372439571-6-Teknik-Standar-Dan-Kuantifikasi.pptx

teknis analalisa di laboratorium

1. Fajar Nugraha , M.S c ., Apt. Teknik Kuantifikasi Menggunakan Zat Standar

2. 2 PERHIT. KDR Setujukah Anda Dengan Teknik Perhitungan Kadar Obat Tanpa Menggunakan Standar ???

3. 3 TNK STD Teknik Kuantitasi Untuk pembuatan Kurva baku, yang akan digunakan untuk perhitungan kadar zat dalam sampel dapat digunakan berbagai macam teknik standar Teknik: Standar Eksternal Standar Internal Standar Adisi

4. 4 TNK STD Standar Eksternal

5. 5 TNK STD Standar Eksternal Senyawa yg digunakan sama dengan senyawa yg dianalisis dalam sampel Dipersiapkan dan dianalisis secara terpisah dari sampel Penggunaan standar eksternal lebih disukai pada kebanyakan sampel HPLC dan Spektrofotometri yg tidak memerlukan tahapan panjang penyiapan sampel

6. 6 TNK STD Standar Eksternal Misal Penetapan kadar Parasetamol dalam tablet, secara Spektrofotometri UV  digunakan standar baku Parasetamol Penetapan kadar Asam mefenamat dalam darah secara HPLC-UV  digunakan standar baku Asam mefenamat

7. 7 PERHIT. KDR Plot Standar Untuk Kuantitasi Dalam beberapa contoh di industri farmasi , produk obat dibuat dengan berbagai kadar , misal : Tablet Methyl Prednisolon dengan kadar : 4 mg, 8 mg, 16 mg Untuk keperluan mengembangkan dan memvalidasi metode penetapan kadarnya , dapat ditempuh tiga strategi :

8. 8 PERHIT. KDR 1. Single-Point Calibration Digunakan satu macam konsentrasi standar Plot standar yang dibuat, digunakan untuk menetapkan semua kadar tablet Hal yang perlu diperhatikan adalah: - metode ini perlu skema pengenceran dan ekstraksi yang berbeda untuk kadar obat yang bermacam-macam tersebut, dengan target: Mendapatkan konsentrasi akhir serupa yang mendekati konsentarsi standar yang dibuat [ Respon Berdekatan ]

9. PERHIT. KDR Perbandingan Absorban Syarat : Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel berdekatan 9 Chan dkk ., 2004, p.14.

10. 10 PERHIT. KDR 2. Multiple-Point Calibration Digunakan seri konsentrasi standar yang dapat mengkover semua kadar produk obat tersebut. Pada rentang konsentrasi tersebut, responnya harus linear. Respon seluruh kadar obat (larutan akhir yang akan dibaca) berada pada rentang respon kurva kalibrasi. Syarat : Tidak diperbolehkan adanya Ekstrapolasi KENAPA??

11. 11 PERHIT. KDR

12. 12 PERHIT. KDR 3. One Standard Calibration for Each Strength Digunakan satu konsentrasi standar untuk setiap kadar obat Kapan Metode ini dipilih ? Apabila analit tidak menunjukkan linearitas pada rentang konsentrasi yang layak

13. 13 PERHIT. KDR Bagaimana Menghitung Kadar Dengan perbandingan nilai absorban sampel terhadap nilai absorban baku [ yang sudah diketahui kadarnya ] Dengan menggunakan kurva baku/persamaan garis regresi linear. Apa yang harus diperhatikan ? Apa yang harus diperhatikan ?

14. 14 PERHIT. KDR Linearitas [ Menurut ICH, Q 2 (R 1 ) ] Linearitas suatu metode analisis: adalah kemampuan metode tersebut ( pada rentang tertentu ) untuk mencapai hasil uji yang berupa variasi data ( misal : absorban, luas area kromatogram) yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel Chan dkk ., 2004, p.14.

15. 15 PERHIT. KDR Linearitas ( lanjutan ) Variasi data yang digunakan untuk meng-kuantifikasi analit dapat berupa: - luas area kromatogram - tinggi puncak kromatogram - rasio antara luas area (tinggi puncak) kromatogram analit terhadap luas area (tinggi puncak) kromatogram standar internal

16. 16 PERHIT. KDR Kuatitasi Analit Tergantung pada kepatuhan pemenuhan hukum Beer Tergantung linearitas pada rentang konsen-trasi tertentu Oleh karenanya: - konsentrasi sampel kerja dan sampel yang diuji untuk akurasi harus pada rentang yang linear .

17. 17 PERHIT. KDR Linearitas Biasanya dipersiapkan langsung dengan pengenceran larutan baku stock. Disarankan linearitas dikerjakan dengan seri pengenceran larutan stock. Tidak disarankan mempersiapkan seri konsen-trasi larutan baku dengan seri penimbangan zat standar , Kenapa ? karena : Terjadi kesalahan penimbangan Tidak menjamin diperolehnya linearitas yang baik

18. 18 PERHIT. KDR Evaluasi Linearitas Paling baik dilakukan dengan pengamatan secara visual plot respon (signal) sebagai fungsi konsentrasi analit. Selanjutnya, variasi data umumnya digunakan untuk menghitung persamaan garis regresi dengan metode kuadrat terkecil ( Y = b X + a ) Syarat Linearitas : Coeffcient of determination ( r 2 ) ≥ 0.997

19. 19 PERHIT. KDR lanjutan … Linearity = Linieritas  - hasil pengukuran menggunakan suatu metode analisis yang berupa: abs, luas area, atau tinggi puncak menunjukkan proporsio-nalitas dengan kadar zat yang dianalisis Syarat: Y = bX + a Koefisien korelasi [ r ] ≥ 0,999 Kazakevich and LoBrutto , 2007, p.471-481; Ahuja and Rasmussen, 2007, p.292; Snyder dkk ., 1997, p. 691 dan Chan dkk ., 2004, p.16 .

20. 20 PERHIT. KDR Rentang Linearitas [ ICH ] Pada rentang tersebut : Paling tidak digunakan 5 (lima) macam tingkatan konsentrasi

21. 21 PERHIT. KDR Cara Menentukan Linearitas Kalibrasi [ Replikasi 3 kali ] bolehkah repeatasi?

22. 22 PERHIT. KDR

23. 23 PERHIT. KDR

24. PERHIT. KDR Kurva Baku [ 3 replikasi ] 24 Lakukan replikasi !

25. Apa perbedaan replikasi dan repeatasi ?? 25 TNK STD

26. 26 PERHIT. KDR Lakukan replikasi ! Haruskah Abs: 0,2 - 08 ? Kenapa?

27. 27 TNK STD

28. 28 TNK STD Respon Sampel  Kadar ? Respon sampel hasil pengukuran dicatat Kemudian nilai tersebut dimasukkan ke persamaan garis regresi yang merupakan: Hubungan antara kadar standar versus respon standar Kadar Sampel

29. Contoh Seorang peneliti melakukan pengukuran kadar amoxicillin dalam suatu sampel tablet secara HPLC dengan metode Standar External multiple point calibration. Luas Area kromatogram dari sampel adalah 11345. hitung kadar amoxicillin tsb ? pengukuran Standar baku amoxicillin adalah sbagai berikut. 29 TNK STD Konsentrasi standar Luas Area 5 ppm 7685 10 ppm 14567 15 ppm 21987 20 ppm 29087 25 ppm 35879

30. TNK STD Standar Internal 30

31. 31 TNK STD Standar Internal Senyawa yg digunakan berbeda dg senyawa yg dianalisis dalam sampel Harus dapat terpisah sempurna pada proses kromatografi Dapat mengkompensasi perubahan ukuran sampel atau konsentrasi akibat variasi instrumental

32. 32 TNK STD lanjutan… PENGGUNAAN STANDAR INTERNAL Utamanya Untuk Sampel Yang Memerlukan TAHAPAN PREPARASI yang cukup signifikan panjang/rumit

33. 33 TNK STD lanjutan… TAHAPA TERSEBUT MELIPUTI Reaksi derivatisasi Filtrasi Ekstraksi sebagian sampel hilang

34. 34 TNK STD lanjutan… Bila ditambahkan pada sampel sebelum mulai preparasi dapat digunakan untuk mengkoreksi sampel yang hilang selama preparasi

35. 35 TNK STD Syarat Standar Internal

36. 36 TNK STD Syarat Standar Internal Terpisah sempurna dari peak senyawa yg dianalisis dan peak lain (HPLC) Memiliki waktu retensi mirip sampel Tidak terdapat dalam sampel awal Dapat me mimic analit disetiap tahap preparasi sampel

37. 37 TNK STD lanjutan… Memiliki respon terhadap detektor serupa dengan respon analit pada konsentrasi yg digunakan Tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi dengan analit Stabil dan tidak bereaksi dg sampel atau fase gerak Tersedia komersial dg kemurnian tinggi

38. 38 TNK STD lanjutan… Ditambahkan ke dalam larutan seri kadar senyawa baku dan sampel dengan konsentrasi tetap (  kons. Sampel )

39. 39 TNK STD Calibration Methods Internal Standards 1.) Known amount of a compound, different from analyte, added to the unknown. (i) Signal from unknown analyte is compared against signal from internal standard Relative signal intensity is proportional to concentration of unknown - Valuable for samples/instruments where response varies between runs - Calibration curves only accurate under conditions curve obtained - relative response between unknown and standard are constant Widely used in chromatography Useful if sample is lost prior to analysis Area under curve proportional to concentration of unknown (x) and standard (s)

40. 40 TNK STD

41. 41 TNK STD Respon Sampel  Kadar ? Respon sampel juga dibuat rasio dengan respon standar internal [ IS ]. Kemudian nilai tersebut dimasukkan ke persamaan garis regresi yang merupakan : Hubungan antara kadar standar versus respon standar / respon IS Kadar Sampel

42. Contoh Penetapan kadar hidrokortison dalam sebuah krim dengan menggunakan baku internal betametason dengan konsentrasi standar 5 ppm. Jika respon sampel menunjukkan luas puncak hidrokortison 23564 dan luas puncak betametason 5693. maka tentukan konsentrasi hidrokortison dalam sampel! 42 TNK STD

43. 43 TNK STD

44. 44 TNK STD Standar Adisi

45. 45 TNK STD Standar Adisi Senyawa standar yg di + kan sama dengan senyawa analit dalam matriks Standar dg berat yg berbeda ditambahkan ke dalam sampel (matriks) yang jumlahnya sama Kemudian dilakukan pengukuran kadarnya Paling sering digunakan dalam trace analysis ( kons. analit < 0,1 % )

46. 46 TNK STD lanjutan… SYARAT Respon analit sebelum di spiking harus menghasilkan nilai S / N > 10

47. Standard Addition Methods

48. TNK STD 48 Calibration Methods Standard Addition 1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (i) Known quantities of an analyte are added to the unknown - known and unknown are the same analyte - increase in analytical signal is related to the total quantity of the analyte - requires a linear response to analyte (ii) Very useful for complex mixtures - compensates for matrix effect  change in analytical signal caused by anything else than the analyte of interest. (iii) Procedure: (a) place known volume of unknown sample in multiple flasks

49. TNK STD 49 Calibration Methods Standard Addition 1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Procedure: (b) add different (increasing) volume of known standard to each unknown sample (c) fill each flask to a constant, known volume

50. 50 TNK STD Method of Standard Addition adds varying amount of standard to an unknown which already contains some analyte Add same quantity of unknown sample to a series of flasks Add varying amounts of standard (made in solvent) to each flask, ex. 0,5,10,15mL) Fill each flask to line, mix and measure

51. TNK STD 51 X-intercept (y=0) yields which is used to calculate from: Calibration Methods Standard Addition 1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Procedure: (f) Plot signals as a function of the added known analyte concentration and determine the best-fit line.

52. TNK STD 52 Calibration Methods Standard Addition 1.) Protocol to Determine the Quantity of an Unknown (iii) Example: Tooth enamel consists mainly of the mineral calcium hydroxyapatite, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 . Trace elements in teeth of archaeological specimens provide anthropologists with clues about diet and disease of ancient people. Students at Hamline University measured strontium in enamel from extracted wisdom teeth by atomic absorption spectroscopy. Solutions with a constant total volume of 10.0 mL contained 0.750 mg of dissolved tooth enamel plus variable concentrations of added Sr. Find the concentration of Sr. Added Sr ( ng / mL = ppb) Signal (arbitrary units) 28.0 2.50 34.3 5.00 42.8 7.50 51.5 10.00 58.6

53. 53 TNK STD Standard Addition

54. TNK STD Terima Kasih 54