complex than a genome owing to splicing and
1. The History
and the Challenge
Jörg Reinders and Albert Sickmann (eds.), Proteomics, Methods in Molecular Biology, Vol. 564
DOI: 10.1007/978-1-60761-157-8_1, © Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009
3

18. 4 Lottspeich
editing processes at the RNA level and owing to all the post-
translational events on the protein level, like limited processing,
post-translational modifications, and degradation. The situation
is even more difficult, since many important proteins are only
present in a few copies/cells and have to be identified and
quantified in the presence of a large excess of many other proteins.
The dynamic range of the abundant and the minor proteins often
exceeds the capabilities of all analytical methods.
So far, only few solutions are available to handle the com-
plexity and dynamic range. One is to reduce the complexity of
the proteome and to separate the low abundant proteins from
the more abundant ones. This, for example, can be achieved
by multidimensional separation steps. But, unpredictable losses
of proteins and a large number of resulting fractions make this
approach time-consuming and thus also very costly. Alternatively,
the proteome to be investigated can be simplified by starting with
a specific biological compartment or by reducing the complexity
using a suitable sample preparation (e.g. enzyme ligand chips,
functionalized surface chips, class-specific antibodies). Successful
examples are the analysis of functional complexes or most inter-
action proteomics approaches. In another approach, a selective
detection is performed, which visualizes only a certain number
of proteins that exhibit specific common properties. This can be
achieved by antibodies, selective staining protocols, protein lig-
ands, or selective mass spectrometry techniques like MRM (mul-
tiple reaction monitoring) or SRM (single reaction monitoring)
( 1 ) . The most straightforward application of this approach is
“targeted proteomics,” which monitors a small set of well-known
proteins/peptides.
However, in the later years of the past century, the main
focus of proteomics projects was to decipher the constituents of
a proteome. It was realized only slowly that for solving biological
problems and realizing the potential of holistic approaches, the
changes and the dynamics of changes on the protein level have to
be monitored quantitatively.

Since 1975 by their introduction in by O’Farrel ( 2 ) and Klose
( 3 ) , 2D gels have fascinated many scientists owing to their sep-
aration power. The combination of a concentrating technique,
i.e. isoelectric focusing, with a separation according to molecular
mass, i.e. SDS gel electrophoresis, provides a space for resolving
more than 10,000 different compounds. Consequently, 2D gels
were the method of choice when dealing with very complex protein
2. Gel-Based
Proteomics

19. Introduction to Proteomics 5
mixtures like proteomes. Unfortunately, gel-based proteomics
had inherent limitations in reproducibility and dynamic range.
Standard operating procedures had to be carefully followed to
get almost reproducible results even within one lab. Results pro-
duced from identical samples in different labs were hardly com-
parable on a quantitative level. A significant improvement was the
introduction of the DIGE technique (GE Healthcare), a multi-
plexed fluorescent Cy-Dye staining of different proteome states,
which eliminated to a large extent the technical irreproducibility
(4) . With the cysteine-modifying “DIGE saturation labeling,”
impressive proteome visualization can be achieved with only a
few micrograms of starting material ( 5 ) . A disadvantage is that
only two different fluorescent reagents are commercially available
for “complete DIGE” and the costs of the reagents are rather
prohibitive for larger proteomics projects. Additionally, limita-
tions in load capacity, quantitative reproducibility, difficulties in
handling, and interfacing problems to mass spectrometry limited
the analysis depth and comprehensiveness of the gel-based pro-
teomics studies.

How to overcome the limitations of gels and at the same time
keep the advantages of a concentrating separation mode like
iso-electric focusing? Several instruments were developed that
are able to separate proteins in solution but nevertheless use a
focusing technique. Probably, the most recognized realizations
of these concepts are free-flow electrophoresis instruments like
“Octopus” (Becton Dickinson) and the “Off-Gel” system (Agi-
lent). Undoubtedly, when these rather new systems are compared
with 2D gels, distinct advantages in recovery and improvements
in the amount that can be applied have been realized, but inter-
facing to a further separation dimension is hampered by rather
large volumes and buffer constituents. Thus, the resolution of
2D gels had not been reached so far. In the near future, technical
and applicative improvements are to be expected to partly over-
come some of the limitations.
In the limited landscape of separation methods, chromatography
seemed to have the potential as an alternative tool for in-depth
proteome analysis. However, from classical protein chemistry, it
was well known that proteins did not give quantitative recovery
in many chromatographic modes. So far, only one non-gel mul-
tidimensional approach based on chromatographic methods was
commercially realized. In the “ProteomeLab
TM
PF-2D” system
3. Seeking
Alternatives
3.1. Non-Gel-Based
Electrophoresis
3.2. Chromatography

20. 6 Lottspeich
(Beckman), a chromatofocusing column coupled with a reversed
phase chromatography fractionates the sample into more than
1,000 fractions. However, here also the advantage to keep the
proteins in solution is compromised with the fact that the resolu-
tion of the fully chromatographic solution is considerably lower
than that with 2D gels.
Thus, since obviously quantitative multidimensional separations
of proteins proved to be notoriously difficult, other alternatives
were searched for. One conceptual new idea was to transfer the
separation and quantification problem from the protein to the
peptide level. If this could be achieved, a new dimension of speed,
automation, and reproducibility can be obtained. Thus, new
peptide-based strategies, e.g. MudPIT ( 6 ) , were developed where
after cleaving the proteome into peptides, highly automated mul-
tidimensional liquid chromatography separations were followed
by identification of the peptides using tandem mass spectro-
metry. Mainly owing to this switch to peptide-based proteomics,
chromatography experienced a new boom, and miniaturiztion
of peptide separation columns to diameters below 100 µm and
introduction of instruments that were capable to deliver nano-
liter flow rates became available. Nano-LC with online or off-line
mass spectrometric detection became routine. However, in mul-
tidimensional mode, nano-LC is still on the border of technical
practicability and it still suffers from lack of robustness and ease
of handling.
With the application of the peptide-based proteomics strate-
gies, several severe disadvantages became obvious. By cleaving the
proteins into peptides, not only the complexity of the proteome
was increased by tenfold, but important information concerning
the protein identification was also destroyed. Many peptides are
identically found in functionally completely different proteins.
Thus, from a peptide, the progenitor usually cannot be deduced
unequivocally. Furthermore, different isoforms, post-translationally
modified proteins, or processing and degradation products of a
protein, all produce a large set of identical peptides. As a result,
the quantitative information for a certain protein becomes quite
uncertain. Amounts of a peptide that are present in more than
one protein species do not reflect the quantity of a single protein
species, but rather the quantity of the sum of all protein species
that contain this peptide.
Due to the complexity and the necessity to analyze and iden-
tify each peptide by tandem mass spectrometry, proteome analysis
time and costs increased markedly. Strictly speaking, today even
the most rapid mass spectrometers are not able to analyze in detail
all the masses present in one LC run. Therefore, often especially
minor peptides are not analyzed. This so-called “undersampling”
is certainly one of the reasons for the usually bad reproducibility
3.3. Peptide-Based
Proteomics

21. Introduction to Proteomics 7
of proteome studies, where often a simple repetition of the analy-
sis gives only 20%–30% of overlapping data.
As a consequence of all these aspects, reduction of complexity
in quantitative proteomics should be done at protein level.
The behavior of a protein during a separation is a characteristic
parameter and should also be used for detailed identification and
discrimination of single protein species.

To improve the quantitative proteomics results, “isotope labe-
ling” techniques were introduced. These “isotopic dilution”
strategies were already well known for the analysis of small mole-
cules, drugs, and metabolites. The pioneering work to introduce
this technique into the proteomics field was done by the Aeber-
sold group, where the cysteine residues in all proteins of two pro-
teomic states were modified with a biotin-containing either heavy
or light version of a reagent (isotope coding affinity tag, ICAT
®
)
( 7 ) . Then, the labeled proteomes were combined and cleaved
into peptides. Only the cysteine-containing peptides carrying
the label are isolated by affinity purification using streptavidin.
Peptide separation and mass analysis revealed the identity of the
peptides and at the same time determined by the signal intensity
of the isotopic peptide pair the quantitative ratio of the peptides
in the original proteomes. Improved versions of isotopic reagents
were developed, e.g. isotope coding protein label, ICPL
®
(Serva),
small amino group reactive reagents, which gave better reaction
yields and increased sequence coverage ( 8 ) .
Of course, an introduction of the isotopic label as early as
possible is desirable, since all the steps performed without the
isotopic control may contribute to quantitatively wrong results.
Therefore, introducing the isotopic label at an even earlier stage
of a proteome analysis was developed. Culture media enriched
with N
15
isotopes or stable isotope labeling of amino acids in
cell culture (SILAC) was used in proteomics experiments, espe-
cially in cell culture or with microorganisms ( 9 ) . However, with
a remarkable effort, a “SILAC mouse” was also generated and
used in proteomics experiments ( 10 ) . The metabolic labeling
approaches are usually restricted to cell culture experiments and
are not applicable to samples from higher organisms (e.g. body
fluids, tissues, etc.)
Also, for peptide-based approaches, a number of isotopic rea-
gents were proposed. The most popular is iTRAQ (ABI), a family
of eight isobaric amino group reactive reagents ( 11 ) . Because of
the identical mass of all variants of the reagent, a certain peptide
4. Quantitative
Proteomics Using
Stable Isotopic
Labeling

22. 8 Lottspeich
derived from different proteome states will appear with the identical
mass and thus - in contrast to non-isobaric isotopic reagents –
the labeling does not increase the complexity in the mass spec-
trum. However, with a simple, cheap, and rapid MS analysis, no
quantitative data can be obtained. Only during MS/MS analysis,
specific reporter ions for the different reagents will be liberated
and can be quantified. To produce quantitative correct results,
the mass selected for MS/MS analysis has to be rather pure. This
often is not the case in crowded chromatograms. Consequently,
the advantages of high multiplexing with isobaric reagents are
somewhat diminished by the limitation to rather low complex
peptide mixtures and by the task to analyze each derivatized pep-
tide by MS/MS analysis to disclose quantitative results.

One of the major difficulties in larger proteomics projects is
the enormous amount of data that will be produced. Tens of
thousands of mass spectra from each proteomic state can be
analyzed only by using automated software solutions. Because
of demanding peak detection in overcrowded spectra and
challenging peptide/protein identification and the mere amount
of data to be processed today, data analysis and data evaluation
is by far the most time-consuming part of a proteome analysis.
Software for automatically detecting the interesting proteins that
change from one proteome state to another and filtering such
proteins out of the complex proteome data can be expected in
the near future.

However, So far many proteomics experiments published did not
really deliver solid and valuable scientific content. This partly is
connected with the idea of holistic approaches per se, that the
observation of the reactions of a perturbed system does not neces-
sarily provide a simple and clear answer, but rather is a hypothesis
generating concept. Unfortunately, the technical ability to cope
with proteome complexity is still very limited despite the amaz-
ing technical progresses in mass spectrometry and nanosepara-
tions. Consequently, it is often tried to analyze a proteome with
significant effort, time, and money, though with today’s analyt-
ics, most of the existing proteins are out of reach. Only a fraction
of the proteome can be explored and to judge the significance
5. Informatics and
Data Mining
6. State of the Art
and Future

23. Introduction to Proteomics 9
and validity of the results, biological and statistical repetitions of
the experiments are scientifically required. However, because of
the large effort and high costs, this is often ignored. The danger
is that in the long run, by ignoring good scientific praxis, the reli-
ability of proteomics as an analytical technique may be queried.
Therefore, we are forced to elaborate intelligent and sophisti-
cated strategies to obtain valid and valuable biological information
with the existing technologies in sample preparation, separation
sciences, mass spectrometry, and informatics. Closest to this goal
is probably “targeted proteomics.” Already today, this approach
is able to monitor hundreds of known proteins quantitatively and
sensitively and it will gain increasing acceptance and eventually
enter routine clinical diagnostics.
With general comparative proteomics in attempting the
holistic concept, the situation is more complicated with general
comparative proteomics. Neither analysis depth nor quantitative
accuracy is satisfactory today. Post-translational modifications
and analysis of many different protein species originating from
the same gene present major difficulties in high throughput
approaches and require innovative strategies. Isotopic labeling
techniques are in competition with label-free techniques. Although
label-free approaches have demonstrated amazingly good results
with simple protein mixtures, they have to substantiate this at
the proteomics level and after multidimensional separation steps
also. Most of the problems and shortcomings are recognized and
many scientists are working on their solutions. After one dec-
ade of rapid improvements in analysis techniques and only slight
improvement in the separation field, the acute pressure is now
on the further development in separation sciences. Integrated,
well–designed, and highly automated workflows using both
chromatography and electrophoresis will be necessary to solve
the ambitious proteomics separation problem. Novel separation
strategies and interfacing solutions of highly automated multidi-
mensional fractionation schemes are a challenging research area
and will, to a large extent, determine the success of proteomics as
a holistic approach in the future.
References
1. Anderson L. , Hunter C.L. (2006) Quantitative
mass spectrometric multiple reaction monitor-
ing assays for major plasma proteins . Mol. Cell.
Proteomics 5 , 573 – 588 .
2. O’Farrell P.H. (1975) High resolution two-
dimensional electrophoresis of proteins . J. Biol.
Chem. 250 , 4007 – 4021 .
3. Klose J. (1975) Protein mapping by combined
isoelectric focusing and electrophoresis of
mouse tissues A novel approach to testing for
induced point mutations in mammals . Human-
genetik 26 , 231 – 243 .
4. Unlue M. , Morgan M.E. , Minden J.S. (1997)
Difference gel electrophoresis: A single gel
method for detecting changes in protein
extracts . Electrophoresis 18 , 2071 – 2077 .
5. Sitek B. , Luettges J. , Marcus
K. , Kloeppel G. ,
Schmiegel W. , Meyer H.E. , Hahn S.A. , Stuehler K.
(2005) Application of fluorescence difference
gel electrophoresis saturation labelling for the
analysis of microdissected precursor lesions of
pancreatic ductal adenocarcinoma . Proteomics
5 (10) , 2665 – 2679 .
6. Washburn M.P. , Wolters D. , Yates J.R.
3rd (2001) Large-scale analysis of the yeast

24. 10 Lottspeich
proteome by multidimensional protein identifi-
cation technology . Nat.Biotechnol. Mar ; 19 (3) ,
242 – 277 .
7. Gygi S.P. , Rist B. , Gerber S.A. , Turecek F. ,
Gelb H.M. , Aebersold R. (1999) Quantita-
tive analysis of complex protein mixtures using
isotope-coded affinity tags . Nat.Biotechnol . 17 ,
994 – 999 .
8. Schmidt A. , Kellermann J. , Lottspeich F. (2005)
A novel strategy for quantitative proteomics
using isotope-coded protein labels . Proteomics
5 , 4 – 15 .
9. Ong S.E. , Blagoev B. , Kratchmarova
I. , Kris-
tensen D.B. , Steen H. , Pandey A. , Mann M.
(2002) Stable isotope labeling by amino acids
in cell culture, SILAC, as a simple and accurate
approach to expression proteomics . Mol. Cell.
Proteomics 1 , 376 – 386 .
10. Krueger M. , Moser M. , Ussar S. , Thievessen
I. , Luber C. , Forner F. , Schmidt S. , Zaniva S. ,
Fässler R. , Mann M. (2008) SILAC-mouse
for quantitative proteome analysis uncovers
Kindlin-3 as an essential factor for red blood
cell function . Cell. Jul 25; 134(2), 353–364 .
11. Ross P.L. ,
Huang Y.N. , Marchese J.N. , Wil-
liamson B. , Parker K. , Hattan S. , Khainovski
N. , Pillai S. , Dey S. , Daniels S. , Purkayastha S. ,
Juhasz P. , Martin S. , Bartlet-Jones M. , He F. ,
Jacobson A. , Pappin D.J. (2004) Multiplexed
protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae
using amine-reactive isobaric tagging reagents .
Mol. Cell. Proteomics 3 , 1154 – 1169 .

25. Chapter 2
High-Resolution Two-Dimensional Electrophoresis
Walter Weiss and   Angelika Görg   
Summary
  Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) with immobilized pH gradients (IPGs) combined with 
protein identification by mass spectrometry is currently the workhorse for the majority of ongoing 
proteome projects. Although alternative/complementary technologies, such as MudPIT, ICAT, or 
protein arrays, have emerged recently, there is up to now no technology that matches 2-DE in its ability 
for routine parallel expression profiling of large sets of complex protein mixtures. 2-DE delivers a map 
of intact proteins, which reflects changes in protein expression level, isoforms, or post-translational 
modifications. High-resolution 2-DE can resolve up to 5,000 proteins simultaneously ( ∼ 2,000 proteins 
routinely), and detect and quantify <1 ng of protein per spot. Today’s 2-DE technology with IPGs has 
largely overcome the former limitations of carrier ampholyte-based 2-DE with respect to reproducibility, 
handling, resolution, and separation of very acidic or basic proteins. Current research to further advance 
2-DE technology has focused on improved solubilization/separation of hydrophobic proteins, display 
of low abundance proteins, and reliable protein quantitation by fluorescent dye technologies. Here, 
we provide a comprehensive protocol of the current high-resolution 2-DE technology with IPGs for 
proteome analysis and describe in detail the individual steps of this technique, i.e., sample preparation 
and protein solubilization, isoelectric focusing in IPG strips, IPG strip equilibration, and casting and 
running of multiple SDS gels. Last but not the least, a section on how to circumvent the major pitfalls 
is included.  
Key words: Immobilized pH gradient ,  Proteome ,  Two-dimensional electrophoresis    

  Two-dimensional electrophoresis (2-DE) couples isoelectric 
focusing (IEF) in the first dimension and sodium dodecyl sulfate 
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in the second 
dimension to separate proteins according to two independent 
parameters, i.e., isoelectric point (p I ) in the first dimension and 
1. Introduction
Jörg Reinders and Albert Sickmann (eds.), Proteomics, Methods in Molecular Biology, Vol. 564
DOI: 10.1007/978-1-60761-157-8_2, © Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009
13

26. Discovering Diverse Content Through
Random Scribd Documents

27. DE BLINDE PASSAGIER.
In suizelende vaart, met een snelheid waarvan de lezer zich
nauwelijks eenige voorstellingkan maken, vloog de auto van lord
Lister door de straten van Parijs.
Ontzettend, zooals de tuf voortsnelde!
Als een wervelwind!
En alle opmerkzaamheid was noodig, opdat, bij de heerschende
duisternis in de stratenvan Parijs, geen ongeluk mocht geschieden.
Maar, geen nood!
Er bestond geen chauffeur, die het in handigheid won van Lister.
Onophoudelijk liet hij het signaal hooren.
Alles stoof op zijde en menige vloek werd uitgestooten door koetsiers
en palfreniersen kooplieden; door wandelaars en boodschappers en
handelslieden.
Het werd een wilde jacht.
Want eenige bereden politie-agenten gaven onmiddellijk hun paard
de sporen en zettenden verwoeden automobilist achterna.
Naar het station!
Naar het Lyonsche station!
Dat was de eenige gedachte, die lord Lister in deze oogenblikken
bezig hield.

28. Hij wist immers, dat zijn vrijheid er van af hing.
Zooals hij daar zat, de jonge Engelsche Edelman, met het bleeke
gezicht, waarin alletrekken gespannen waren, maakte hij volkomen
den indruk van een man van ijzer en staal,wiens besluit door niets is
te veranderen, en die tot elken prijs zijn doel wil bereiken.
Gelukkig kende lord Lister Parijs op z’n duimpje.
Trouwens, hij was in alle wereldsteden volkomen thuis; niet alleen in
Londen, waarhij geboren was, maar ook in Parijs, W eenen, Berlijn,
Madrid, Rome en Napels, zelfsin Konstantinopel, in alle groote
steden van de Vereenigde Staten en zelfs in Teheran,de hoofdstad
van Perzië, zou hij midden in den nacht den weg hebben kunnen
vinden.
„Nog een kwartier, dan ben ik aan het station”, fluisterde hij.
Een blik op de auto-klok overtuigde hem ervan, dat het nog kwartier
voor negen was.
Als het hem niet gelukte, den nog af te leggen weg in dertien minuten
door te vliegen,kwam hij te laat voor den sneltrein.
Sissend, puffend vloog de machine vooruit.
Daar was het station!
In het maanlicht doemden torens en daken reeds op.
Toen, eensklaps, krak—krak—
Een schreeuw ontsnapte lord Listers borst. [17]
Donderend vloog de auto op zij. Een gaslantaarn werd in de vaart
meegesleurd en tegelijkertijdweerklonken angstkreten.

29. Lord Lister had zich in zijn val zóó gedraaid, dat hij als een kat op zijn
voetenterecht kwam.
Hij stond oogenblikkelijk weer op en voelde, dat hem niets was
overkomen.
Maar uit de nauwe zijstraat kwamen reeds een half dozijn menschen
aansnellen om tekijken naar de verwoesting, door de auto
aangericht.
Het voertuig was namelijk met volle kracht tegen een boerenwagen
aangebotst, die alsversplinterd ter aarde lag.
Met één sprong stond lord Lister tusschen de ruïnes en lichtte een
man op, die hevigbloedde uit een wonde aan het hoofd en ook een
beenbreuk scheen te hebben opgeloopen.
„Hoe heet je?” vroeg, lord Lister, „gauw, je zult er geen schade bij
lijden!”
„Bastien Cavour, melkhandelaar uit Belleville bij Parijs”, stamelde de
ander—: „o,al mijn mooie spulletjes—pas vier weken getrouwd—en
nu al—”
„Wees stil, je zult er wel bij varen, heb geduld!”
Toen was hij ook al verdwenen.
De stationsklok wees twee minuten voor negen.
Nog twee minuten!
Honderdtwintig seconden!
Lord Lister verdubbelde zijn schreden.

30. Geen mededinger naar den Marathon-prijs had die snelheid kunnen
verbeteren.
En voort stoof hij.
Achter zich hoorde lord Lister de joelende, menigte, die hem na wilde
hollen.
Maar met reuzenschreden duwde hij ieder op zij, slingerde een
spoorwegbeambte, diehem niet door wilde laten, omdat hij geen
plaatsbewijs had, terzijde en kwam op hetperron, toen juist de
conducteurs de zwarte portieren dichtgooiden van den sneltrein,die
om negen uur naar Havre ging vertrekken en die zich juist in
beweging zette.
Gelukkig!
In een seconde was lord Lister op de treeplank en had hij met vasten
greep een coupé-deuromklemd.
Sneller, en sneller begon de locomotief te stoomen en voorzichtig,
uiterst voorzichtigtastte Lister langs de coupé-deuren, totdat hij een
langen waggon had bereikt, waarinzich de slaapcoupé’ s bevonden.
Hij boog zich voorover en keek door een raampje naar binnen.
Inderdaad, hij had zich niet vergist, toen hij vermoedde, dat Adrienne
dienzelfdenavond nog naar Londen zou reizen.
Daar zat zij!
Neen, ze had er geen gras over laten groeien!
Zoodra mogelijk was zij afgereisd naar Londen om het noodlottige
document te halen.

31. Maar zij had buiten den waard gerekend!
Voorzichtig tastte lord Lister verder naar den ingang van den coupé.
Dat was geen gemakkelijke taak, want de trein ging thans voort met
duizelingwekkendevaart, zoodat de groote onbekende ieder
oogenblik dacht, dat hij door den heftigentegenwind van de treeplank
zou worden geslagen.
Maar, hoe grooter het gevaar, hoe grooter ook de zelfbeheersching
van lord Lister.
Nu had hij de deur bereikt, die voerde naar den slaapcoupé. Hij
opende haar en tradgeruischloos binnen.
Hij was gered! [18]
Maar nu was het zaak om in de ruimte, naast die, waarin Adrienne
vertoefde, den nachtte kunnen doorbrengen.
De conducteur van de slaapwagens naderde hem.
„Wat verlangt mijnheer?” vroeg hij, „alle plaatsen in den wagon zijn
bezet.”
„Luister eens”, antwoordde de groote onbekende, „hier zijn duizend
francs. Ik geefje die cadeau, maar ruim mij dan hier een plaatsje in”.
„Maar meneer …”
„Begrijp je dan niet, waarom het mij te doen is? Die mooie, jonge
vrouw!”
„Ha, juist!” De conducteur glimlachte, „die met die oudere dame reist!”

32. „Zóó, is er een oudere dame bij. Nu, dat hindert niet! Als ik vannacht
maar de afdeelingnaast die mooie, jonge vrouw krijg!”
„Neen, dat gaat niet, meneer!”
„Wat zeg je?”
„Daar slaapt een Turk!”
„Breng dien man dan ergens anders onder dak!”
„Onmogelijk!”
„Niets is onmogelijk! Ruim dien Turk uw eigen slaapverblijf in, als het
niet andersgaat!”
„Goed! Ik wil het doen! Maar onder welk voorwendsel?”
„Laat dat maar aan mij over!”
„Hoe dat zoo, meneer?”
„Breng mij bij dien Turk!”
„Maar …”
„Kom, doe het!” En de Groote Onbekende drukte den conducteur het
beloofde bankbiljetin de hand.
Deze opende nu de deur van den coupé.
Een groote, breedgeschouderde Turk, die het zich juist een beetje
gemakkelijk hadgemaakt, lag reeds te bed en snurkte.
„Maak hem wakker”, fluisterde Lister.

33. „Meneer! Wordt eens wakker! Hallo!” De conducteur schudde den
slapende heen en weer.
„Allah is Allah, wat is er?” bromde de snorker met slaperige stem.
„Pardon”, begon Lord Lister in het Turksch, „het spijt mij geweldig, dat
ik u moetlastig vallen.
„Maar daar er in uw coupé nog een tweede bed is—”
„Oho! Ik heb den heelen coupé gehuurd en betaald”, protesteerde de
Turk.
„Volkomen waar, en het is ook volstrekt mijn bedoeling niet geweest
om u lastig tevallen, maar ik ben in Parijs plotseling ziek geworden.
De doktoren constateerden,dat aanvallen van waanzin te wachten
zijn en daarom heeft men mij, feitelijk tegenmijn zin, naar dezen trein
gebracht, opdat ik zoodra mogelijk weer in Engeland, mijn
geboorteland, terug zal zijn!”
Nauwelijks had lord Lister deze woorden gesproken, of de Turk pakte
zijn boeltje bijelkaar en verliet zoo snel mogelijk den slaapcoupé.
Glimlachend volgde hem de conducteur en buiten hoorde lord Lister
den in zijn rustgestoorden man nog vele T urksche vloeken
uitstooten.
Hij beweerde toen, dat hij er niet aan dacht, weer naar zijn coupé
terug te gaan ende conducteur beduidde hem, dat hij wel voor een
geschikt plaatsje zou zorgen.
Een minuut later werd het stil.
Lord Lister schoof nu den grendel voor de deur.

34. Nu was hij alleen. Nu kon hij ongehinderd de taak, die hij zichzelf had
opgelegd,volbrengen. [19]
[Inhoud]

35. VIJFDE HOOFDSTUK.

36. AAN HET WERK.
Voorzichtig ging hij naar den muur, die zijn coupé van Adrienne’s
scheidde.
Hij luisterde en daar de wanden vrij dun waren, kon hij letterlijk ieder
woord verstaan.
„Ga nu wat slapen, mevrouw”, sprak een volmaakt vreemde stem.…
„ik zal wakker blijven!”
„Zijt ge dan niet vermoeid, miss Wilson?”
Dat was Adrienne’s stem, die hij zoo dikwijls had gehoord.
„Moe? Een detective mag nooit moe zijn, en mr. Baxter heeft mij
opgedragen, u te bewakenen te beschermen ten allen tijde.”
„Ha zoo, een vrouwelijke detective”, lachte lord Lister. En Baxter heeft
haar Adriennetoegevoegd, opdat deze steeds een waakzaam
persoon in haar buurt zal hebben.
„Dan zal mr. Baxter ook weer eens leelijk bij den neus worden
genomen.”
„Ik zal in het onderste bed gaan liggen”, hoorde Lister nu Adrienne
weer zeggen. „Gijkunt dan bovenin gaan liggen, want ook als ge niet
slapen gaat, zal toch de rust ugoed doen!”
Toen hoorde hij het ritselen van zijden rokken en—was het
verbeelding—het kwam hemvoor , alsof een zoet parfum zijn
reukorganen streelde.

37. „Hebt ge den sleutel nog, mevrouw?” hoorde hij toen zeggen.
Lister spitste de ooren.
„Natuurlijk. Hij hangt aan een kettinkje op mijn borst.”
Toen werd het een paar minuten stil. en een oogenblik later hoorde
Lister Adriennenog eens met slaperige stem zeggen:
„’t Is hier toch wel verrukkelijk tusschen de koele lakens. Zijt ge nog
wakker, missWilson?”
„Natuurlijk! Mijn revolver ligt naast mij en ik denk niet aan slapen!”
Toen hoorde Lister niets meer dan het ratelen der spoorwegwielen.
„En nu zal ik het mij toch maar eens wat gemakkelijk gaan maken”,
sprak lord Lister,„dat is me een dagje geweest. Eerst van iemand
hooren, dat hij het geheim van mijnleven kent, dan als een dolleman
door de straten van Parijs rennen, iemand bijna doodrijden en ten
slotte een eind op de treeplank van den sneltrein naar Havre
meerijden.”[20]
„Oef!”
Hij trok zij gekleede jas uit, haalde een gouden sigarettenkoker voor
den dag en begonop z’n dooie gemak te rooken.
Hij wist, dat de sterke, prikkelende geur van deze Egyptische
sigaretten zijn zenuwenstaalde en met welbehagen blies hij de
blauwe wolkjes voor zich uit.
Met halfgesloten oogen leunde hij achterover in de fluweelen
kussens, en door zijnlange, krullende wimpers tuurde hij nadenkend

38. voor zich uit.
Zoo verstreek een vol uur.
Toen stond hij op.
„Nu aan ’t werk, Edward”, fluisterde hij tot zichzelf, „gelukkig heb ik
steeds allesbij mij, wat ik noodig kan hebben.”
Hij haalde uit zijn vest een juchtleeren étui te voorschijn.
Daaruit nam hij een klein fleschje, gevuld met een lichtkleurige
vloeistof, een penseel,een stalen boor , een zaag, een breekijzer en
een kleine tang.
Om niet het minste geluid te veroorzaken, trok de Groote Onbekende
zijn lakshoenenuit en liep op de teenen naar den muur , die zijn
coupé van Adrienne’s verblijf scheiddeen luisterde, of alles volkomen
stil was geworden.
Ja, hij kon, nadat hij zijn oor tegen den wand had gedrukt, zelfs het
regelmatig ademenhooren, dat uit het onderste bed kwam.
Nu kon hij aan het werk gaan!
Van zijn horlogeketting nam hij een gouden potlood en teekende een
vierkantje tegenden muur op de plaats, waar de wand het dunst was.
Daarna bestreek hij de plek met de vloeistof uit het fleschje, waarvoor
hij het penseelgebruikte.
Dit experiment herhaalde hij tot vier keeren toe. Toen drukte hij met
de duimen opde plek en al heel spoedig week het hout onder dien
druk, een bewijs dat de tinctuur,waarmee de muur bestreken was,
het hout totaal had opgelost.

39. Nu zette lord Lister er de boor op.
Een regen van fijne houtsnippers daalde neer en voorzichtig blies
Lister het zaagselvan den muur en van zijn kleeren.
Daarna nam hij de zaag op en begon geheel geruischloos te werken.
Nu moest hij probeeren, of zijn werk gelukt was.
De meesterdief haalde een lange speld uit zijn das. Het was een
gouden sieraad, meteen prachtigen diamant bezet.
Den naald stak hij in den drilboor en toen kon hij, zonder eenige
moeite, het sieraadtot een diepte van vijf centimeter in de opening
steken.
Nu stak hij zijn vingers in de opening en met eenige moeite gelukte
het hem, een grootstuk hout los te maken en naar zich toe te halen.
Dit heele werkje had de grootste inspanning gekost en den
meesterdief uiterst opgewondengemaakt.
Zweetdroppels parelden op zijn voorhoofd en zijn handen beefden
zoo geweldig, dathij een oogenblik rust moest nemen.
Het gat in den muur was zoo groot, dat Lister in de andere coupé kon
kijken.
Daar hij echter niet naar boven kon kijken, wist hij nog niet, of miss
Wilson ookwas ingeslapen, of dat ze misschien nog wakker lag.
Hij veronderstelde het laatste en besloot uiterst voorzichtig te werk te
gaan.
Hij kon miss Wilson niet zien, maar hij kon ongehinderd in Adrienne’s
legerstede kijken.

40. Zij had zich ten deele ontkleed en onder de kanten [21]van haar hemd
kon Lister het sleuteltje zien schitteren.
Dat sleuteltje moest hij veroveren, als hij niet verloren wilde gaan.
Een diepe ademtocht ontsnapte zijn borst. Toen greep hij het
tangetje, opende heteenige keeren op onderzoekende wijze en deed
toen een zwart masker voor de oogen.
Nu perste hij zijn lichaam tegen den muur en stak beide handen,
waarin hij het pincethield, door de opening.
Nu kwam het er op aan, voorzichtig te zijn.
Een enkele misgreep en Adrienne zou ontwaken.
Misschien ook waakte de vrouwelijke detective nog.
Langzaam hief Lister zijn hand op, waarin hij de tang hield.
Zachtjes, nauwelijks merkbaar, raakte het tangetje den sleutel.
De trekken van lord Lister spanden zich als die van een roofdier, zijn
oogen fonkelden,maar zijn hand beefde niet.
Een kleine beweging, een enkel drukje—de tang had het gouden
kettinkje doorgeknepen.
In het volgende oogenblik had lord Lister het sleuteltje beetgepakt en
terwijl devrouwelijke detective zich luisterend over den rand van haar
bed boog, roofde lordLister den sleutel. Als een slang gleed zijn arm
terug, terwijl hij zelf, diep ademhalend,met wijd geopende oogen zich
van den wand verwijderde.
Zijn handen hielden den kostbaren sleutel vast, een kleinood, dat
voor hem meer waardwas dan alle schatten der aarde, want het

41. vertegenwoordigde zijn eer, zijn vrijheid,misschien zijn leven.
Maar lord Lister was het niet gewend, zich lang over te geven aan
vreugdevolle overpeinzingen,als hem iets gelukt was.
Met een snelle beweging borg hij het sleuteltje, zette het stuk hout
weer in de opening,stak een nieuwe sigaret op, trok lakschoenen en
gekleede jas weer aan en overtuigdezich door een blik in den
spiegel, dat hij er weer tip-top uitzag.
Maar hij begreep nu ook, dat hij niet in den slaapcoupé kon blijven en
dat hij zichop het station te Londen niet aan Adrienne mocht
vertoonen.
Hij moest zich dus vermommen.
Maar bij zijn plotselinge afreis uit Parijs, had hij zijn koffers in het
hotel gelaten.
Hoe zou hij nu aan andere kleeren komen?
Nog geen vijf minuten had hij over dit laatste vraagstuk nagedacht,
toen hij glimlachendopstond en den coupé verliet.
Nu wist hij, waar en hoe hij zich zou kunnen verkleeden.
Want toen hij langs de treeplank liep, had hij, terwijl hij naar binnen
keek, in eender waggons een persoon zien zitten, die hem in dezen
uit de verlegenheid kon helpen.
Deze man was een Russisch koopman, die een lange kaftan droeg,
en een breedgerandencylinder op het hoofd had.
Aan een station, waar de sneltrein slechts een minuut stopte, werd de
deur van dezencoupé geopend en een jonge man trad binnen.

42. Hij groette hoffelijk en het duurde niet lang of het tweetal was in een
geanimeerdgesprek gewikkeld.
De jongeman sprak vloeiend Russisch en de oude reiziger was
bijzonder in zijn nopjes,dat hij iemand ontmoette, die met hem zoo
prettig kon converseeren. Hij vertelde,dat hij naar Londen reisde,
omdat een koopman, wien hij voor vele duizenden roebelswaren had
gestuurd, op het punt stond failliet te gaan. [22]
„Ik zal zien, wat ik nog kan redden,” zei de koopman uit Moskou, „ik
ben gelukkignog op tijd gewaarschuwd, maar , als ik morgen niet
tijdig in Londen ben, verlies ikmijn geld en dan ben ik er ellendig aan
toe!”
De man sprak op klagenden toon.
„Op mijn eerewoord, beste meneer,” vervolgde de Rus, „ik heb een
vrouw en vier kinderen,het zou toch vreeselijk zijn, als die schurk mij
straatarm maakte.”
De jongeman antwoordde niet.
Hij haalde zijn sigarettenkoker te voorschijn en begon te rooken.
„Rookt ge niet? Kom, neem ook een sigaret,” voegde hij zijn
reisgenoot toe.
Hij had zijn gouden koker al weer gesloten en toen hij den Rus nu het
doosje voorhield,had hij dit bliksemsnel omgedraaid; heel andere
sigaretten kwamen nu te zien.
„Heel graag,” zei de Rus, „uw sigaret ruikt uitstekend.”
Met welbehagen begon de koopman te dampen, terwijl hij lord Lister
van zijn kinderenbegon te vertellen.

43. Maar, plotseling begon de man allerlei wartaal te praten, zijn oogen
knipperden, totdathij ze heelemaal sloot en insliep.
„Wel te rusten, Moskowitsch,” zei lord Lister. „Als je morgen niet op
tijd in Londenaankomt, zul je er toch geen schade van hebben. Lord
Lister vraagt nooit dienstenvoor niemendal!”—
Toen de eerste zonnestralen de zee verlichtten, in wier onmiddellijke
nabijheid hetstationsgebouw lag, stopte de trein en een der eerste
passagiers, die uitstapte, waseen Russisch koopman, die huiverend
zijn kaftan om zich heentrok en wiens hoofd bijnaverdronk in den
veel te grooten cylinderhoed.
Hij was ook een der eersten, die op de wachtende boot stapten en
den matroos in gebrokenEngelsch vroeg:
„Ik ben doodziek, beste vriend! Breng mij gauw naar een kajuit!”
„Ben je al zeeziek geworden, voordat de tocht begint?” lachte de
zeerob.
„Wel, voor geld kun je alles krijgen. Ga maar mee, ik zal je bij den
steward brengen,die zal je wel een hut aanwijzen!”
De Rus liep achter den matroos aan, maar bij de trap bleef hij
verbaasd staan.
Een mooie brunette was aan dek gekomen en achter haar liep een
andere dame—Adrienneen miss Wilson. Zij liepen echter niet
samen, maar ieder op zichzelf kwam aan boord.
Toen zij elkander ontmoetten, maten de beide dames elkander met
woedenden blik.
Lord Lister lachte.

44. „Ik begrijp die boosheid volkomen”, dacht hij. „Adrienne beschuldigt
miss Wilson vanden diefstal en zegt, dat deze den sleutel heeft
gestolen om hem Baxter te kunnenuitleveren!
„Hahaha!”
Toen verdween de Rus van het dek en al heel gauw had hij zich
teruggetrokken in zijnbehagelijk ingerichte hut.
Precies op tijd, om drie uur in den namiddag, liep de boot de
Theemsmonding binnenen bij de eerste halte verliet de Rus het
schip.
Hij liep vlak langs Adrienne heen.
Zij keek glimlachend voor zich heen en geen zweempje van diepe
teleurstelling overden diefstal was op haar gelaat te lezen.
„Wonderlijk”, dacht lord Lister, „ik had gedacht, dat het verlies van het
sleuteltjehaar in de grootste [23]opwinding zou brengen. Enfin, het
sleuteltje is van mij!”
Nauwelijks was lord Lister aan land gestapt, toen hij een rijtuig nam
en naar zijnprachtige woning in Regentstreet reed.
Hij had den koetsier een goede fooi beloofd en deze bracht hem nu in
onmogelijk kortentijd aan het doel en lette er niet op, dat een elegant
gekleed heer in plaats vaneen Russisch koopman, in kaftan gehuld,
uit het rijtuig stapte.
Lord Lister keek op zijn horloge.
Het was tien minuten vóór vieren. Hij kon dus nog wat eten, zich
verfrisschen en kleeden.Vóór vijf uur moest hij aan de Engelsche
Bank zijn.

45. Het was vijf minuten over half vijf, toen Lister de Bank van Engeland
betrad.
Hij ging dadelijk naar het betreffende bureau en zeide:
„Ik zou wel even in mijn safe willen gaan!”
„Hebt ge den sleutel?”
„Hier is hij”, antwoordde lord Lister en hij toonde het sleuteltje, dat hij
in denafgeloopen nacht door list had veroverd.
De beambte bekeek het sleuteltje een minuut lang en zei toen:
„Ge vergist u, mijnheer—dat is geen sleuteltje van een der safes van
de EngelscheBank!”
Lord Lister kromp ineen.
Het kostte hem alle moeite om een schreeuw van woede te
onderdrukken.
Met wijd opengesperde oogen staarde hij naar het sleuteltje, dat hij in
de hand hielden dat alles kon ontsluiten, behalve de safe van
markies de Frontignac! [24]
[Inhoud]

46. ZESDE HOOFDSTUK.

47. Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookfinal.com