2023 05 11 Teknologi Imunokimia pada Deteksi Penyakit (2).pptx

-

1. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected Teknologi Imunikimia pada Deteksi Penyakit (2) Dewi Kartikawati Paramita, S.Si ., M.Si ., Ph.D Matakuliah IMUNOKIMIA

2. Imunokimia = T eknik imunologi Metode deteksi molekul kecil atau makromolekul pada jaringan , sel atau dalam larutan menggunakan antibodi atau antigen sebagai agen pengenal biologi Immunostaining ( contoh : imunohistokimia , imunositokimia ) Immunoassay – pemeriksaan atau pengukuran keberadaan atau konsentrasi suatu analit pada larutan menggunakan antigen atau antibodi ( contoh : ELISA, Westernblotting -immunoblotting , flowcytometry , dll )

3. Prinsip pemeriksaan pada teknik imunologi Deteksi antigen oleh antibodi Ikatan antigen- antibodi tidak Nampak  visualisasi dengan label

4. Sumber antigen Sel Jaringan Protein terlarut (protein pada plasma, serum atau cairan tubuh lain)

5. Teknik imunologi

6. Labeled immunotechnique Immunostaining Immunoassay

7. Metode dasar pada labeled immunotechnique Direct method Indirect method Label pada antibodi primer Keuntungan : Reaksi cepat Spesifik Kerugian : Perlu antibodi primer dalam jumlah banyak Label pada antibodi sekunder Keuntungan : Lebih sensitif Antibodi sekunder  dapat digunakan pada berbagai immunotechnique ( syarat : antibodi primer berasal dari spesies yang sama ) Kerugian : reaksi silang antibodi sekunder dengan Ig pada spesimen

8. Capture atau sandwich ELISA Untuk mendeteksi analit dalam jumlah yang sangat kecil Misal : sitokin Antibodi primer yang spesifik terhadap analit ditempelkan pada plate Mouse IgG1 Mouse IgG2 Anti Mouse IgG2 -Labeled

9. Faktor penting pada pemeriksaan menggunakan teknik imunologi Pengenceran / konsentrasi antibodi , suhu , waktu inkubasi Semakin tinggi konsentrasi antibodi  waktu inkubasi semakin pendek Namun konsentrasi antibodi terlalu tinggi  positif palsu Semakin tinggi suhu inkubasi  waktu inkubasi semakin pendek Enzyme & substrat , fluorochrom & filter Kontrol positif Kontrol negatif

10. Immunoassay: ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

11. Direct ELISA

12. Indirect ELISA Antibodi sekunder + label Antibodi primer Antigen

13. 03 Jan 2021 [email protected] 13 Antigen Antigen ditempelkan pada ELISA plate

14. 03 Jan 2021 [email protected] 14 Antigen Penambahan sampel serum  antibodi spesifik /primer (1 st ) mengenali dan mengikat antigen Antibodi spesifik mengenali antigen

15. 03 Jan 2021 [email protected] 15 Antigen Antibodi sekunder (2 nd )  Rabbit anti-human IgA Antibodi spesifik terhadap antigen Antibodi sekunder (2 nd ) berlabel

16. 03 Jan 2021 [email protected] 16 Meminimalkan background staining

17. Meminimalkan background staining Memblok non-specific background staining Bahan ELISA plate mempunyai afinitas tinggi terhadap protein  risiko perlekatan antibodi primer (1 st ) dari serum ke sumuran  dapat dikenali oleh antibodi sekunder (2 nd ) berlabel  positif palsu Memblok perlekatan protein ( antibodi ke sumuran ) menggunakan : susu skim, bovine serum albumin (BSA), serum normal ( non-immune serum )

18. 03 Jan 2021 [email protected] 18

19. Captured ELISA untuk deteksi antigen NS1 pada infeksi dengue

20. Indirect ELISA untuk deteksi antibodi anti-NP SARS-Cov-2

21. Western blotting - Immunoblotting

22. Western blotting – Immunoblotting (1) Antigen pada dibuat menjadi antigen terlarut Protein dipisahkan berdasarkan berat molekul dengan metode electrophoresis

23. Western blotting – Immunoblotting (2) Protein antigen ditransfer ke membran nitroselulosa Penambahan serum pasien ( diharapkan mengandung antibodi terhadap protein-protein virus HIV Deteksi ikatan antigen- antibodi primer dengan penambahan antibodi sekunder yang dilabel enzim ( enzyme-linked IgG ) Pada area dimana antibodi mengikat protein terjadi perubahan warna  pita warna hitam

24. 03 Jan 2021 [email protected] 24 Immunoblotting Blocking buffer, 37C 1 hr 3X Washing with PBS Tween Sampel serum in blocking buffer (1:100), RT 1 hr 3x washing with PBS Tween Rabbit  Human IgG-HRP in the dilution buffer (1:1000), RT 1 hr 3X washing with PBS Tween substrate/ chromogen ( Chloronaphtol ) Stop with water Antigen Antibodi primer dalam serum pasien

25. 03 Jan 2021 [email protected] 25 Immunoblotting Blocking buffer, 37C 1 hr 3X Washing with PBS Tween Sampel serum in blocking buffer (1:100), RT 1 hr 3x washing with PBS Tween Rabbit anti-Human IgG-HRP in the dilution buffer (1:1000), RT 1 hr 3X washing with PBS Tween substrate/ chromogen ( Chloronaphtol ) Stop with water Antigen Antibodi primer Antibodi sekunder + label

26. Deteksi antibodi untuk melihat pola respon antibodi pada pasien NPC v.s . orang sehat terhadap protein-protein EBV M ajor -EA(D) (47-54 kD) EA-p138 (138 K D ) EBNA1 (72 kD) TK (65 kD) DNAse (55+58 kD) ZEBRA (36+38 kD) VCA-p18 (18 kD) VCA-p40 (40 kD) Respon IgA-EBV pada orang sehat Respon IgA EBV pada pasien NPC

27. 03 Jan 2021 [email protected] 27 Immunoblotting Blocking buffer, 37C 1 hr 3X Washing with PBS Tween Sampel serum in blocking buffer (1:100), RT 1 hr 3x washing with PBS Tween Rabbit anti-Human IgG-HRP in the dilution buffer (1:1000), RT 1 hr 3X washing with PBS Tween substrate/ chromogen ( Chloronaphtol ) Stop with water Meminimalkan background staining

28. Flowcytometry ( Termasuk fluorescence-activated cell sorting (FACS))

29. Isolasi limfosit Gradient centrifugation

30. Tipe limfosit dalam kumpulan sel mononuklear

31. Prinsip dasar flowcytometry Mengukur karakteristik optic dan fluorescence dari sel tunggal atau partikel lain ( mikroorganisme , nucleus dan preparat kromosom ) dalam aliran cairan pada saat sumber cahaya melewatinya Ukuran , granularitas dan fitur fluorescence dari sel , yang berasal dari antibodi atau pewarna, merupakan contoh parameter yang digunakan untuk menganalisis dan membedakan sel.

32. Antigen pada sel dikenali antibodi spesifik yang dilabel dengan fluorochrome Sel mengalir pada kapiler , yang terlewati sinar laser, fluorochrome - nya akan dibaca oleh detektor dan dihitung , kemudian hasilnya diolah oleh perangkat lunak dalam komputer menjadi data dalam file 03 Jan 2021 [email protected] 32

33. Dua tipe flowcytometry Non-sorting Menyebarkan cahaya dan emisi fluoresensi Sorting Mampu menyortir/ menggolongkan partikel dengan baik Fluorescent activated cell sorters (FACS) adalah flowcytometer yang mampu menggolongkan sel berlabel fluoresen dari populasi sel campuran.

34. Fluorescent activated cell sorters (FACS) FACS adalah flowcytometry untuk mengelompokkan sel berdasarkan karakteristik fluorescence masing-masing sel dari populasi sel yang heterogen . Identifikasi sel  1 sel pada satu waktu Masing-masing sel akan dipisahkan ke dalam tabung yang berbeda-beda  dapat digunakan untuk eksperimen atau analisis lain

35. Hasil flowcytometry Forward-scattered light (FSC) adalah proporsi permukaan sel atau ukuran Side-scattered light (SSC) adalah proporsi cell granularity atau internal complexity

36. Hasil flowcytometry

37. Hasil flowcytometry dan strategi analisis hasil

38. LUMINEX

39. Prinsip pemeriksaan luminex Mirip dengan captured atau sandwich ELISA Sampel ditambahkan ke dalam campuran antibodi spesifik yang telah ditempeli dengan pre-coated color-coded beads untuk mendeteksi analit yang akan diperiksa Antibodi akan mengenali dan mengikat analit Antibodi spesifik analite yang diikat biotin ditambahkan (2 nd antibody )  sandwich

40. 03 Jan 2021 [email protected] 41

41. 03 Jan 2021 [email protected] 42

42. Reactivity/Species Human Suitable Sample Types cell culture supernatant, serum, plasma Sample Volume Serum, Plasma: 25 µL; CCS: 50 µL Reported Application Multiplex Immunoassay Target List sE-Selectin ; GM-CSF; ICAM-1/CD54; IFN alpha; IFN gamma; IL-1 alpha; IL-1 beta; IL-4; IL-6; IL-8; IL-10; IL-12p70; IL-13; IL-17A/CTLA-8 ; IP-10/CXCL10; MCP-1/CCL2; MIP-1alpha/CCL3; MIP-1 beta/CCL4; sP-Selectin ; TNF alpha 03 Jan 2021 [email protected] 43

43. 03 Jan 2021 [email protected] 44

44. 03 Jan 2021 [email protected] 45

45. Pertanyaan ?