QTQTN motif upstream of the furin-cleavage site plays a key role in SARS-CoV-2 infection and pathogenesis.pptx

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1. QTQTN motif upstream of the furin -cleavage site plays a key role in SARS-CoV-2 infection and pathogenesis Dra. Jackelyn Stephanny Páez Velásquez Aspirante al Doctorado de Ciencias Básicas Biomédicas

2. TABLA DE CONTENIDO Revista/ Autores Métodos Conclusiones Resultados Introducción

3. PNAS: Proceedings of the National Academy of Sciences

4. PNAS: Proceedings of the National Academy of Sciences Michelle N. Vu : : Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Texas, Galveston. Patente sobre el sistema genético inverso y el reporte en SARS-CoV-2.

5. Introducción Ilustración por Emily Taylor (Biorender) + ssRNA Codifica proteínas estructurales , no estructurales y accesorias SARS COV 2: Pandemia más grande desde 1918

6. Introducción N (Se une al material genético del virus) E y M se anclan a membrana S : Clave para cruzar pared celular Nat Rev Microbiol   20 , 270–284 (2022).

7. NTD: Dominio N- Terminal RBD :Domunio de unión al receptor FP: Péptido de fusión HR1- HR2 : Dos repeticiones de heptada TM : Dominio transmembrana CP: Péptido citoplasmático FCS : Sitio de clicaje de Purina PRRAR: Sitio polibásico de escisión de furina . mBio . 2021;12(3):e01006-21. Published 2021 May 11

8. PRRAR: Sitio polibásico de escisión de furina .. WT : Wild type Clave en el procesamiento de la proteína de la espiga Longitud y composición del bucle Glicosilación en QTQTN: Interactúa con proteasa Sitio de escisión contiene múltiples elementos necesarios para infección y virulencia.

9. QTQTN Eliminación de QTQN se ha identificado con frecuencia en algunos pacientes Objetivo: Caracterizarlo y determinar si hay consecuencias para la replicación, patogénesis y virulencia Hipótesis: Pérdida → Atenúa la replicación del SARS – COV -2 en células respiratorias in vitro y la patogénesis en hámsters

10. ETAPAS DEL ESTUDIO NGS: Secuencia de nueva generación

11. MÉTODOS

12. MÉTODOS VERO E6: Cultivadas en medio Dulbecco modificado por medio Eagle (DMEM), suplementado con 10% de serum bovino (FBS) + 1% antibiótico/antimicótico Calu-3 2B4 : Cultivo en medio DMEM y FBS + 1% antibiótico/antimicótico+ Piruvato de sodio 1 mg/ml Cultivo celular Secuencias de SARS COV 2 WT y mutante: obtenido del CDC. Virus mutantes se generaron por clonación estándar y sistema de genética inversa Virus CDC: Centro para control y prevención de enfermedades de EE.UU MOI: Multiplicidad total de infección Células se lavaron con solución salina tamponada de fosfato (PBS) y se infectaron con MOI de 0.01 por 45 min a 37° → Absorción y lavado con PBS Infección in vitro Células Vero E6 o Calu-4 que expresan TMPRSS2 con 50 a 100 µM de K11777 o Mesilato de Camostato en 1 ml de medio de crecimiento por 1 h a 37! → Lavado → Infección con SARS o Δ QTQTN Tratamiento con inhibidores de proteasa

13. MÉTODOS Proporciones utilizadas : 1:0, 1:1 y 0:1 WT vs Δ QTQTN → Determinación por unidades formadoras de placa del virus. Luego se recolectó ARN y se secuenció. Ensayos de competencia y secuenciación de próxima generación. Células infectadas se cultivaron → Recolección 24 hpi → Clarificación por centrifugación → Sedimentos de proteínas → Electroforesis en gel → Western Blot Purificación de viriones y Western Blot Hámsteres de 3 a 4 semanas, sirios dorados machos. Se dividieron en grupos de a 5 y se inocularon vía intranasal → Monitoreo diario de síntomas y peso por 7 días .Para la histología se extrajeron pulmones izquierdos, fijados en formalina por 7 días Estudios in vivo

14. MÉTODOS Modelos estructurales por SWISS- Mode l → Modelos de homología para proteína S del SARS-CoV-2 WT, Δ QTQTN y QTQTN glicosilada → Visualizados por PyMOL Modelado estructural Pulmones → ARN se retiró con Kit Direct – zol RNA miniprep Plus → Transcripción inversa → Secuenciación con NextSe1550 Transcriptómica Muestras del virión del SARS COV 2 purificadas con cojín de sacarosa: Análisis por nanolLC -MS por cromatografía líquida Espectros de masas en Tandem se analizaron con estrategia proteómica sin etiquetas ( Proteome Discover ) Mapeo de glucopéptidos por nanoflujo LC-MS/MS

15. RESULTADOS

16. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. Se evaluó: Títulos virales, Cinética de replicación Análisis de la morfología de placas virales

17. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. A . Comparación secuencias Coronavirus 2B.

18. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. B. Generan mutante de QTQTN: Δ QTQTN

19. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. C. Modelado estructural: Δ QTQTN Forma hélice α estable en el bucle en sitio de escisión S1/S2

20. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. D . Titulo viral en Vero V6 infectado en WT o Δ QTQTN (Cinética de replicación) *  P  ≤ 0,05; **  P  ≤ 0,01 ***  P  ≤ 0,001 ****  P  ≤ 0,0001 E. Ensayo de competencia (1:1) entre WT y Δ QTQTN (% ARN) F. Título viral de Calu-3 2B4 infectado con WT o Δ QTQTN

21. RESULTADOS Titulo viral en vero V6 infectado en WT o Δ QTQTN y morfología de placa

22. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la replicación viral in vitro. ΔQTQTN está atenuado en las células respiratorias y tiene una ventaja de aptitud en las células Vero E6

23. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo. Se evaluó: Virulencia de un modelo in vivo Análisis histopatológico de muestras de tejido pulmonar

24. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo. DPI: Dias postinfección

25. RESULTADOS Pelaje erizado Postura encorvada Actividad reducida ↓10% ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo. ***  P  ≤ 0,001

26. RESULTADOS Lesión pulmonar menos extensa. En ambos: Lesiones pulmonares similares: Neumonia intersticial Peribronquitis Peribronquiolitis Vasculitis Infiltración por Linfocitos y edema perivascular . ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo.

27. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo. *  P  ≤ 0,05; **  P  ≤ 0,01 ***  P  ≤ 0,001 ****  P  ≤ 0,0001

28. RESULTADOS ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo.

29. RESULTADOS Atenuación de ΔQTQTN en vivo no se debe a cambio en la capacidad de replicación. ΔQTQTN atenúa la enfermedad pero no la replicación in vivo.

30. RESULTADOS ΔQTQTN reduce el procesamiento y la entrada de la espiga Se evaluó: Procesamiento de la proteína de espiga en sitio de escisión S1/S2. Interacción del virus con proteasas utilizando inhibidores de proteasas.

31. RESULTADOS ΔQTQTN reduce el procesamiento y la entrada de la espiga Western Blott de viriones purificados Cuantificación de la densitometría

32. RESULTADOS ΔQTQTN reduce el procesamiento y la entrada de la espiga Entrada del SARS COV -2 , uso de proteasas e inhibidores Titulo viral de Vero E6 que expresa TMPRSS2 pretratado con dosis variables de Inhibidor de Catepsina Titulo viral de Calu-32b4 pretratado con 100 µM de mesilato de Camostat *  P  ≤ 0,05; **  P  ≤ 0,01 ***  P  ≤ 0,001 ****  P  ≤ 0,0001

33. RESULTADOS Pérdida de QTQTN reduce la capacidad del virus de utilizar TMPRSS2 para entrar. ΔQTQTN reduce el procesamiento y la entrada de la espiga

34. RESULTADOS Glicosilación del motivo QTQTN contribuye al procesamiento de la espiga. QTQTN: Capaz de recibir glucanos grandes → Puede contribuir en interacción con proteasas y ↑ virulencia Se evaluó: Si al modificar sitios de glucosilación se impacta en la replicación y procesamiento de la espiga

35. RESULTADOS Glicosilación del motivo QTQTN contribuye al procesamiento de la espiga. QTQTN: Capaz de recibir glucanos grandes → Puede contribuir en interacción con proteasas y ↑ virulencia

36. RESULTADOS

37. RESULTADOS Glicosilación de ΔQTQTN es importante para interacciones de la proteasa con la espiga. Glicosilación del motivo QTQTN contribuye al procesamiento de la espiga.

38. RESULTADOS El motivo QTQTN : Necesario para infección y patogénesis eficientes del SARS COV 2

39. CONCLUSIONES

40. CONCLUSIONES . El FCS, la longitud/composición del bucle exterior y la glicosilación de QTQTN son necesarios para infección y patogénesis eficiente. Interrupción en estos elementos puede atenuar la infección

41. CONCLUSIONES . Rigor experimental: Enfoque multidisciplinario, integran estudios in vitro e in vivo. Análisis estructurales y funcionales Relevancia clínica biológica: Mecanismos de patogénesis del SARS COV 2 Generalización: Mutaciones son variables entre Coronavirus Solo modelos murinos Periodo de análisis corto Eficiencia de replicación y potencial patogénesis no se pueden reflejar en otras células/tejidos Fortalezas Limitaciones Implicaciones futuras Intervenciones terapéuticas enfocadas en FCS, QTQTN y proteasas del huésped son prometedoras contra los coronavirus.

42. RESULTS ANALYSIS 12% 23% 42% 54% 81% MERCURY MARS JUPITER VENUS NEPTUNE MARS It’s actually a cold place JUPITER It’s the biggest planet MERCURY It’s a small planet

43. ¡Gracias ! Please keep this slide for attribution

44. ALTERNATIVE RESOURCES