Tema 7. Procesamiento citológico y tisular

Tema 7 del temario del módulo de Procesamiento citológico y tisular del CFGS de Anatomía Patológica y Citodiagnóstico.

1. PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR TEMA 7 Procesamiento de muestras celulares

2. 1. Materiales y equipos básicos para el procesamiento citológico Centrífugas de diferentes tamaños y velocidades (dependiendo del tipo de líquido, debemos usar un tiempo y unas revoluciones distintas). Teñidor. Montador. Campana extractora de seguridad (hay que usarlo, además de los EPI, para manipular las distintas muestras que llegan a anatomía patológica para protegernos de los distintos patógenos). Portaobjetos. Cubreobjetos. Cubetas de cristal y plástico de diferentes tamaños, y tubos con tapa Eppendorf (microbloque y centrífuga). Pinzas sin dientes y tijeras. Material volumétrico (probetas, matraces aforados, etc.). Pipetas de cristal y pipetas Pasteur de diferentes medidas. Moldes para citocentrífuga: dependiendo de la técnica a emplear (convencional o líquida), se usarán citocentrífuga o citoprocesadores. Etanol de diferentes graduaciones (50º, 70º, 96º y absoluto), metanol, hematoxilina, Orange G, EA50, reactivos 1 (naranja) y 2 (azul) para técnica de Diff-Quick , acetona, tinciones citoquímicas, casetes, formol.

3. 2. Procesado general del material citológico 2.1. Citología exfoliativa corporal. En este grupo se engloban todas las muestras extraídas de forma no invasiva. Estas se pueden obtener mediante cepillos, torundas u otros dispositivos que obtengan células descamadas naturalmente (citologías cérvico-vaginales, citologías vaginales simples, citologías de vulva, citología de endometrio, cepillado de mucosa oral, cepillado de mucosa bronquial), también las muestras obtenidas de secreciones naturales del cuerpo (secreciones del pezón, secreciones de otros orificios naturales o no naturales corporales). Además, las muestras obtenidas mediante PAAF también se procesan con los mismos procedimientos. El material obtenido mediante PAAF puede provenir de cualquier parte del cuerpo susceptible de ser pinchada sin mayor contraindicación médica. Las muestras se reciben en anatomía patológica extendidas sobre un portaobjetos que puede estar seco al aire, conservado con fijadores (citoespray) o conservado sumergido en alcohol de 96º. La manera de procesar estas muestras dependerá de cómo se reciban en el laboratorio y de la tinción que se vaya a hacer. Hay que recordar que es necesario que nos comuniquen si las muestras recibidas en portaobjetos están secas al aire o conservadas en fijador, ya que a simple vista es difícil saberlo y podemos tener problemas en su procesado.

4. Muestra Tinción Proceso Portaobjetos seco al aire Diff-Quick Comenzar directamente la tinción con la muestra en seco Papanicolau u otras técnicas Sumergir en alcohol 96º un mínimo de 15’ para hidratar la muestra de nuevo e iniciar la técnica requerida Portaobjetos conservado en fijador (citoespray) Diff-Quick Sumergir en alcohol 96º un mínimo de 15’ para eliminar el fijador e hidratar la muestra. Proceder con la técnica teniendo en cuenta que la técnica está hidratada Papanicolau u otras técnicas Sumergir en alcohol 96º un mínimo de 15’ para eliminar el fijador e hidratar la muestra de nuevo. Iniciar la técnica requerida Portaobjetos sumergido en alcohol 96º Diff-Quick Proceder con la técnica teniendo en cuenta que la muestra está hidratada Papanicolau u otras tinciones Iniciar la técnica requerida

5. 2.2. Líquidos corporales y orinas. Los líquidos corporales más estudiados en el laboratorio de citología son líquido pleural, líquido peritoneal o ascítico, líquido pericárdico, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido sinovial y orina, tanto de micción espontánea como mediante maniobras de instrumentación (lavado vesical, cateterización o cepillado). Aunque estos son los más estudiados, se puede estudiar cualquier líquido del cuerpo del que se necesiten estudiar sus células. Para ese estudio hay que comenzar por el centrifugado . Dependiendo de la muestra, se elegirá el tipo de centrífuga y su programa más adecuado.

6. Las centrífugas más utilizadas son las tres siguientes: Centrífuga de decantación . Es un aparato de gran tamaño que se utiliza para concentrar las células de muestras líquidas con grandes volúmenes mediante fuerza centrífuga, y así poder separarlas del medio líquido. Esta máquina se utiliza como paso previo, ya que sirve para preparar estas muestras para su procesado. Dependiendo de la cantidad de material obtenido después de la decantación se seguirá un procedimiento u otro; si se observa que el material obtenido es denso y rico en celularidad se procederá a hacer un citobloque; si por el contrario se obtiene un material más líquido, se extraería y se diluiría en 1 ml de PBS para centrifugarlo de nuevo en una centrífuga tipo Cytospin.

7. Citocentrífuga . Es un aparato de menor tamaño que la centrífuga de decantación, y que se utiliza para aglutinar las células de un líquido con un volumen no superior a 2 ml sobre un portaobjetos. Este tipo de centrífuga emplea unos recipientes especiales llamados citocámaras, en los cuales se coloca un portaobjetos. Estas citocámaras poseen una apertura por donde se introduce el líquido. Acto seguido se coloca el molde cerrado con el portaobjetos y la muestra líquida en el aparato y se centrifuga; así se obtendrá un portaobjetos con una muestra de las células que porta el líquido adheridas a él. El material sobrante y las citocámaras se desechan.

8. Citología en medio líquido . Es un proceso de mayor calidad que los anteriores. Consiste en la absorción de una muestra a través de un filtro que retiene las células hasta que se satura y las deposita sobre un portaobjetos tratado específicamente para tal fin. Así se obtiene una muestra con una mayor calidad y limpieza. Es un procedimiento que cada vez se utiliza más por sus ventajas frente a la citología convencional, pero que no se ha llegado a implantar completamente debido a su alto coste. Este tipo de procesado de muestras se puede utilizar para todo tipo de líquidos, aunque requiere un procesamiento previo que dependerá de las especificaciones técnicas del aparato y de los productos. Aparatos para centrifugar y procesar citología en medio líquido en el Hospital Nuestra Señora del Prado de Talavera de la Reina (Toledo).

9. Muestra Equipo para procesado Programa de centrifugado Orina Citocentrífuga 900 rpm – 15’ LCR Citología en medio líquido Hasta saturación del filtro Líquido pleural Citocentrífuga 700 rpm – 10’ Líquido peritoneal o ascítico Citocentrífuga 700 rpm – 10’ Líquido pericárdico Citocentrífuga 700 rpm – 10’ Líquido sinovial Citocentrífuga 900 rpm – 14’ El portaobjetos con material que se obtiene después de la centrifugación ha de sumergirse en alcohol de 96º durante al menos 15’ para que se produzca la fijación de las células sobre el cristal y que éstas no se desprendan durante el proceso de tinción. Es importante recordar que la velocidad y el tiempo de centrifugado del líquido dependen de la viscosidad y de su celularidad, y que en ningún caso deben ser elevadas para que no se produzca la lisis celular.

10. 2.3. Vías respiratorias . La citología de vías respiratorias es un tipo de citología exfoliativa. Se puede obtener de varias maneras, dependiendo del tipo de patología que se quiera estudiar. Esputo : consiste en material obtenido mediante expectoración del paciente (tanto espontánea como inducida). Este tipo de muestra se recibe en fresco. Para su procesado se toma una pequeña muestra, se deposita sobre un portaobjetos y se realiza una extensión (lo más fina posible) con ayuda de otro portaobjetos. Esta operación se repite hasta obtener un número significativo de cristales que represente la totalidad de la muestra. Una vez realizada la extensión hay que sumergir el cristal un mínimo de 15’ para la fijación de la muestra en alcohol de 96º antes de la tinción. Las muestras de esputo siempre han de ser manipuladas en un medio seguro, ya que pueden contener patógenos respiratorios transmisibles al personal que está procesando la muestra (p. ej., bacilo de Koch). Han de realizarse siempre bajo campana extractora.

11. Lavado broncoalveolar (BAL) : consiste en la inyección de una cantidad variable de suero salino que “lava” el segmento pulmonar y que posteriormente se recoge por medio de aspiración. Esta muestra está constituida por material mucho menos denso que el esputo. Su procesamiento consiste en la centrifugación del material obtenido en la centrífuga de decantación, se desecha el material sobrenadante y se diluye el material restante en 1 ml de PBS. La dilución obtenida se centrifuga en la Cytospin a 500 rpm durante 10’, obteniendo así un portaobjetos con las células adheridas a él, que se debe sumergir en alcohol de 96º durante 15’ como mínimo antes de la tinción. Aspirado broncoalveolar (BAS) : al mismo tiempo que se realiza una broncoscopia se aspira material directamente del árbol bronquial. Este material es espeso y denso y su procesamiento es igual que el del esputo. En caso de que el material no sea de una consistencia tan densa y espesa, el procesamiento será igual que el del lavado bronquial.

12. Aspirado broncoalveolar (BAS) : al mismo tiempo que se realiza una broncoscopia se aspira material directamente del árbol bronquial. Este material es espeso y denso y su procesamiento es igual que el del esputo. En caso de que el material no sea de una consistencia tan densa y espesa, el procesamiento será igual que el del lavado bronquial. Hifas anchas y sin septos de hongo inferior en aspirado traqueal. Tinción G-G (Gomori-Grocott).100X

13. 3. Fundamento, reactivos y protocolos de las diferentes técnicas de tinción 3.1. Técnicas rutinarias. Las técnicas más utilizadas para la tinción de citologías en el laboratorio son: Papanicolau. Es una de las técnicas más utilizadas, ya que permite ver una gran cantidad de detalles citológicos sobre los que se basa el diagnóstico. Esta técnica se utiliza para teñir cualquier tipo de muestra citológica. Los colorantes utilizados son: Hematoxilina . Se utiliza como colorante nuclear que tiñe el núcleo de las células de un color azul oscuro. La más utilizada es la hematoxilina de Harris, aunque también se pueden utilizar otras como la de Lillie-Mayer. Orange G . Junto al EA-50 constituye el tándem de reactivos que más se utilizan para la tinción del citoplasma. Este compuesto tiñe de color naranja los citoplasmas de las células que contienen queratina (como las células de los carcinomas epidermoides). EA-50 . Es la solución de eosina alcohólica más utilizada. Tiene cantidades variables de otros compuestos (EA-36, EA-50, EA-65). Es junto al Orange G, el responsable de la tinción del citoplasma celular.

14. Alcohol 96º 30 minutos Baño rápido en alcohol 70º 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en agua 10 inmersiones sucesivas Hematoxilina de Harris 3 minutos Baño rápido en agua 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en alcohol 70º 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en alcohol 96º 10 inmersiones sucesivas Orange G 2 minutos Baño rápido en alcohol 70º 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en alcohol 96º 10 inmersiones sucesivas EA-50 3 minutos Baño en alcohol 70º 1 minuto Baño rápido en alcohol 96º 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en alcohol absoluto 10 inmersiones sucesivas Baño rápido en xilol 10 inmersiones sucesivas Montaje Este es uno de los protocolos que se pueden seguir con la técnica de Papanicolau. Pueden varias los tiempos y algunos baños en alcohol, pero la estructura es aproximadamente la descrita. Hay que recordar que es conveniente escurrir sobre papel de filtro las preparaciones al pasarlas de un reactivo a otro.

15. Diff-Quick . Esta técnica se realiza sobre extensiones secadas al aire. La técnica consiste en la combinación de dos coloraciones sucesivas. Esta tinción resalta detalles celulares y los distintos componentes del fondo, como el colágeno, la mucina o el coloide. En la actualidad se utilizan dos colorantes comerciales: colorante I (naranja) y colorante II (azul), que proporcionan una gama cromática muy amplia, ya que tiñen las distintas estructuras de diferentes colores (neutrófilos: rosa, eosinófilos: marrón rojizo, basófilos: púrpura, núcleos celulares: azul violáceo, citoplasmas: de azul claro a rosa). Linfadenopatía cervical. Tinción diff-quick .

16. Las muestras, una vez secas completamente, pasan a: Metanol 15 segundos Reactivo I (naranja) 30 segundos Reactivo II (azul) 45 segundos Agua corriente Lavar abundantemente Si la coloración no es satisfactoria, la tinción puede volver a repetirse sin necesidad de decolorar la muestra. Sumergiríamos el portaobjetos de nuevo en el reactivo I ó II y continuaríamos el proceso. Secar al aire El tiempo que sea necesario Xilol 15 inmersiones sucesivas Montaje

17. Para que los reactivos se mantengan limpios más tiempo se puede escurrir sobre papel de filtro las extensiones antes de pasarlas al siguiente reactivo. Después de realizar esta técnica sobre una citología sería posible realizar la técnica de Papanicolau sobre ésta sin necesidad de decolorarla previamente. Hematoxilina-eosina. Esta técnica es muy utilizada no sólo en citología, sino también en histología, constituyendo, en este caso, la tinción de rutina. Consta de dos partes: la tinción nuclear y la citoplasmática, con múltiples variantes, según el tipo de hematoxilina que se utilice. Hematoxilina. Existen varios tipos; las más utilizadas son la de Harris (se utiliza si la muestra se seca al aire) y la de Carazzi (si la muestra se fija en alcohol de 96º). Colorea el núcleo celular confiriéndole un color azul-azul oscuro. Eosina. Es el colorante de contraste. Colorea el citoplasma celular en tonos rosáceos o anaranjados.

18. Si la muestra se recibe secada al aire: Hematoxilina de Harris 1 minuto Agua corriente Lavar abundantemente Eosina 10 inmersiones sucesivas Alcohol 96º 15 inmersiones sucesivas Alcohol 96º 15 inmersiones sucesivas Alcohol absoluto 15 inmersiones sucesivas Alcohol absoluto 15 inmersiones sucesivas Xilol 15 inmersiones sucesivas Xilol 15 inmersiones sucesivas Montaje

19. Si la muestra se recibe fijada en alcohol de 96º: Agua corriente Lavar abundantemente Hematoxilina de Carazzi 15 minutos Agua corriente 15 minutos Eosina 10 inmersiones sucesivas Alcohol 96º 15 inmersiones sucesivas Alcohol 96º 15 inmersiones sucesivas Alcohol absoluto 15 inmersiones sucesivas Alcohol absoluto 15 inmersiones sucesivas Xilol 15 inmersiones sucesivas Xilol 15 inmersiones sucesivas Montaje Para que los reactivos se mantengan limpios más tiempo se puede escurrir sobre papel de filtro las extensiones antes de pasarlas al siguiente reactivo.

20. 3.2. Técnicas citoquímicas para determinadas patologías. Además de las técnicas de rutina, existe una variedad enorme de técnicas complementarias para las distintas patologías. Las más utilizadas son PAS, plata metenamina, Ziehl Neelsen, etc., y sus procedimientos son los mismos que para histología, con la excepción de que no es necesario desparafinar e hidratar la muestra.

21. 4. Control de calidad de la preparación. Conservación y archivado A la hora de recibir la muestra hay que asegurarse de que viene identificada con el nombre y los apellidos del paciente (si fuera posible una pegatina identificativa del centro sería lo óptimo) y, en el caso de que la muestra fuera múltiple, los botes o cristales también han de venir identificados para saber el orden (p. ej., si se recibe una orina de varios días debe figurar cuál es la del primer día y así con los sucesivos botes). También ha de venir en perfectas condiciones ; esto significa que el cristal debe venir fijado en alcohol o con citoespray, o bien debe venir completamente seco; si es un líquido o una muestra de esputo debe venir en un bote especial para dicho fin, cerrado y refrigerado (si fuese necesario), ya que una muestra en fresco puede permanecer a temperatura ambiente menos de 12 horas, y de 12 a 24 horas en nevera a 4ºC; para más de 24 horas, con un máximo de 2 semanas, hay que diluir la muestra en un volumen de alcohol de 50º o de 70º igual que el volumen de la muestra. Una vez superado ese tiempo la muestra se degenera y no sería válida para el diagnóstico. Cualquier tipo de muestra que no reúna estas características no debe ser aceptada , ya que podría acarrearnos problemas futuros. Una vez recibida la muestra se procede a su identificación dentro del laboratorio y a su procesado.

22. En la medida de lo posible, hay que estudiar la muestra cuanto antes, ya que, a pesar de los conservantes, la muestra poco a poco se va deteriorando . También depende del tipo de muestra, por ejemplo, para el estudio de LCR hay que iniciarlo inmediatamente, si no se degenerarían las células y no sería válido para diagnóstico; sin embargo, para el estudio de orinas con el método de conservación adecuado el inicio del procesamiento podría realizarse posteriormente. Después del procesado hay que asegurarse de que la muestra está en perfectas condiciones para el diagnóstico : es importante mirar la muestra al microscopio para asegurarse de que la coloración es correcta, de que las células no han sufrido ningún proceso de degeneración, no por patologías, sino por un fallo en la conservación o de procesado de la muestra, y de que no existen artefactos en la muestra que dificulten el diagnóstico, como por ejemplo filamentos de sustancias exógenas a la muestra, gotas líquidas como resultado de la mezcla de xilol y agua, polvo morado marronáceo que indica desecación durante el procesado antes del medio de montaje o cristales azulados, que son el resultado de una mala filtración de la hematoxilina. A la hora de archivar las muestras se debe tener en cuenta que pasados los tiempos de conservación, las muestras no son válidas para su estudio y deben ser desechadas.

23. Los portaobjetos ya procesados cuyo estudio haya finalizado se deben almacenar en cajones adecuados para ello y hay que asegurarse de que el cristal está en perfectas condiciones para su almacenamiento; es decir, que el medio de montaje está perfectamente seco (2 ó 3 días después del montaje), ya que si se guarda sin ser así podría desbordarse y pegarse al resto de cristales; y el cubreobjetos debe estar perfectamente adherido al porta sin dejar bolsas de aire ni burbujas en su interior (o las menos posibles) para que el material al aire no se degrade y sirva para un estudio futuro. Durante este archivado de muestras hay que ser consciente de que es una tarea de vital importancia, ya que en numerosas ocasiones las muestras serán únicas, y en caso de producirse un estudio futuro debemos disponer de este material de referencia para ver la evolución del diagnóstico. Por lo tanto, es muy importante conocer el sistema de archivado del laboratorio para poder recuperar una muestra del archivo rápidamente y no extraviarla.

24. 5. Bloques celulares. Concepto, fundamento y preparación Los bloques celulares o citobloques se obtienen de muestras citológicas que son demasiado celulares para poder realizar un estudio citológico normal o de rutina; así, se podría decir que son acumulaciones celulares que finalizan su proceso como una biopsia. Existen diferentes procesos para realizar un citobloque: Coágulo . En distintas ocasiones, al recibir las muestras líquidas en el laboratorio de citología, por causa natural o inducida, podemos encontrarnos coágulos de diferentes compuestos (sangre, moco, etc.). La mejor manera de estudiarlos es realizar un citobloque con este material. Es el más fácil de los procesos: se coge el coágulo y se envuelve en papel de arroz, que es un medio que permitirá manipular la muestra. El coágulo envuelto en papel de arroz se introduce en un casete y se inicia el proceso como si de una biopsia se tratase.

25. Tubo Eppendorf . Si al recibir la muestra observamos que el material es muy denso o celular se procederá a hacer un citobloque. No se puede emplear el procedimiento anterior, ya que las células no forman un grupo cohesionado. Se procederá de la siguiente manera: Procedimiento Equipo Programa Centrifugar todo el material Centrífuga de decantación 10’ a 2.000 rpm Decantar Traspasar todo el material a uno o varios Eppendorf Añadir 1 ml de formol en cada tubo Eppendorf que utilicemos Centrifugar Centrifugadora de Eppendorf 20’ a 4.000 rpm Desechar el sobrenadante y extraer el material Envolver el material en papel de arroz Meterlo en un casete y procesar como una biopsia

26. Citogel . El proceso es similar al proceso mediante Eppendorf, con algunas diferencias: Procedimiento Equipo Programa Centrifugar todo el material Centrífuga de decantación 10’ a 2.000 rpm Decantar Añadir 10 ml de etanol Centrifugar Centrífuga de decantación 10’ a 2.000 rpm Decantar sobrenadante Añadir sobre la muestra el citogel previamente calentado para que esté líquido Meter el tubo con la muestra al congelador unos minutos para que el citogel se solidifique Extraer del tubo la muestra Envolver el material en papel de arroz Meterlo en un casete y procesar como una biopsia

27. Hay que recordar que la realización de un citobloque facilita determinados estudios, como los de IHQ, ya que en ocasiones estos estudios obligan a realizar una cantidad elevada de cortes o muestras. En la actualidad comienzan a aparecer aparatos que realizan todo el proceso automáticamente, desde la muestra líquida hasta la muestra incluida en parafina.