Sistema de Clonación Gateway y multi-Gateeay.pptx

Descripción de la tecnología Gateway
Glosario de Términos
Descripción metodológica
Beneficios y aplicaciones

1. Tecnología Gateway Samuel alejandro chan poot Genomica

2. Tecnología Gateway Es un sistema de clonación Gateway, inventado y comercializado por Invitrogen desde finales de la década de 1990 . Recombinación sitio-especifica basada en el mecanismo de integración y escisión del fago λ El método usa sitios "Gateway att " y dos mezclas de enzimas patentadas, llamadas "LR Clonase" y "BP Clonase ". No se utilizan enzimas de restricción

3. Términos importantes Sitios att : longitud definida de ADN que constituye un sitio de recombinación. Hay 4 clases de sitios att llamados attB , attP , attL y attR . Gen ccdB : gen contraseleccionable que permite la selección negativa de subproductos plásmidos no deseados después de la recombinación . Vector donante ( pDONR ): vector con sitios attP que flanquean un gen contraseleccionable que se recombina con un gen de interés flanqueado por sitios attB . Reacción de BP: un evento de recombinación entre los sitios attB y attP catalizado por BP Clonase ™ II Entry clon( pENTR ): vector que contiene un gen de interés flanqueado por sitios attL o attR . Reacción LR: un evento de recombinación entre los sitios attL y attR catalizado por LR Clonase ™ II Vector de destino (DEST): vector orientado a la aplicación con sitios attR que flanquean un gen contraseleccionable que se recombinará con uno o más clones de entrada.

4. Paso 1 El primer paso implica generar un gen o fragmento de ADN con sitios de recombinación de attB1 y attB2 flanqueantes . G en Gene synthesis Library Colección de ORF PCR Fuente propia Digestión con ERs

5. BP Clonase ™ II Reacción BP GEN attB1 attB2 attP1 attP2 ccdB KanR pDONR  

6. Reacción LR p ENTR KanR GEN attL1 attL2 attR1 attR2 ccdB AmpR DEST LR Clonase ™ II attB1 attB2 GEN AmpR pEXP -Gen attP1 attP2 ccdB KanR Bioproducto toxico  

7. + Células competentes

8. Clonación Multi -sitio Tienen versiones modificadas de los sitios attB , P, L y R que se recombinan de manera muy específica y direccional: los sitios attB1 reaccionan solo con los sitios attP1; attB2 solo con attP2, attL1 solo con attR1; attL2 solo con attR2, y así sucesivamente

9. Beneficios y aplicaciones Clonación direccional Mantiene el marco de lectura Sin enzimas de restricción Sin ligadura 1 hora, reacción a temperatura ambiente con > 99% de eficiencia Sin re-secuenciación Reacciones reversibles Ejemplo de Aplicaciones: Expresión de vías enzimáticas Expresión de complejos proteicos de múltiples subunidades Vectores para transformación de plantas

10. Gracias