Cósmidos clonación vectorial

Ingeniería genética, Clonación vectorial, Cósmidos
Conocimientos clave: Plásmido, fago.

1. Cósmidos José David Navarro Jiménez; Iván Kerguelén; Mario Chadid Medicina Universidad de Sucre 2014

2. Introducción

3. Conceptos El término DNA recombinante hace referencia a segmentos o moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas. La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus .

4. Procedimientos La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:

5. Procedimientos 1- Las endonucleasas de restricción, cortan el DNA por s ecuencias nucleotídicas específicas . 2- Los fragmentos productos de las enzimas de restricción se unen a DNA vectorial . Los vectores pueden replicarse autónomamente en la célula huésped y facilitan la manipulación 3. La molécula de DNA recombinante, se transfiere a una célula huésped . 4- Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante clones. 5-Los segmentos de DNA clonados se recuperarse, purifican y analizan.

6. Fabricación de DNA recombinante El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigación , ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que codifican genes específicos , y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión génicas . Procedimiento

7. Fabricación de DNA recombinante Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica , que está suministrando un número creciente de productos al mercado . Procedimiento

8. Fabricación de DNA recombinante La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de restricción . Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia. Procedimiento Enzimas de restricción

9. Fabricación de DNA recombinante El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber , Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes . Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor Procedimiento Enzimas de restricción

10. Fabricación de DNA recombinante Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico . La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli ; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae . Hay dos tipos de enzimas de restricción: Procedimiento Enzimas de restricción

11. Fabricación de DNA recombinante • Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción . No se utilizan normalmente en la i nvestigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso. Procedimiento Enzimas de restricción

12. Fabricación de DNA recombinante Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida . Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' Ö 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'. Procedimiento Enzimas de restricción

13. Fabricación de DNA recombinante Procedimiento Enzimas de restricción

14. Fabricación de DNA recombinante Procedimiento Enzimas de restricción

15. Fabricación de DNA recombinante Otras tipo dos Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos. En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poli- dA y de poli- dT . Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa . Procedimiento Enzimas de restricción

16. Fabricación de DNA recombinante Otras tipo dos Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos. En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poli- dA y de poli- dT . Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa . Procedimiento Enzimas de restricción

17. Fabricación de DNA recombinante Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse . Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras . Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características: Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores : - los plásmidos - los bacteriófagos - los cósmidos Procedimiento Vectores

18. Fabricación de DNA recombinante Características 1 . Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta. 2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricció n, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene ) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen. 4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar. Procedimiento Vectores

19. Fabricación de DNA recombinante • Plásmidos. Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori +). Se replican autónomamente en las células bacterianas . - Para poder utilizarlos en ingeniería genética , se han modificado o diseñado plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibiótico s específicos. Procedimiento Vectores

20. Fabricación de DNA recombinante • Plásmidos. Procedimiento Vectores

21. Fabricación de DNA recombinante Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13 Se extrae el DNA de una preparación de fago lambda y se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restricción. El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las proteínas del fago para formar un virus recombinante . - Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA. Procedimiento Vectores

22. Fabricación de DNA recombinante Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13 Procedimiento Vectores

23. Fabricación de DNA recombinante Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13 Procedimiento Vectores

24. Cósmidos

25. Descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978. Son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Contienen la secuencia “ cos ” del fago lambda. Secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos. Cósmidos

26. Su DNA, que contiene DNA insertado, se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas . Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un plásmido. Los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Cósmidos Características

27. Características Cósmidos: 37-52 kb de ADN. Vectores fágicos: 15 kb. Plásmidos: 1- 10kb (limitados). Cósmidos

28. Características Cósmidos Sitios de restricción para la clonación

29. Características Cósmidos Sitios de restricción para la clonación

30. Características Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen de replicación adecuados . Generalmente contienen marcadores genéticos que permiten su selección en los dos sistemas huésped. SV40 ori en células de mamífero . ColE1 ori para la replicación del ADN de doble cadena. f1 ori para la replicación de ADN de cadena sencilla en procariotas. Cósmidos

31. Cósmidos

32. Pasos en la clonación usando cósmidos como vectores

33. Aplicación

34. C lonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

35. C lonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

36. OBJETIVOS: Determinar la capacidad de nueve cepas de E. coli enteropatógenas. Aislar y caracterizar los genes involucrados. C lonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

37. C lonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

38. C lonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

39. Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

40. Las nueve cepas de E. coli crecen en medios de M9Scr0.2% y producen colonias rojas en MackScr0.2%. Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena Resultados y Discusión

41. Las nueve cepas utilizadas son capaces de crecer en presencia de sacarosa pero su capacidad de emplear esta azúcar es diferente. La utilización de un procedimiento de selección positiva nos permitió aislar los genes involucrados en el catabolismo de esta azúcar. Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. c oli enteropatogena Conclusiones

42. Gracias

43. “Si el amor es el que guía tu vida, realizarás grandes empresas” San Agustín

44. Características de un vector ¿Qué es un cósmido? Diferencias entre cósmido, plásmido y bacteriófago