405412228-10185-PPT-PCR-pptx.pptx SSSSSSSSSSSSSSSSSS

metode PCR

1. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2. PCR merupakan suatu metode enzimatis dengan cara in vitro tanpa menggunakan organisme hidup untuk melipat gandakan suatu sekuen nukleotida tertentu secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat seperti E. coli 2 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

3. Proses PCR secara umum dibagi menjadi tiga tahap, yaitu: denaturasi , rantai DNA yang berantai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal. D ilakukan dengan menggunakan panas (95 o C) selama 1-2 menit. annealing , yaitu penempelan primer kepada untai DNA yang telah terdenaturasi. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Primer dapat melekat pada sekuen komplementernya dengan cara menurunkan suhu sampai 40 o C – 60 o C. Extension , perpanjangan primer yang menempel pada cetakan DNA dengan melibatkan DNA polymerase sebagai katalis. Tahap ini dilakukan dengan menaikkan suhu antara 70 o C – 75 o C.

4. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli dalam sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 dan 16E2 Metode : Penyiapan template DNA E. coli Penyiapan template DNA dari sample air dengan metode boiling Amplifikasi Template DNA dengan PCR Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa Deteksi Escherichia coli secara konvensiional menggunakan media pembenihan Radji , Maksum ., dkk . 2010 Dep Farmasi FMIPA UI

5. Isolat bakteri E.coli yang telah dikultur dalam medium Nutrien Broth selama 18-24 jam pada suhu 37 C disentrifuse pada suhu 20 C selama 3 menit , supernatant dibuang , pellet diambil Diekstraksi dengan klorofom dan isoamilalkohol (24:1) dan disentrifus kembali selama 2 menit . Supernatan diambil , ekstraksi kembali sebanyak 2 kali. Supernatan diambah isopropanol dingin dan disentrifuse selama 3 menit . Pellet diambil , kocok dengan etanol perlahan , sentrifuse kembali selama 2 menit , pellet diambil Dikeringkan diudara pellet DNA yang diperoleh dan direhidrasi dalam air, MilliQ (ddH 2 O) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit samai melarut sempurna Disimpan pada suhu 4 C Penyiapan template DNA Escherichia coli

6. Sampel air 200 ml disentrifuse pada suhu 4 C selama 10 menit , pellet disuspensikan dalam media Nutrien Broth inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 C, sentrifuse kembali selama 10 menit , pellet diambil Pelet diresuspensi dengan MilliQ dan sentrifuse selama 5 menit Resuspensi kembali dengan MilliQ kemudian diinkubasi selama 15 menit suhu 100 C dan segera dimasukkan ke es . Disentrifuse lagi pada suhu 4 C selama 5 menit , supernatant diambil dan diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 100 C dan segera dimasukan kedalam es . Supernatan disimpan pada suhu -20 C Penyiapan Template DNA dari Sample Air dengan metode Boiling

7. Amplifikasi Template DNA dengan PCR 1. Kedalam mikrosentrifus dimasukkan 25 µl PCR mixture yang terdiri dari : Dimasukkan ke dalam mesin PCR dan diatur tahap – tahap PCR : Denaturasi 94 C, 20 detik Primer annealing 56 C, 30 detik Primer extension 72 C, 30 detik Dilakukan sebanyak 30 siklus dan tahap terakhir adalah final extension 72 C selama 10 menit Taq DNA Polymerase Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) Primer 16E1 dan 16E2 Template DNA genomik MgCl 2 dan MIlliQ

8. The Power of PowerPoint | thepopp.com 9 Hasil amplifikasi DNA dengan PCR dicampur dengan gel loading solution dan dianalisis dengan gel elektroforesis.yang mengandung agarose dalam TAE buffer dan etidium bromida Cuplikan sampel , kontrol positif dan DNA penanda dimasukkan dalam sumur – sumur gel dan dialirkan arus listrik 50V hingga warna indikator mencapai 1 cm dari tepi bawah gel. Diamati pita – pita DNA nya menggunakan UV transilluminator . Foto gel dilakukan dengan kamera digital dalam suatu cungkup yang dihubungkan ke komputer . Dibandingkan fragmen yang terlihat dengan kontrol positif dan DNA penanda . Sampel menunjukkan positif mengandung Escherichia coli jika terdapat pita nyata pada ukuran 584 pasang basa pada elektroforesis gel. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa

9. Deteksi Escherichia coli secara Konvensional menggunakan Media Pembenihan Dilakukan pengenceran bertingkat sampel 10 -1 , 10 -2 dan 10 -3 dan dimasukkan masing – masing kedalam media yang berisi Lactose Broth yang didalamnya teradapat tabung durham terbalik . Diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 – 48 jam. Setelah 24 jam, Diamati pembentukan gas dalam tabung durham . Jika belum terbentuk gas maka diinkubasi lagi selama 24 jam. Sebanyak 1 ose dari tiap tabung yang membentuk gas pada media dipndahkan ke dalam tabung yang berisi 10 ml media Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB) yang didalamnya terdapat tabung durham terbalik . Escherichia coli dianggap positif jika di dalam tabung durham terdapat gas. Kemudian dilakukan pengujian konfirmasi bakteri . Uji konfirmasi dilakukan secara biokimia dengan menginokulasikan biakan dalam BGLB positif kedalam media selektfi yaitu media Eosin Methylene Blue (EMB) dan beberapa reaksi fermentasi yaitu uji indol , methyl red, voges proskauer dan uji sitrat .

10. Hasil dan Pembahasan Hasil

11. Pembahasan Pada pengujian control positif E. coli dengan proses yang sama ternyata dihasilkan pita pada ukuran sekitar 584 pasang basa sehingga sampel yang tidak menunjukkan pita DNA pada ukuran tersebut berarti tidak mengandung E. coli ( Gambar 1). Berdasarkan penelitian terdahulu , spesifisitas primer 16E1 dan 16E2 sangat baik dimana primer ini dapat mendeteksi seluruh strain E. coli baik yang patogen maupun yang non- patogen dan tidak dapat mendeteksi bakteri non E. coli, antara lain Citrobacter freundii , Enterobacter aerogenes , Klebsiella . Penyiapan template DNA sampel yang digunakan untuk diamplifikasi dengan PCR, ekstraksinya dilakukan dengan cara boiling method karena pada dasarnya, metode boiling ini mempercepat lisis dinding sel bakteri sehingga DNA dapat diekstraksi sekaligus mempermudah proses denaturasi rantai DNA ketika dilakukan amplifikasi dengan cara PCR. Visualisasi DNA pada elektroforesis lebih mudah dilakukan menggunakan pewarna yang dapat berfluoresensi yaitu etidium bromida yang terkonsentrasi dalam fragmen DNA dan berfluoresensi pada cahaya UV merupakan molekul planar yang dapat menyisip di antara ikatan basa DNA. Pada penelitian ini sampel yang menunjukkan hasil positif mengandung E. coli dengan metode PCR ternyata juga menunjukkan hasil positif bila diidentifikasi dengan metode konvensional ( Tabel 1). Pada metode konvensional memerlukan waktu 6 hari, sedangkan dengan metode PCR hanya memerlukan waktu 48 jam. Hal ini disebabkan karena metode PCR langsung dapat mendeteksi adanya E. coli dalam sampel tanpa h arus mengisolasi koloni bakteri terlebih dahulu .

12. Kesimpulan :

13. TERIMA KASIH The Power of PowerPoint | thepopp.com 14