Secuenciación.pptx

Métodos de secuenciación en biología molecular

1. Métodos de Secuenciación

2. Métodos de secuenciación mejor conocidos

3. Método de Sanger ADN problema Primer modificado ADN polimerasa I dATP dCTP Nucleótidos terminadores dGTP dTTP Desoxinucleótido Didesoxinucleótido Reactivos empleados

4. Efecto de la eliminación del grupo 3’-OH en los ddXTP

5. Efecto de la adición aleatoria de lo ddXTPs durante el proceso de elongación “En cada tubo se obtendrán fragmentos de ADN con diferente tamaño en donde el nucleótido terminador será el didesoxinucleótido”

6. “En cada tubo se obtendrán fragmentos de ADN con diferente tamaño en donde el nucleótido terminador será el didesoxinucleótido” Determinar el peso molecular de los fragmentos y con base en su peso molecular y el tipo de terminador utilizado se determinará la secuencia de nucleótidos del ADN problema.

7. Autoradiografia de un gel de secuenciación por método de Sanger y la secuecia de nucleótidos interpretada en el.

8. Variantes del método Sanger Polimerasas empleadas Marcaje de los fragmentos Sitio de marcaje

9. Automatización del método Sanger

10. Método de Maxam & Gilbert

11. Método Químico: Maxam & Gilbert Metodología básica para la secuenciación por el método de Maxam & Gilbert

12. Método Químico: Maxam & Gilbert Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. Degradación química del ADN Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño Análisis de los fragmentos por electroforesis Los extremos 5’ del ADN de interés son marcados radioactivamente con 32 P. Con enzimas de restricción se descarta el extremo de una de las hebras de ADN. Se adicionan muestras con múltiples copias a cuatro recipientes de reacción.

13. Método Químico: Maxam & Gilbert Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. Degradación química del ADN Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño Análisis de los fragmentos por electroforesis Cada tubo de reacción es sometido a un método de degradación de ADN diferente que escinde a las moléculas en lugares distintos.

14. 1. Corte de las purinas Metilación de A y G con dimetil sulfato (DMS). Después, la reacción es tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas . Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces más rápido), y bandas claras que corresponden a las adeninas

15. 2. Corte de adeninas . Esta reacción es una variación de la anterior. Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas . Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las adeninas , y las guaninas, respectivamente

16. 3. Corte de pirimidinas . Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases citosina y timina . Posteriormente, se trata con piperidina para completar la reacción. 4. Corte de citosina . La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con tiamina , y el tratamiento posterior con piperidina , produce solamente fragmentos que terminan en citosina

17. Ejemplos de reactivos utilizados en la etapa de escisión

18. Método Químico: Maxam & Gilbert Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. Degradación química del ADN Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño Análisis de los fragmentos por electroforesis Obtención de fragmentos de diferente tamaño

19. Método Químico: Maxam & Gilbert Análisis de los fragmentos mediante electroforesis Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. Degradación química del ADN Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño Análisis de los fragmentos por electroforesis

20. Diferencias principales entre ambos métodos En comparación con el método Sanger, el Maxam-Gilbert es el más adecuado para determinar la secuencia de fragmentos cortos de ADN, debido a que puede determinar la secuencia desde la primera base. En cambio, el método de Sanger sólo permite la lectura a partir de la base 10-20. Las reacciones de secuenciación del método enzimático se pueden realizar en unas horas, en cambio las del método de Maxam-Gilbert tardan al menos un día y, además, las reacciones del método de Sanger son más “puras”, con menos contaminantes que puedan afectar la resolución del gel.

21. Métodos de nueva generación Desde el año 2008 la nueva generación de métodos de secuenciación se ha presentado con la aparición de diversas técnicas sin base en el método Sanger. Algunos de los métodos más sobresalientes que hoy en día son usados para la secuenciación de ADN son: Pirosecuenciación Illumina sequencing Roche 454 Genome Sequencing

22. Pirosecuenciación La pirosecuenciación se basa en la formación de cadenas de ADN y en la detección del grupo pirofosfato liberado durante la incorporación de nucleótidos trifosfato en dicha cadena. Enzimas utilizadas en la pirosecuenciación

23. 1.-El equipo libera un dNTP  determinado 2.-Al generarse el enlace fosfodiéster , se libera pirofosfato ( PPi ) 3.-La sulfurilasa usa como sustrato a al PPi para generar ATP 4.- El ATP es sustrato de la luciferasa , el cual libera una señal de fluorescencia que es detectado por la cámara CCD 5.-La enzima apirasa elimina el exceso de ATP y de nucleótidos no incorporados. *La liberación de dNTPS es realizada en forma secuencial.

24. Pirosecuenciación

25. Costo del servicio de secuenciación Empresa Costo del servicio de secuenciación TACGen $2.00- 3.50 / por muestra ACGT $2.50 / por muestra CCIB DNA Core (MGH) $2.12-$3.38 / por muestra Genomics & Epigenomics Shared Resource $3.25 / por muestra Nucleic Acid Shared Resource $5 .0 / por muestra >48 muestras: $3.31 / por muestra Empresa Costo del servicio de secuenciación Functional Biosciences , Inc $7.00 / por muestra DNASU Core Facility Arizona State University $3.70 / por muestra >48 muestras: $3.00 / por muestra Genomics Core Facility $3.75 / por muestra Eurofins $2.5 / por muestra La siguiente tabla muestra algunos ejemplos del precio actual que algunas empresas ofrecen para el servicio de secuenciación. *Los precios varían de acuerdo al número de muestras, su volumen y a la relación con la empresa del servicio

26. Bibliografía Campio RdN , Caultec JC. Instituto de Biotecnología-UNAM. Secuenciación de Ácidos Nucléicos. 2014 Junio. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/ met /secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf Blackburn, G. M. and M. Gait (1996), Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2nd Ed., Oxford, U. Pr., NY, EUA. Ansorge , W., J. Zimmerman , C. Schwager , J. Stegemann , H. Erfle , and H. Voss (1990) One label , one tube , Sanger DNA sequencing in one and two lanes on a gel. Nucleic Acids Res 18(11): 3419-3420