Rt pcr (retro-PCR o PCR con retrotranscriptasa)

breve introducción a esta técnica de biología molecular.

1. RT-PCR Protocolo, aplicaciones y análisis de resultados Por: Enrique Pérez Agustín Torres

2. ¿Qué es? Es una variante de la PCR que usa como molde un mRNA en lugar de un dúplex de DNA. En ambos casos el producto es un gran numero de moléculas de DNA. Además, por lo expresado anteriormente se sobreentiende que es necesario una retrotranscriptasa para poder formar DNA a partir de mRNA . RT-PCR

3. Protocolo Síntesis previa de cDNA PCR amplificación

4. Síntesis previa de cDNA

5. Materiales Buffers Rnase free ddH 2 O RT-PCR buffer Enzimas y buffers de enzimas MMLV reverse transcriptase SUPERaseIN Rnase inhibitor Ácidos nucleicos y oligonucleótidos dNTP´s Primers mRNA Additional ítems Tubos de PCR

6. Método Agregar de 2 µl a 50 µl de primers aleatorios en tubos de pared delgada (un tubo por reacción) Agregar hasta 2.5 µg del total de RNA. Añadir 4µl de dNTP . Aforar hasta 16 µl con Rnase free H2O. Aplicar calor hasta llegar a 70 °C por 10 minutos para desnaturalizar la estructura secundaria del mRNAy después colocar inmediatamente en hielo.

7. Agregar 2 µl de 10x RT-PCR buffer Agregar 1 µl de SUPERaseIN (20 unidades/µl) Agregar 1 µl de MMLV retrotranscriptasa (100-200 unidades/µl) Incubar a 42°C por una hora Inactivar la retrotranscriptasa por calentamiento a 95°C por 10 minutos Se procede a continuar con la etapa de amplificación por PCR.

8. Amplificación por PCR

9. PCR Primero debemos saber que el ultimo paso que seguimos fue el de la inactivación de la retrotranscriptasa por calentamiento. Recordemos que tenemos el cDNA hebra sencilla el cual servirá de molde para formar un DNA dúplex. Para formar el dúplex solo se tienen que seguir los pasos de la PCR clásica desde el punto donde el DNA esta desnaturalizado. Después de ello, se prosigue a hacer los ciclos necesarios de la PCR estándar.

10. Análisis de resultados Electroforesis

11. L os productos de reacción son analizados usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio . Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos permite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.

12. Aplicaciones

13. Secuenciación y estudio de retrovirus Estos virus presentan su material genético en forma de RNA y, como su nombre lo indica, necesitan de una retrotranscriptasa para convertirlo a DNA y que el genoma del huésped lo exprese. Por poseer un genoma de RNA se requiere esta variación de la PCR para el estudio de estos tipos de virus.

14. Otras aplicaciones Identificación de células tumorales. Mecanismos inmunológicos y de inflamación. Análisis citogenético molecular de translocaciones cromosómicas Expresión proteica de antígeno específico prostático en células.   Translocaciones en los tumores de piel y partes blandas.

15. Citas bibliográficas Castro Morillo, A. diciembre de 1999. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN El DIAGNÓSTICO EN DERMATOLOGÍA. Variantes de la PCR. Consultado el 13 de noviembre de 2015 de la página http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas_2.htm Cortazar , A. Silva, P. Junio 2014. Métodos físico-químicos en biotecnología. RT-PCR. Universidad Autónoma de México. Tomada de http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf el 13 de noviembre de 2014.} Dieffenbach , C. W. ;   Dveksler , G. S. (2003) PCR Primer: a laboratory manual. (2da ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press.