Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA

Aula de Clonagem, Vetores e bibliotecas de DNA

1. CLONAGEM
PROFª DRª PRISCILA L. MELLO
ELABORADO POR: PROFª DRªMARTA F. BASTOS

2. CLONAGEM
•OriginadadapalavragregaKólon,quedesignaformadereprodução
assexuada,ouseja,geraçãodeindivíduosidênticosaodoadordoDNA;
•Ocorrenaturalmenteemorganismosunicelulareseplantas;
•Atualmenteotermoclonageméutilizadomaisparaaproduçãode
organismosidênticosderivadosdeumancestralcomum.

3. TIPOS DE CLONAGEM
Reprodutiva
-Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez
com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997.
-A célula de um indivíduo adulto é
fundida com um óvulo sem núcleo, de
forma que o "embrião" gerado possui
o conteúdo genético da pessoa que
doou a célula.

4. Clonagem Reprodutiva

5. Clonagem Reprodutiva

6. Tipos de Clonagem
Terapêutica
-Aprimoramento das técnicas hoje existentes para
culturas de tecidos, que são realizadas há décadas.
-É feita a transferência do núcleo de uma célula de
uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se
gera, em laboratório, células potencialmente capazes de
produzir qualquer tecido.

7. Clonagem Terapêutica

8. Terapêutica x Reprodutiva

9. •ClonagemMolecular
-ÉoprocessodeconstruçãodemoléculasdeDNArecombinante
edasuapropagaçãoemhospedeirosapropriadosquepossibilitama
seleçãodoDNArecombinante.
-Sinônimos:EngenhariaGenética,Manipulaçãogênica,
Clonagemgênica,TecnologiadoDNArecombinante,Modificação
genéticaeNovagenética
Tipos de Clonagem

10. CLONAGEM MOLECULAR
Estudos genômicos
Estudos de expressão de mRNAs
Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)
Vacinas de DNA
Produção de organismo transgênicos
Terapia Gênica
Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína
Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas

11. CLONAGEM MOLECULAR
OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA.
-Inserção de fragmentos de DNA em vetores;
-Replicação de vetorescontendo o inserto dentro de células hospedeiras
-Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.

12. CLONAGEM MOLECULAR
Vetores:veículosdeclonagemquepermitemqueosfragmentosde
DNAaseremclonados,sejamintroduzidosepropagadosemuma
célulahospedeiraadequada.
Célulahospedeira:célulasdefácilmanipulação,crescimentorápido
econstituiçãogenéticabemconhecida(ex:bactérias,leveduras,
célulasdeculturadetecidosdemamíferoseinsetos).

14. VETORES
MOLECULARES

15. VETORES MOLECULARES
SãomoléculasdeDNAduplafita,circular,auto-replicativasequesão
passadosdegeraçãoparageração;
Características
-Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira
independente
-Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de
restrição
-Gene marcador(AmpR)

16. VETORES MOLECULARES

17. VETORES MOLECULARES-TIPOS
•Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do
experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem
podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes.
-Plasmídeos –clonagem de até 15.000 pb
-Fagos -clonagem de até 23.000 pb

18. Vetores Moleculares
Clonagem Expressão
Permite a multiplicar
as moléculas de DNA
de interesse.

19. Vetores de Clonagem (plasmídios)

20. -Permite expressar uma
proteína
-Indução da expressão
-Proteína pode ser purificada
Vetores Moleculares
Clonagem Expressão

21. Proteínas recombinantes-Aplicações

22. CLONAGEM

23. Clonagem Molecular

24. •DNA ligase: Ligar fragmentos de DNA recombinantes
Clonagem Molecular

25. DNA Ligase

26. CLONAGEM MOLECULAR

27. FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO
DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS)
•Transformação bacteriana
•Transfecção (transformação em células eucariontes)
•Eletroporação (choque)
•Microinjeção
•Infecção viral

30. CaCl
2: íons Ca²
+
neutraliza carga –
dos fosfolípideos da membrana
e do DNA recombinante
Choque térmico:mudança brusca de temperatura
atraem a molécula de DNA recombinante
para dentro da célula hospedeira
Transformação

31. Meiodeculturaenriquecidoe
incubaçãoa37ºCpara
promoverrecuperaçãodas
célulashospedeira
Seleção das bactérias
transformadasporcultivoem
meiodeculturacontendo
ampicilina.
Transformação

32. Seleção dos clones

33. BIBLIOTECAS
MOLECULARES

34. BIBLIOTECAS MOLECULARES
•Conjunto de todos os genes de uma
determinada espécie armazenados
na forma de moléculas de DNA
recombinante.

35. BIBLIOTECAS MOLECULARES
Bibliotecas Genômicas
-Formadas a partir de DNA genômico
-DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou
enzimaticamenteem pedaços menores
-Clonados em fagos e plasmídios.

36. BIBLIOTECAS GENÔMICAS

37. Bibliotecas Moleculares
Bibliotecas cDNA (DNA complementar)
-Representa o conteúdo de mRNA de uma
célula/tecido-Transcriptoma
-Clonagem apenas das mensagens dos genes.
-É mais seletiva
-Isolamento de genes específicos

38. Bibliotecas de cDNA
•Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA
-Transcriptase reversa
Extração de
RNA total

39. Bibliotecas de cDNA
RNA total
Purificação do
mRNA

40. DNA Genômico x cDNA