10.Enzimatik Analiz Yönteminden Beklenen Özellikler (1).pdf

10.Enzimatik Analiz Yönteminden Beklenen Özellikler

1. BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER
Geneldebiranalizyönteminiözeldeisebirenzimatikanalizyönteminiseçerken
beklentilerinneölçüdekarşılandığınadikkatedilmelidir.Yöntembeklentilerine
ölçüdekarşılıyorsaoölçüdeidealdir.Biranalizyöntemindenbeklenen
özellikler;
a)Spesifikolmalıdır.
b)Örnekhazırlığıkolayolmalıdır.
c)Uygulamavetayininkolayolmasıistenir.
d)Tekraredilebilirolmalıdır.
e)Yüksekduyarlığasahipolmalıdır.
f)Hızlısonuçalınabilenbiryöntemolmalıdır.
g)Ucuzbiryöntemolmalıdır.
h)Otomatizeedilebilirolmalıdır.
i)Yanetkilerdenazetkilenmelidir.
j)Yöntemdemümkünsetehlikesizmaddelerkullanılmalıdır.

2. Bu10faktörgözönünealındığındayöntemhakkındagerçekbirfikiredinilebilir.
Ancakenzimlergeneldepahalımaddelerolduğundanimmobilizeedilerek
kullanılmalarıyolunagidilir.Bu10faktörkısacaaçıklanacakolursa;
1.Spesifiklik:Kimyasalanalizyöntemlerinekarşıenzimatikanalizyöntemlerinin
üstünlüklerindenbirispesifikliktir(Dahaöncespesifikliğintürlerinden
bahsedilmişti).Yöntembelirlibirmaddeyespesifikolmalıdır.Spesifiklikbir
ölçüdedoğruluklailişkilidir.Yöntemnekadarspesifiksealınansonuçtao
kadardoğrudur.
2.ÖrnekHazırlığı:Örnekhazırlığızorsapara,zaman,enerjiveişgücükaybıolur.
Mümkünsedoğrudanörnekileanalizegeçmekbüyükavantajsağlar.Kimyasal
analizlerdeanalizlenecekmaddeyabancımaddelerdeniyicearındırılmalıdır.Bu
iseyorucu,masraflıvezamanalıcıişlemlerigerektirir.Enzimatikanalizlerdeyse
birseyreltme,süzme,filtrasyonveyasantrifüjlemeyeterliolabilir.Veyabu
işlemlerdenhiçbiriniyapmakgerekmeyebilir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

3. Enzimatikanalizlerinçoğuspektrofotometrikanalizedayandığındanörnekten
beklenenözellikonunberrakolmasıdır.Renkliveberrakolmayançözeltiler
problemyaratırlar.Yineörnekçözeltisininkuvvetliasidikveyabazikolmaması
istenir.Renkgidermekiçinaktifkarbon,poliamit,bentonit,polivinilvbmaddeler
adsorbanolarakkullanılabilir.Ancakbumaddelerindeherhangibirgirişimeneden
olupolmadığınınstandarteklemeyöntemiyletestedilmesigerekir.
Bulanıklıksözkonusuiseabsorbansölçmekmümkündeğildir.Katıpartiküller
ışığıkırarlar.Çözeltiyiçeşitliyöntemlerleberraklaştırmakgerekir.
Berraklaştırılamıyorsaspektrofotometrikyöntemindışındabiryöntemseçilir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

4. 3.UygulamaveTayininKolaylığı:Yöntemözelbirbeceriistememelidir.Çünküözel
beceriisteyenbiryöntem,yabizibaşkalarınabağımlıkılar,yadaözelyetişmiş
elemanaihtiyaçdoğurur.Budaparakaybınanedenolur.
4.TekrarEdilebilirlik:Analizsonuçlarınıngündengünevelaboratuardanlaboratuara
değişmemesigerekir.Tekraredilebilirliğiolmayanveyaherseferindefarklı
sonuçlarınalındığıbiryöntemsağlıklısonuçlarvermeyeceğiiçinkullanılmaz.
5.DoğrulukveDuyarlık:Doğrulukveduyarlıkfarklışeylerdir.Herhangibiryöntemle
yapılanvetekrarlanananalizlerdeaynısonuçlarbulunuyorsabuyöntemin
duyarlılığının(prezisyonunun)yüksekolduğunugösterir.Ancaksonucundoğru
olduğunugöstermez.
Ortalamadeğerbulunurken,bulunandeğeryapılandeneysayısıylaçarpılıp,
ortalamalarıalınarakhesaplanır.Ayrıcabirçokkeztekrarlanananalizlerde
bulunansonuçlarınortalamabirdeğerininalınmasıtesadüfihatalarınortadan
kaldırılmasınayardımcıolur.Budeneylerdesapmanekadaraziseyaniyayılmane
kadarazsayönteminduyarlılığıokadariyidir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

5. Duyarlılıkiçinölçüstandartsapmadır;
Standart sapma, S = [∑(X-X)2 / n-1]1/2
X=Ortalamadeğer,X=Ölçülendeğer,n=Denemesayısı
Varyasyon katsayısı, V.K= S / X . 100
Enzimatikanalizlerdevaryasyonkatsayısı%1veyadahaaltındabulunabilir.Bir
enzimatikanalizdedoğrusonuçlareldeetmekanalizinesasamacıdır.Bunedenle
yöntemindoğruluğunukontroletmekgerekir.
Biryöntemindoğruluğunukontroletmekiçinyapılmasıgerekenişlemler;
§Öncelikletayinedilecekmaddeninsafbirörneğiilekullanacağımızyöntemden
yararlanaraktayinyapılır.Eğerbilinendeğerlerbulunuyorsa“sonuçdoğrudur”
diyebiliriz.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

6. §Yöntemindoğruluğuiçinfikirvermesiaçısındandeğişikörnekhacimleriileçalışmak
gerekebilir.Herhacimdebulmamızgerekensonucueldeedebiliyorsakyöntem
doğrusonuçveriyordemektir.
§Herhangibiryöntemindoğruluğunuincelemekiçiniçindekitayinedeceğimiz
maddedendışarıdandaeklenerek(bilinenmiktarlarda)ölçümleralınmalıdır.Bu
işlemiçinikiyolvardır;
a)Tayinedilecekmaddeyiiçerenörnekilereaksiyongerçekleştirilir.Reaksiyonsona
erdiktensonraortamastandartçözeltidenbellibirmiktareklenir.Eklenenvemiktarı
bilinenmaddeninsözkonusumiktarınıaynenbulmamızgerekir.Bulunamazsabir
hatakaynağıvardırdemektir.Ancakbuişlemsırasındahacimdeğişimlerinidegöz
önünealmamızgerekir.
b)Başkabirşekildekördenemeveörnekdenemeyanında(örnek+standart)çözelti
karışımıiledeanalizyapılır.Buişleme“standartekleme”denir.Örnektebulunan
miktar,(örnek+standart)tançıkarılırsaeklenenstandardınmiktarıbulunabilir.Bu
miktardoğruolarakbulunabiliyorsayöntemindoğrubiryöntemolduğusöylenebilir.
Tekrar Bulma = (ΔAörne+standart-ΔAörnek / ΔAstandart )X 100
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

7. Birenzimatikanalizdedoğruluğuetkileyenbaşlıcahatalarşuşekildesıralanabilir;
1.Örneğinhomojenliğiyeterincesağlanmamışolabilir
2.Tartımhatasıyapılmışolabilir
3.Seyreltmehatasıyapılmışolabilir
4.Hacimselhatayapılmışolabilir
5.Küvetkalınlıklarıfarklıolabilir
6.Okumalardahatayapılmışolabilir
Birenzimatikanalizyöntemindeduyarlılıkvedoğruluğunyanısıra“hassaslık”ta
büyükönemtaşır.Birenzimatiktayininhassaslığıölçümprensibine,test
hacminevespektrofotometrikanalizsözkonusuysaekstinksiyon(Molar
absorptivite)katsayısınabağlıdır.Örnekolarak;0.1mlörnekhacmine1ml
tamponve2mldistilesueklendiğindeanalizyapmamızdurumundatayin
yapamıyorsakyönteminhassaslığıyeterlideğildemektir.Budurumdaörnek
hacmi,dolayısıylatayinedilecekmaddekonsantrasyonunuarttırmakgerekir.
Örneğin,0.1mlörnekyerine2.0mlörnekeklenerekmaddemiktarını20kat
arttırmışoluruz.Budaduyarlılıksınırınaulaşılmasınısağlayabilir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

8. Bazıdurumlardaekstinksiyon(Molarabsorptivite)katsayısı(є)arttırılabilerek
yönteminhassaslığıdaarttırılabilir.NADPHveyaNADH’ınekstinksiyonkatsayısı,
є=6.3L/mmolcm’dir.AncakNADPHveyaNADH,diaforazkatalitiketkisivarlığında,
iyotnitrotetrazolyumklorür(INT)ileetkileştirildiğindebirfarmazontürevioluşur.
Busayedeє=19.9L/mmolcmolur.Böylecehassaslıküçkatartmışolur.
Ancakbazıdurumlardadaçokyüksekhassaslıkenzimatikanalizdesakınca
yaratabilir.Örneğinalkollüiçkilerdealkolyüzdesioldukçafazladır.Örneğinçok
fazlaseyreltilmesigerekebilir.Buseyreltmesırasındayapılacakküçükhatalar
önemliyanılgılaranedenolabilir.Örneğin%40’lıkvotkadan1mLalınıp,1000kat
seyreltirsek999mLsukoymakgerekir.Sonuçta1000mL’likörnekhazırlanmış
olur.1mLörnekalırken±%1’likhatayapılırsa,990veya1010mLolacaktır.Bu
örnekten0.1mLalınmasıdurumundahatadahadabüyüyebilir.
6.Hızlısonuçalabilme(Zaman):Enzimatikanalizlerdiğeryöntemleregöre,enzimlerin
reaksiyonhızını~1010katarttıdıklarıiçinçokdahaazzamanalırlar.Yöntemden
yöntemeanalizzamanıçokdeğişir.1dk,5dk,10dkveya1saatalanyöntemler
bulunmaktadır.Kısasüredesonuçalabilmeközelliklerutinanalizlerebüyük
kolaylıksağlar.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

9. 7.DüşükMasrafaGereksinimGösterme(Ekonomiklik):Enzimatikanalizlergenelde
pahalıyöntemlerdir.Gerçiböylebiryöntemdeesasgirdivepahalıolanenzimve
varsakoenzimdir.Diğerreaktiflergeneldegöreceucuzdur.Ancakharcananemek
veişgücügözönünealınırsa,dahauzunzamanalan,dahaçokişlemgerektiren
vedolayısıyladahafazlaişgücünegereksinimgösterenkimyasalyöntemlerinde
pekucuzolmadığıgörülür.Geneldeenzimatikyöntemlerleçalışıldığındaçok
küçükhacimlerleçalışılabildiğindenmikropipetlerinkullanılmasıgerekir.Bunlar
daekbirmasrafdoğurabilir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

10. Enzimlerçokspesifikmaddelerolmalarınarağmen,aşırıpahalıolmaları(bu
özellikenzimdenenzimedeğişebilir),çalışmayöntemlerininözeldeneyim
gerektirmesi(enzimolojibilgisigerektirir)veçoğuenzimlerinkararlılığının
düşükolmasıgibidezavantajlaradasahiptirler.Enzimlerimmobilize
edilerekbudezavantajlargiderilebilirvebazıavantajlareldeedilebilir.
Böyleceenzimlerbasitişlemlerlegerikazanılabildiğiiçinaynıenzimpek
çokkezkullanılabilirveböylecemaliyetdüşer.Çokazmiktardaenzim
preparatıilesonucaulaşılabilir.İmmobilizasyondansonraenziminpHve
termalkararlılığıçoğukezartar.İmmobilizeenzimlerikullanarak;enzim
elektrotlarıile,enzimreaktörleriile,afinitekromatografisiileveenzim
termistörleriileenzimatikanalizleryapılabilir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

11. 8.YönteminOtomatizeEdilebilirOlması:Özelliklehastanelerdekiklinikanalizlerde
veyaseriüretimyapılanfabrikalardabirgüniçindebinlerceanalizinyapılabilmesi
gerekmektedir.Bunedenlebutüramaçlarayönelikenzimatikanalizlerdesonuçta
otomatizeedilebilirözellikteolmasınadikkatedilmelidir.
9.YanEtkilerdenAzEtkilenme:Geneldeenzimlerspesifikbiyokatalizatörleroldukları
içinörnekiçindekipekçokmaddeyöntemegirişimyapmaz.Ancakörnekiçinde
mikrobiyalfaaliyetiengelleyicimaddelervarsa,bunlarenzimaktivitesiniazaltarak
mikrobiyalfaaliyetidurdurduklarıiçinyöntemietkileyebilir.Ancakbuihtimalde
çokyüksekdeğildir.Bazıdeterjanlarvegıdaboyalarıspektrofotometrik
ölçümlerdehataya(girişime)nedenolabilir.Gerektiğindeseyreltmeyapılabilmeli
örneğiniçindebizimreaksiyonumuzuetkileyebilecekyabancıbirenzimvarsao
inaktifhalegetirilmelidir.Rahatsızedicimaddelerinvarlığınısaptamakiçinfarklı
miktarlardaörnekileçalışırız.Bunlariçinbulunansonuçlarbaşlangıçtaalınan
örnekmiktarlarıylaorantılıolmalıdır.Fazlayadaazbulunuyorsayöntemirahatsız
edicibirfaktörvardemektir.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER

12. 10.YöntemdeTehlikesizMaddelerinKullanılması:Yöntemdeözellikle,doğalyaşama
vebireyleresaygınınbirgereğiolarak,insansağlığınaveçevreyezarar
vermeyecekmaddelerinkullanımınaözengösterilmelidir.Geneldeenzimlerzaten
canlısistemdenkaynaklandıklarıiçinkimyasalyöntemlereoranladahazararsız
yöntemleringeliştirilebilmesineolanaksağlarlar.
BİR ENZİMATİK ANALİZ YÖNTEMİNDEN
BEKLENEN ÖZELLİKLER