Chuẩn bị và hoạt động sinh học của các dẫn xuất 6-benzylaminopurine trong thực vật và tế bào ung thư của con người

Bài báo nghiên cứu các dẫn xuất của 6-benzylaminopurine (BAP) – một loại cytokinin quan trọng trong sự phát triển thực vật, đồng thời kiểm tra khả năng ức chế kinase CDK và chống ung thư.

Nội dung chính:
- Tổng hợp 38 dẫn xuất BAP bằng cách thay đổi nhóm thế trên nhân benzyl, sau đó phân tích cấu trúc bằng MS, NMR, TLC.
- Thử nghiệm hoạt tính cytokinin trên thực vật qua ba phương pháp:
1. Kích thích mô sẹo thuốc lá.
2. Làm chậm quá trình già hóa lá lúa mì.
3. Kích thích tổng hợp betacyanin trong Amaranthus.
→ Nhiều dẫn xuất có hoạt tính cao, đặc biệt trong thử nghiệm giữ diệp lục.

- Đánh giá tác động trên tế bào ung thư:
- Kiểm tra khả năng ức chế kinase CDK2/cyclin E, một enzyme quan trọng trong chu kỳ tế bào.
- Một số dẫn xuất BAP có hoạt tính ức chế CDK mạnh hơn BAP gốc.
- Một số hợp chất có độc tính cao trên các dòng tế bào ung thư (CEM, HL-60, K-562, G-361, HOS, MCF-7, B16) nhưng ít ảnh hưởng đến tế bào bình thường NIH-3T3.

- Mối tương quan giữa tác động trên thực vật và tế bào ung thư được kiểm tra thông qua thử nghiệm ức chế kinase ở người và thực vật.
- Một số hợp chất cho thấy tiềm năng tác động chọn lọc lên các quá trình sinh học khác nhau.

1. CHUẨN BỊ VÀ HOẠT ĐỘNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 6-
BENZYLAMINOPURINE TRONG TH ỰC VẬT VÀ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA
CON NGƯỜI
Karel Dolezˇal,
a,*
Igor Popa,
a
Vladimı´r Krysˇtof,
a
Luka´sˇ Spı´chal,
a,b
Martina
Fojtı´kova´,
a
Jan Holub,
a
Rene´ Lenobel,
a
Thomas Schmu¨lling
b
and Miroslav Strnad
a

a
Laboratory of Growth Regulators, Palacky University and Institute of Experimental Botany AS
CR, Sˇ lechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic
b
Free University of Berlin, Institute of Biology/Applied Genetics, Albrecht-Thaer-Weg 6, D-14195
Berlin, Germany Received 18 February 2005; accepted 6 September 2005 Available online 7 October
2005


Tóm tắt
Để nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của cytokinin thơm, hoạt động của
cytokinin ở cả cấp độ thụ thể và tế bào, cũng như các đặc tính ức chế CDK và chống ung
thư của 38 dẫn xuất 6-benzylaminopurine (BAP) đã được so sánh trong nhiều xét nghiệm
in vitro khác nhau. Các hợp chất được điều chế bằng cách ngưng tụ 6-chloropurine với các
benzylamine thay thế tương ứng. Phần lớn các dẫn xuất tổng hợp đều thể hiện hoạt động
cao trong cả ba xét nghiệm sinh học cytokinin được sử dụng (mô sẹo thuốc lá, lão hóa lúa
mì và xét nghiệm sinh học Amaranthus). Hoạt động cao nhất thu được trong xét nghiệm
lão hóa. Đối với một số hợp chất được thử nghiệm, sự khác biệt đáng kể về hoạt động đã
được tìm thấy trong các xét nghiệm sinh học được sử dụng, chỉ ra rằng các hệ thống nhận
dạng khác nhau có thể hoạt động và gợi ý rằng có thể điều chỉnh các quá trình phụ thuộc
vào cytokinin cụ thể bằng các hợp chất cụ thể. Các hiệu ứng lập thể và kỵ nước theo vị trí
cụ thể của các chất thay thế vòng phenyl khác nhau đối với sự thay đổi của hoạt động sinh
học đã được xác nhận. Ngược lại với hoạt động cao của chúng trong các xét nghiệm sinh
học, các dẫn xuất BAP được nhận biết với độ nhạy thấp hơn nhiều so với trans-zeatin trong
cả xét nghiệm thụ thể AHK3 và AHK4 của Arabidopsis thaliana. Các hợp chất cũng được
nghiên cứu về tác dụng của chúng đối với kinase phụ thuộc cyclin 2 (CDK2) và các đặc

2. tính chống tăng sinh trên các dòng tế bào ung thư và bình thường. Một số hợp chất được
thử nghiệm cho thấy hoạt động ức chế và độc tính mạnh hơn BAP. Cũng có một mối tương
quan tích cực đáng kể giữa các tác dụng ức chế đối với CDK của người và thực vật với sự
tăng sinh tế bào ung thư và tế bào thuốc lá phụ thuộc cytokinin. Điều này cho thấy rằng ít
nhất một phần tác dụng chống tăng sinh của các cytokinin mới là do ức chế hoạt động của
CDK.
2005 Elsevier Ltd. Bảo lưu mọi quyền.
1. Giới thiệu
6-Benzylaminopurine (BAP) và các dẫn xuất của nó là các chất thúc đẩy tăng trưởng
thực vật hoạt động và dễ dàng có được. Chúng từ lâu đã được cho là các hợp chất tổng hợp
hoàn toàn. Tuy nhiên, một số trong số chúng cũng đã được phát hiện và xác định trong các
mô thực vật khác nhau (để biết chi tiết, hãy xem
1
).
BAP cũng là một trong những cytokinin hiệu quả và giá cả phải chăng nhất được sử
dụng trong nhiều hệ thống vi nhân giống. Tuy nhiên, nó có những nhược điểm ở một số
cây trồng, bao gồm các vấn đề thích nghi, tính không đồng nhất trong quá trình tăng trưởng
và ức chế ra rễ.
2
Một cách để loại bỏ tác dụng phụ hiệu ứng có thể dựa trên sự phát triển
và kiểm tra các dẫn xuất BAP không biểu hiện tác dụng phụ không mong muốn. Ví dụ,
hoạt tính sinh học cao của 6-(3-hydroxybenzylamino)purine (meta-topolin, mT) trong các
xét nghiệm sinh học khác nhau đã được một số tác giả mô tả,
3,4
Hiệu ứng tích cực của mT
so với BAP sau đó đã được chứng minh trong quá trình sản xuất chồi và rễ trong ống
nghiệm và ra rễ sau ống nghiệm của Spathiphyllum floribundum. Cây trồng trên môi trường
chứa 10 lM mT ra rễ tốt hơn trong quá trình thích nghi so với cây được phát triển trên nồng
độ BAP bằng mol. Thực tế này có thể được giải thích bằng sự khác biệt trong quá trình
chuyển hóa của BAP và mT.
2
Ngoài ra, người ta đã chỉ ra rằng sự xuất hiện nội sinh của
các chất tương tự BAP hydroxyl hóa trong quả Zantedeschia aethiopica có tương quan với
quá trình tự ức chế quá trình lão hóa của quả.
5
Mục đích của nghiên cứu này là chuẩn bị
một họ lớn các dẫn xuất BAP khác, được thay thế trên vòng phenyl và so sánh hoạt tính
cytokinin của các hợp chất đã chuẩn bị trong ba xét nghiệm sinh học khác nhau, dựa trên
sự kích thích tăng trưởng mô sẹo thuốc lá, sự giữ lại diệp lục trong lá lúa mì đã cắt bỏ và

3. sự cảm ứng tối của quá trình tổng hợp betacyanin trong lá mầm Amaranthus. Các dẫn xuất
cytokinin mới cũng đã được sàng lọc về khả năng được nhận biết bởi các protein thụ thể
cytokinin mới được phát hiện là AHK3 và AHK4.
6–8

Mặc dù cytokinin điều chỉnh nhiều quá trình tế bào, việc kiểm soát phân chia tế bào
là rất quan trọng và được coi là chẩn đoán cho nhóm phytohormone này; do đó, tên chung
là cytokinin.
9
Cytokinin tham gia vào việc điều chỉnh cả quá trình chuyển đổi G1/S và
G2/M của chu kỳ tế bào. Chúng nâng cao biểu hiện của gen CYCD3, mã hóa cho cyclin
loại D.
10,11
Trong tế bào động vật, D-cyclin được điều chỉnh bởi nhiều yếu tố tăng trưởng
khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình đi qua điểm hạn chế
chu kỳ tế bào ở G1. Người ta cũng đã chỉ ra rằng biểu hiện cấu thành của CYCD3 có thể
bỏ qua yêu cầu về cytokinin đối với sự tăng sinh tế bào, do đó gây ra sự tăng trưởng độc
lập với cytokinin của Arabidopsis thaliana calli.
10

Cytokinin cũng quan trọng đối với việc điều chỉnh quá trình chuyển đổi G2/M. Trong
tế bào BY-2 của thuốc lá, là tế bào tự chủ cytokinin, các cytokinin zeatin nội sinh đạt đỉnh
xung quanh pha S và pha M.
12
Việc sử dụng lovastatin, một chất ức chế tổng hợp axit
mevalonic, ức chế sự tích tụ cytokinin và nguyên phân tương ứng. Trans-zeatin (tZ) được
sử dụng sẽ ghi đè lên sự chặn lovastatin. Điều này chỉ ra rằng tZ là không thể thiếu đối với
quá trình chuyển đổi G2/M.
13
Việc điều chỉnh quá trình chuyển đổi G2/M được trung gian
bởi các kinase phụ thuộc vào cyclin hoạt hóa (CDK). Trong mô rễ đậu, mRNA của CDK
nguyên phân được tạo ra trong vòng 10 phút bằng cách sử dụng auxin. Người ta cũng tìm
thấy nồng độ cao của protein giống CDC2 không hoạt động trong lõi thuốc lá được nuôi
cấy trên môi trường auxin.
14
Tác dụng của cytokinin có liên quan đến việc kích hoạt
phosphatase giống Cdc25 có tác dụng khử phosphoryl hóa đồng đẳng thực vật của CDK1
trên các gốc Thr 14/Tyr15.
15
Quá trình này cung cấp một trong những mối liên hệ tiềm
năng giữa tác dụng của cytokinin và auxin đối với việc điều hòa chu kỳ tế bào.

Gần đây, một đặc tính quan trọng khác của các chất tương tự cytokinin đã được chứng
minh. Các cytokinin isoprenoid và thơm tự nhiên được phát hiện có khả năng ức chế một
số protein kinase của con người theo cách không đặc hiệu, bao gồm cả CDK. Mặt khác,

4. việc sàng lọc các chất tương tự cytokinin tổng hợp hóa học đã phát hiện ra chất ức chế
CDK chọn lọc olomoucine, tức là dẫn xuất BAP 6-benzylamino-2-(2-hydroxyethylamino)-
9-methylpurine. Những sửa đổi nhỏ của phân tử BAP dẫn đến sự ức chế đặc hiệu của một
số protein kinase quan trọng như CDK1/cyclin B, CDK2/cyclin A, CDK2/cyclin E,
CDK5/p35 não và ERK1/MAP kinase.
16
Do các hợp chất này có đặc tính chống ung thư
mạnh (olomoucine, roscovitine, v.v.),
17,18
các chất tương tự BAP mới được chuẩn bị cũng
đã được thử nghiệm trong xét nghiệm ức chế kinase CDK2/cyclin E trong ống nghiệm và
cũng về hoạt tính gây độc tế bào có thể có của chúng đối với các dòng tế bào ung thư đã
chọn và nguyên bào sợi chuột bình thường (NIH/3T3). Trong báo cáo này, chúng tôi cũng
đang cố gắng, lần đầu tiên, để liên hệ các mối quan hệ giữa chế độ hoạt động phân tử với
các hiệu ứng tế bào thích hợp.
2. Kết quả và thảo luận
2.1. Tổng hợp
Ba mươi tám chất tương tự của BAP với các chất thế khác nhau gắn vào vòng phenyl
đã được tổng hợp (Bảng 1) để xác định mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của chúng. Các
hợp chất đã chuẩn bị được đặc trưng bằng phân tích nguyên tố, TLC, điểm nóng chảy, ES
+ MS (Bảng 2) cũng như
1
H và
13
C NMR (Dữ liệu bổ sung). Các tổng hợp BAP đã công
bố trước đây, được thế đơn trên vòng benzyl bằng CH3, NH2, NO2, OH, CH3O và Cl, đã
đạt được bằng cách ngưng tụ 6-(methylmercapto)purine với 2–3 đương lượng phân tử của
các amin tương ứng.
20
Tuy nhiên, phương pháp này thường cho năng suất thấp hơn so với
kết quả của chúng tôi, đạt được khi sử dụng 6-chloropurine. Điểm nóng chảy, được báo
cáo cho các hợp chất được chuẩn bị bằng phương pháp trước đó, cũng thấp hơn một chút.
Việc chuẩn bị một số dẫn xuất BAP, được thay thế bằng một nguyên tử halogen đơn trên
vòng phenyl, sử dụng 6-(methylmercapto)purine đã được các tác giả khác báo cáo trước
đây.
28,29
Tuy nhiên, không có dữ liệu lý hóa nào để xác nhận danh tính và độ tinh khiết của
các hợp chất đã chuẩn bị trong các báo cáo này. Hơn nữa, vì các xét nghiệm khác nhau
được sử dụng để đánh giá hoạt động sinh học của chúng, nên rất khó để so sánh các kết
quả

6. 2.2. Hoạt động của cytokinin trong các xét nghiệm sinh học
Tác động của các chất thay thế được đưa vào đối với BAP đã được nghiên cứu trong
ba xét nghiệm sinh học cytokinin, dựa trên sự kích thích các quá trình sinh lý khác nhau ở
thực vật (Bảng 3). Để so sánh, bản thân BAP, một cytokinin có hoạt tính cao và được sử
dụng rộng rãi trong thực tế, đã được sử dụng làm hợp chất chuẩn. Các dẫn xuất 1 và 2 chứa
một nguyên tử flo ở vị trí ortho và/hoặc meta của vòng phenyl đã làm tăng hoạt động của
BAP trong xét nghiệm sinh học Amaranthus lần lượt là 16% và 40%. Trong số các dẫn
xuất BAP được thay thế một lần, bất kỳ chất thay thế nào ở vị trí para (các hợp chất 3, 6,
9, 13, 16 và 18) đều làm giảm hoạt động đáng kể trong xét nghiệm sinh học này. Ngược
lại, tất cả các dẫn xuất di- và trifluoro đã thử nghiệm 27–31 đều được phát hiện là rất hoạt

7. động (trong cả ba xét nghiệm sinh học), ngay cả những xét nghiệm có chứa chất thay thế
ở vị trí para (27, 29 và 31). Tuy nhiên, các dẫn xuất hydroxy/methoxy thay thế di và tri
(21–26 và 33–37) được phát hiện là không hoạt động trong xét nghiệm này. Một mô hình
hoạt động tương đối tương tự cũng thu được trong xét nghiệm sinh học mô sẹo, ngoại trừ
hoạt động cao của 3.
Ngược lại, xét nghiệm sinh học lão hóa cho thấy các phản ứng khác với phản ứng của
hai xét nghiệm sinh học khác. Như chúng tôi đã báo cáo trước đây đối với các dẫn xuất 2-
và 3- methoxy nội sinh của BAP,
19
hoạt động của chúng tương đương hoặc thấp hơn một
chút trong xét nghiệm sinh học mô sẹo Amaranthus và thuốc lá, nhưng gấp đôi BAP trong
xét nghiệm lão hóa. Điều này chỉ ra rằng các hợp chất này có thể ảnh hưởng ưu tiên đến
các quá trình sinh lý liên quan đến tác động của các yếu tố căng thẳng khác nhau lên bộ
máy quang hợp. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi thấy xu hướng này ít nhiều mang tính
phổ biến trong số các cytokinin thơm (Bảng 3). Hơn nữa, 6-(2,3-
dimethoxybenzylamino)purine (21), một hợp chất không hoạt động trong hai xét nghiệm
sinh học khác, vẫn có thể vượt quá hoạt động của BAP trong xét nghiệm sinh học lão hóa.
Sự khác biệt lớn về hoạt động của cùng một hợp chất cytokinin (ví dụ: 3, 18 và 21) trong
các xét nghiệm sinh học khác nhau chỉ ra rằng có thể thiết kế các hợp chất cụ thể có thể
được sử dụng để điều chỉnh các quá trình phụ thuộc vào cytokinin theo cách có mục tiêu.
Điều này cũng có thể chỉ ra rằng một thụ thể và/hoặc hệ thống tín hiệu khác có liên quan
đến việc trung gian ảnh hưởng của cytokinin đối với quá trình lão hóa hơn là trung gian
ảnh hưởng của chúng đối với sự phát triển và phân chia tế bào.

8. Ba histidine kinase cảm biến nằm trên màng của A. thaliana gần đây đã được xác
định có chức năng như các thụ thể cytokinin. Protein AHK4 (giống hệt với CRE1 và
WOL)
6–8
đã được chứng minh là liên kết trực tiếp với cytokinin
8,23
và hai đồng đẳng của
nó, AHK2 và AHK3, cũng đã được phát hiện là các thụ thể liên kết cytokinin.
23,31
Chúng
tôi đã sử dụng các chủng Escherichia coli DrcsC biểu hiện AHK4 và AHK3
7,23
để nghiên
cứu độ nhạy tương đối của các thụ thể này đối với các hợp chất đã chuẩn bị. Hệ thống này
trước đây đã được sử dụng thành công để nghiên cứu một cách có hệ thống các hoạt động
tương đối của các chất chuyển hóa cytokinin tự nhiên.
24
Tuy nhiên, trái ngược với kết quả
xét nghiệm sinh học của chúng tôi, chỉ một số ít dẫn xuất BAP được thử nghiệm có thể
kích hoạt AHK4 một cách đáng kể (cụ thể là 2, 3 và 15), mặc dù độ nhạy thấp hơn nhiều
(dưới 10%), khi so sánh với trans-zeatin (Hình 1). Hầu hết các hợp chất đã chuẩn bị đều
được thụ thể AHK3 nhận biết (1–5, 14, 17, 20, 27 và 29), nhưng cũng chỉ có độ nhạy thấp,

9. từ 10% đến 32% hoạt động trans-zeatin (Hình 1). Sự khác biệt về hoạt động trong các xét
nghiệm sinh học và xét nghiệm thụ thể có thể chỉ ra rằng AHK2. thụ thể cytokinin không
được thử nghiệm trong nghiên cứu này, ưu tiên nhận biết các dẫn xuất BAP hoặc một hệ
thống nhận dạng khác, cũng có thể tương tác với các dẫn xuất BAP, tồn tại trong thực vật

2.3. Thử nghiệm kháng khối u và kinase
Chúng tôi cũng đã thử nghiệm các hợp chất đã chuẩn bị về hoạt tính kháng khối u
của chúng đối với các dòng tế bào có nguồn gốc từ bệnh bạch cầu lymphoblastic T ở người
(CEM), bệnh bạch cầu tiền tủy bào (HL-60), u ác tính ở người (G-361), bệnh bạch cầu tủy
mãn tính ở người (K-562), u xương ác tính ở người (HOS), ung thư vú (MCF-7) và u ác
tính ở chuột (B16). Độc tính tế bào của các hợp chất được chọn đối với NIH-3T3 (nguyên
bào sợi chuột bình thường) cũng đã được kiểm tra. Dữ liệu thu được từ thử nghiệm khả
năng sống/độc tính tế bào của calcein AM được trình bày trong Bảng 4. Các giá trị IC50
thu được cho thấy các đặc tính độc tế bào thú vị của hợp chất 34 (IC50 = 26,6 lmol/l đối
với MCF-7), trái ngược với các dẫn xuất rất giống khác (ví dụ: hợp chất 35 và 36), không
biểu hiện hoạt động nào trong thử nghiệm này. Độc tính tế bào yếu của một số halogen-,
methyl- và methoxy-BAP thay thế đơn khác (1, 3, 4, 13, 15 và 16) cũng đã được xác nhận
(Bảng 4). Các đặc tính độc tế bào cũng như hoạt động cytokinin của các riboside liên quan
sẽ được mô tả ở nơi khác (Dolezˇal et al., bản thảo đang chuẩn bị).
Khả năng ức chế tăng trưởng của một số cytokinin nổi tiếng cũng như riboside của
chúng trên các tế bào HL-60 đã được báo cáo trước đây.
32–36
Riboside đã được chứng minh
là chất gây apoptosis mạnh. Ngược lại, các bazơ tự do cytokinin đã gây ra hiệu quả sự biệt
hóa và chuyển đổi tế bào HL-60 thành các hạt bạch cầu trưởng thành.
Người ta cũng biết rằng cytokinin tự nhiên là chất ức chế yếu và không đặc hiệu của
nhiều loại protein kinase.
16
Tuy nhiên, việc sàng lọc có hệ thống các dẫn xuất purin có
nguồn gốc từ cytokinin đã dẫn đến việc phát hiện ra các purin thay thế 2,6,9 và phát hiện
ra một số lượng lớn các chất ức chế CDK có hoạt tính cao như olomoucine và
roscovitine.
16,17
Để xác minh các đặc tính chống ung thư của các chất tương tự BAP, chúng
đã được sàng lọc về khả năng ức chế CDK2 tái tổ hợp của con người (tóm tắt trong Bảng

10. 5). Kết quả cho thấy việc gắn một nhóm halogen (hợp chất 1–10), methyl (11 và 13) hoặc
methoxy (14–16) vào bất kỳ vị trí nào của vòng benzyl đều dẫn đến hoạt động ức chế tăng
khoảng 2 lần so với BAP. Tuy nhiên, các dẫn xuất nitro (17 và 18) kém hiệu quả hơn. Một
số hoạt động ức chế bị mất cũng được quan sát thấy sau khi đưa nhiều hơn một nhóm thế
hydroxy và/hoặc methoxy vào nhóm benzyl (21, hầu như không hoạt động hoàn toàn 23
và 26). Mặt khác, các dẫn xuất difluoro, trifluoro và clo tương ứng (27–32) vẫn dẫn đến
hoạt động tăng nhẹ. Một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy rằng các chất thay thế khác
nhau trên vòng benzyl (Cl và OCH3) có thể tăng cường thêm khả năng của purin trong việc
ngăn chặn hoạt động của CDK1.
37,38
Mặc dù không có purin thay thế 6 nào được thử
nghiệm ở đây được phát hiện là chất ức chế CDK2/cyclin E rất mạnh, chúng tôi cho rằng
kết quả của chúng tôi cũng có thể hữu ích cho việc thiết kế và tổng hợp trong tương lai của
lớp chất ức chế dựa trên purin thay thế ba liên quan thành công tiếp theo.
Trong một thí nghiệm dài hạn, việc xử lý mô sẹo thuốc lá bằng cytokinin kích thích
tốc độ phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin tối ưu cho sự tăng sinh tế bào thường là 10
-9

đến 10
-5
M. Ở nồng độ cao hơn (trên 10
-5
M), cytokinin trở nên kém hiệu quả hơn; trên
khoảng 10
-4
M, chúng trở nên ức chế. Điều này được thể hiện trong Hình 2, trong đó đường
cong tăng trưởng giảm xuống dưới đường đứt nét, biểu thị sự tăng trưởng khi không có
cytokinin ngoại sinh. Mặc dù điều này đúng với nhiều hợp chất được thử nghiệm, nhưng
không đúng với tất cả các hợp chất đó (các dẫn xuất nitro) (Hình 2). Sử dụng nồng độ cao
của các dẫn xuất BAP khác nhau, người ta đã tìm thấy mối tương quan tốt giữa sự ức chế
sự tăng trưởng mô sẹo và khả năng ức chế kinase CDK2/cyclin E tái tổ hợp của người.
Điều này đã được xác minh thêm bằng cách thử nghiệm các dẫn xuất BAP đã chọn trong
xét nghiệm ức chế kinase thực vật. Hình 3 cho thấy một số cytokinin được thử nghiệm
(isopentenyladenine (iP), BAP, 4) cũng có khả năng ức chế CDK thực vật (ở nồng độ cao
hơn 50 uM). Mặt khác, 6-(3-nitrobenzylamino)purine 17, hợp chất không cho thấy bất kỳ
sự ức chế nào đối với sự phát triển của mô sẹo, cũng không hoạt động trong xét nghiệm
CDK thực vật (xem Hình 2 và 3 để so sánh). Vì những kết quả này một lần nữa xác nhận
giả thuyết trước đây của chúng tôi, nên có thể kết luận rằng sự ức chế sự phát triển của mô
sẹo thuốc lá, do nồng độ cytokinin quá cao, ít nhất là một phần là do cytokinin ức chế hoạt

11. động của CDK. Tuy nhiên, nhiều enzyme khác ngoài CDK, tham gia vào quá trình điều
hòa sự phát triển và phân chia tế bào, cũng có thể bị ức chế.
16

12. 3. Kết luận
Tóm lại, một nhóm dẫn xuất 6-benzylaminopurine với các chất thế vòng phenyl
khác nhau đã được chuẩn bị. Nhiều chất trong số chúng được phát hiện có hoạt tính
rất cao trong các xét nghiệm sinh học cytokinin khác nhau. Ngược lại, chỉ một số ít
có thể tương tác với thụ thể AHK của cytokinin. Một kết luận tạm thời là có thể tồn
tại một cơ chế cảm biến khác đối với cytokinin thơm ở thực vật.
Mặt khác, một số hợp chất đã chuẩn bị thể hiện (ở nồng độ cao hơn) hoạt tính
gây độc tế bào đối với cả tế bào động vật và thực vật. Hiệu ứng này có thể, ít nhất là
một phần, là do ức chế hoạt động của CDK trong các tế bào này. Điều này sẽ cung
cấp lời giải thích về mặt cơ học cho các đường cong liều lượng-đáp ứng của thử
nghiệm tăng trưởng mô sẹo đối với cytokinin. Kết quả từ xét nghiệm chống khối u và
xét nghiệm ức chế CDK2 tái tổ hợp của người cũng có thể giúp thiết kế các hợp chất

13. ba thế mới có hiệu lực như chất ức chế CDK và chất gây apoptosis trong tế bào ung
thư.

14. 4. Vật liệu và phương pháp
4.1. Quy trình chung
Điểm nóng chảy được xác định trên thiết bị Boetius và không hiệu chỉnh. Sắc
ký lớp mỏng phân tích (TLC) được thực hiện bằng cách sử dụng các tấm silica gel 60

15. WF254 (Merck). Phân tích nguyên tố (C, H và N) được thực hiện bằng cách sử dụng
máy phân tích EA1108 CHN (Fissons Instruments). Phổ khối ES + được ghi lại bằng
cách sử dụng đầu dò trực tiếp trên máy quang phổ khối Waters ZMD 2000. Khoảng
thời gian theo dõi khối lượng là 10– 1500 amu. Phổ được thu thập bằng cách sử dụng
quét chu kỳ 3,0 giây và áp dụng điện áp hình nón mẫu 25 V ở nhiệt độ khối nguồn
150 C, nhiệt độ loại dung môi 80 C và tốc độ dòng khí loại dung môi 200 l/h. Máy
quang phổ khối được ghép nối trực tiếp với hệ thống dữ liệu MassLynx. Phổ NMR
được đo bằng máy quang phổ Bruker Avance AV 300 hoạt động ở nhiệt độ 300 K và
tần số lần lượt là 300,13 MHz (1 H) và 75,48 MHz (13C). Các mẫu được chuẩn bị
bằng cách hòa tan các hợp chất trong DMSO-d6. Tetramethylsilane (TMS) được sử
dụng làm chuẩn nội.
4.2. Các hóa chất
6-Benzylaminopurine, 6-chloropurine, 4-methyl umbelliferyl galactoside, 4-
methylumbelliferone, DMEM, trypsin và DMSO được mua từ Sigma. Aldrich cung
cấp 2-fluorobenzylamine, 3-fluorobenzylamine, 4-fluorobenzylamine, 3-
chlorobenzylamine, 4-chlorobenzylamine, 2-bromobenzylamine hydrochloride, 3-
bromobenzylamine hydrochloride, 4-bromobenzylamine hydrochloride, 2-
iodobenzylamine, 2-methylbenzylamine, 3-methylbenzylamine, 4-
methylbenzylamine, 3-methoxylbenzylamine, 3-nitrobenzylamine hydrochloride, 4-
nitrobenzylamine hydrochloride, 2,4 -dichlorobenzylamine, 3,4-
dichlorobenzylamine, 2,3-dimethoxylbenzylamine, 3,4-dimethoxylbenzylamine,
3,5-dimethoxylbenzylamine, 2,4-dimethoxylbenzylamine hydrochloride, 3,4,5-
trimethoxylbenzylamine và 2,4,6-trimethoxylbenzylamine hydrochloride. Fluka
cung cấp 2-methoxylbenzylamine, 4-methoxylbenzylamine, 2-chlorobenzylamine,
2,4-difluorobenzylamine, 3,5-difluorobenzylamine, 2,4,5-trifluorobenzylamine,
2,3,6-trifluorobenzylamine, 2,4,5-trifluorobenzylamine, 2-chloro-4-
fluorobenzylamine và 3-chloro-4-fluorobenzylamine được mua từ Fluorochem.
Merck cung cấp axit casamino, calcein AM được mua từ Molecular Probes.
[c33P]ATP được cung cấp bởi MP Biomedicals. Cột NiNTA được mua từ Qiagen. 6-

16. (3,3-Dimethylallylamino)purine (isopentenyladenine, iP), 6-((E)- 4-hydroxy-3-
methylbut-2-enylamino)purine (trans-zeatin, tZ), olomoucine và bohemine được lấy
từ Olchemim (Olomouc, Cộng hòa Séc). Nước Milli-Q được sử dụng trong suốt quá
trình. Các dung môi và hóa chất khác được sử dụng đều đạt chất lượng pa tiêu chuẩn
4.3. Tổng hợp 6-benzylaminopurine
Quá trình chuẩn bị và hoạt tính cytokinin của 6-(2-
methoxybenzylamino)purine 14 và 6-(3-methoxybenzylamino)purine 15 đã được mô
tả ở nơi khác.19 Các quy trình chung để chuẩn bị 6-benzylaminopurine đã được mô
tả trước đó.4,19,20 Tóm lại, 6-chloropurine được đun nóng với amin chính thích hợp
đến 90 C trong 4 giờ trong n-butanol có chứa một lượng triethylamine quá mức. Sau
khi làm mát, sản phẩm kết tủa được lọc, rửa bằng nước lạnh và n-butanol và kết tinh
từ dimethylformamide. Nhận dạng và độ tinh khiết của các hợp chất tổng hợp được
xác nhận bằng phân tích nguyên tố và điểm nóng chảy, sắc ký lớp mỏng phân tích,
sắc ký lỏng hiệu suất cao, MS (Bảng 2) và NMR (Dữ liệu bổ sung).
4.4. Chuẩn bị 3,5-dihydroxybenzylamine hydrobromide
3,5-Dimethoxybenzylamine được chuyển thành chất tương tự hydroxyl hóa
của nó như đã mô tả trước đây.21,22 Acetanhydride (15 ml) được thêm vào, bằng xi
lanh, vào dung dịch 3,5-dimethoxybenzylamine trong 47% HBr dưới nitơ. Hỗn hợp
phản ứng khuấy sau đó được đun nóng đến 107 C trong 5 giờ. Sau khi axit bay hơi
trong chân không, etanol (15 ml) được thêm vào cặn và dung môi được bay hơi một
lần nữa. Sản phẩm thô (1,8 g) được kết tinh lại từ EtOH. Phân tích nguyên tố (C, H
và N) (Tìm thấy: C, 37,9; H, 4,7; N, 6,6. Tính toán C7H10NO2Br: C, 38,2; H, 4,6;
N, 6,4); TLC (chloroform:methanol:amoniac (8:2:0,1, v/v/v) làm pha động): một
điểm; mp 197–198 C; ES + MS: m/z 140 [MH]+; 1 H NMR (DMSO-d6, 300 MHz):
9,45 (NH2), 8,10 (OH), 6,29d (2H, 6H), 6,23tr (4H), 3,82s (7H); 13C NMR (DMSO-
d6, 75 MHz): 159,03 (3C, 5C), 136,05 (1C), 107,18 (2C, 6C), 102,89 (4C), 42,70
(7C).

17. 4.5. Chuẩn bị 2-hydroxy-3-methoxybenzylamine hydrobromide và 2,3-
dihydroxybenzylamine hydrobromide
Các hợp chất được chuẩn bị từ 2,3-dimethoxybenzylamine (1,5 ml; 10 mmol)
bằng quy trình tương tự như đối với 3,5-dihydroxybenzylamine. Sau khi đun sôi lại
(107 °C) trong 4 giờ, hỗn hợp phản ứng được giữ trong tủ đông (20 °C) trong 48 giờ.
Các tinh thể không màu của 2-hydroxy-3-methoxybenzylamine hydrobromide được
lọc bỏ, rửa bằng acetone và diethyl ether, sấy khô và kết tinh lại từ acetone. Phân tích
nguyên tố (C, H và N) (Tìm thấy: C, 41,0; H, 5,4; N, 5,9. C8H12NO2Br tính toán: C,
41,1; H, 5,2; N, 6,0); TLC (chloroform:methanol:amoniac (8:2:0,1, v/v/v) làm pha
động): một điểm; mp 209–211 C; ES + MS: m/z 154 [MH]+; 1 H NMR (DMSO-d6,
300 MHz): 9,42 (NH2), 8,28 (OH), 7,00kv (5H), 6,92kv (6H), 6,80tr (4H), 3,95s
(7H), 3,80s (–OCH3); 13C NMR (DMSO-d6, 75 MHz): 147,92 (3C), 144,17 (2C),
128,45 (1C), 122,29 (5C), 120,81 (6C), 112,77 (4C), 56,44 (–OCH3), 37,88 (7C).
Phần dịch lọc còn lại được cô đặc trong chân không, etanol (10 ml) được thêm vào
phần cặn và dung môi được cô đặc lại một lần nữa. Sau đó, ete (20 ml) được thêm
vào, phần cặn rắn được sấy khô và kết tinh lại từ etanol để thu được 0,25 g 2,3-
dihydroxybenzylamine hydrobromide. Phân tích nguyên tố (C, H và N) (Tìm thấy:
C, 38,2; H, 4,1; N, 6,1. Tính toán C7H10NO2Br: C, 38,2; H, 4,6; N, 6,4); TLC
(chloroform:methanol:amoniac (8:2:0,1, v/v/v) làm pha động): một điểm; mp 153–
154 C; ES + MS: m/z 140 [MH]+; 1 H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 9,55 (NH2),
8,15 (OH), 6,85kv (5H), 6,78kv (6H), 6,65tr (4H), 3,92s (7H); 13C NMR (DMSO-
d6, 75 MHz): 145,59 (3C), 145,05 (2C), 129,46 (1C), 121,15 (5C), 120,83 (6C),
116,29 (4C), 38,09 (7C).
4.6. Chuẩn bị 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzylamine hydroiodide
3,4,5-Trimethoxybenzylamine được hòa tan trong 55% HI và thêm
acetanhydride bằng xi lanh. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được khuấy từ ở nhiệt độ
phòng trong 4 giờ. Sản phẩm thô được kết tinh lại từ etanol. Phân tích nguyên tố (C,
H và N) (Tìm thấy: C, 34,9; H, 4,2; N, 4,8. Tính toán C9H14NO3I: C, 34,8; H, 4,5;
N, 4,5); TLC (chloroform:methanol:amoniac (8:2:0,1, v/v/v) làm pha động): một

18. điểm; mp 213–314 C; ES + MS: m/z 196 [MH]+; 1 H NMR (DMSO-d6, 300 MHz):
8,55 (NH2), 8,02 (OH), 6,75s (2H, 6H), 3,75s (–OCH3), 3,92s (7H); 13C NMR
(DMSO-d6, 75 MHz): 148,34 (3C, 5C), 136,13 (4C), 124,01 (1C), 107,13 (2C, 6C),
56,64 (–OCH3), 43,04 (7C).
4.7. Kiểm tra hoạt động của cytokinin
Hoạt động của cytokinin của tất cả các dẫn xuất đã chuẩn bị đã được kiểm tra
trong ba xét nghiệm sinh học tiêu chuẩn dựa trên sự kích thích tăng trưởng mô sẹo
thuốc lá, sự giữ lại diệp lục trong lá lúa mì đã cắt bỏ và sự cảm ứng tối của quá trình
tổng hợp betacyanin trong lá mầm Amaranthus, như đã mô tả trước đây.5,30 Trước
khi thử nghiệm, các dung dịch gốc của cytokinin trong DMSO đã được chuẩn bị và
pha loãng thêm trong môi trường được sử dụng cho mỗi xét nghiệm sinh học. Nồng
độ cuối cùng của DMSO trong môi trường không vượt quá 0,5%. Thử nghiệm hoạt
động đã được thực hiện trong phạm vi nồng độ từ 10 4 đến 10 8 M. Năm bản sao
được chuẩn bị cho mỗi nồng độ cytokinin và toàn bộ thử nghiệm được lặp lại ít nhất
ba lần. Từ những dữ liệu này, nồng độ có phản ứng sinh học cao nhất và hoạt động
tương đối ở nồng độ này cho mỗi hợp chất đã được tính toán (Bảng 3). Hoạt động
của BAP ở nồng độ tối ưu được đặt ở mức 100 và hoạt động của các hợp chất được
thử nghiệm có liên quan đến hoạt động của BAP. Nồng độ BAP tối ưu, được sử dụng
để tính toán, là 10 5 M cho xét nghiệm sinh học Amaranthus betacyanin, 10 4 M trong
trường hợp xét nghiệm sinh học lão hóa và 10 6 M cho xét nghiệm sinh học mô sẹo
thuốc lá.
4.8. Xét nghiệm cytokinin vi khuẩn
Việc chuẩn bị chủng Escherichia coli KMI001 chứa plasmid pIN-III-AHK4
hoặc pSTV28-AHK3 và xét nghiệm cytokinin vi khuẩn được thực hiện như đã mô
tả,
7,23,24
mặc dù có một số sửa đổi nhỏ. Các chủng E. coli được nuôi qua đêm ở 25 độ
C trong môi trường M9 được làm giàu với 0,1% axit casamino
25
đến OD600 1. Tiền
nuôi cấy được pha loãng theo tỷ lệ 1:600 trong 200 ll môi trường M9 chứa 0,1% axit
casamino và thêm 1 ll dung dịch gốc của hợp chất đã thử nghiệm hoặc dung môi đối
chứng. Các nền nuôi cấy được nuôi cấy thêm ở 25 độ C. Thời gian ủ là 17 giờ và 28

19. giờ được xác định là tối ưu cho CRE1/AHK4 và AHK3 tương ứng. Các nền nuôi cấy
được ly tâm và 50 ll phần dịch nổi được chuyển vào đĩa vi mô chứa 2 ll 50 mM 4-
methyl umbelliferyl galactoside, sau đó được ủ trong 1 giờ ở 37 C. Phản ứng được
dừng lại bằng cách thêm 100 ll 0,2 M Na2CO3. Huỳnh quang được đo bằng
Fluoroscan Ascent (Labsystems, Phần Lan) ở bước sóng kích thích và phát xạ lần
lượt là 365 và 460 nm. OD600 của nền nuôi cấy còn lại được xác định và hoạt động
b-galactosidase được tính là nanomole 4-methylumbelliferone · OD 1 600 · h 1 .
4.9. Thử nghiệm hoạt động chống khối u
Bệnh bạch cầu lymphoblastic T ở người (CEM), bệnh bạch cầu nguyên bào tủy
(HL-60), bệnh u hắc tố ác tính ở người (G-361), bệnh bạch cầu tủy mãn tính ở người
(K562), bệnh sarcoma xương ở người (HOS), ung thư vú ở người (MCF-7), bệnh u
hắc tố ở chuột (B16) và các dòng tế bào nguyên bào sợi bình thường ở chuột
(NIH/3T3) (ATCC, Rockvill, Maryland, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để xác định độc
tính tế bào của các hợp chất đã chuẩn bị bằng xét nghiệm calcein AM, như chúng tôi
đã mô tả trước đây.26 Tóm lại, các tế bào được nuôi trong bình nuôi cấy mô nhựa và
được nuôi trên môi trường nuôi cấy tế bào Eagles đã được Dulbeccos cải tiến
(DMEM) ở 37 độ C trong môi trường CO2 5% và độ ẩm 100%. Các tế bào được phân
phối lại vào các đĩa vi mô 96 giếng (Nunc, Đan Mạch). Sau 12 giờ ủ trước, các hợp
chất được thử nghiệm (trong phạm vi nồng độ cuối cùng 0,5–170 lM) được thêm vào.
Quá trình ủ kéo dài trong 72 giờ. Vào cuối giai đoạn này, các tế bào được ủ trong 1
giờ với calcein AM và huỳnh quang của các tế bào sống được đo ở 485/538 nm
(ex/em) bằng máy đọc Fluoroscan Ascent (Labsystems, Phần Lan). Giá trị IC50, nồng
độ hợp chất gây chết 50% tế bào khối u, đã được ước tính. Tất cả các thí nghiệm được
lặp lại theo bốn lần với độ lệch tối đa là 15%. Do độ hòa tan hạn chế trong nước, tất
cả các hợp chất được thử nghiệm đều được hòa tan trong DMSO và sau đó pha loãng
với nước đến nồng độ DMSO cuối cùng là 0,6%
4.10. Xét nghiệm kinase ở người
Xét nghiệm kinase CDK2/cyclin E ở người được thực hiện theo phương pháp
đã công bố.37 Nuôi cấy Sf9 đồng nhiễm với các loại baculovirus thích hợp được thu

20. hoạch sau 70 giờ nhiễm trùng, ủ trong đệm ly giải (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM
NaCl, 5 mM EDTA, 20 mM NaF, 1% Tween 20, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,5
lg/ml leupeptin và 1 lg/ml aprotonin) trong 30 phút trên đá và phần hòa tan được thu
hồi bằng cách ly tâm ở tốc độ 20.000g trong 10 phút. Enzym được tinh chế trên cột
NiNTA (Qiagen), bảo quản ở 4 độ C và sử dụng trong vòng một tuần. Để tiến hành
xét nghiệm ức chế enzym trong điều kiện tuyến tính, hệ thống thử nghiệm điểm cuối
cùng để đo hoạt động của kinase đã được sử dụng. Kinase được thêm vào hỗn hợp
phản ứng theo cách sao cho có được hoạt động tuyến tính theo cả nồng độ của enzyme
và thời gian. Xác định sự ức chế kinase bao gồm việc sử dụng 1 mg/ml histone H1
(loại III-S, Sigma) với sự hiện diện của 15 lM ATP, 0,05 lCi [c33P]ATP và hợp chất
được thử nghiệm trong thể tích cuối cùng là 10 ll, tất cả đều trong đệm phản ứng (50
mM HEPES, 10 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM 2-glycerolphosphate, 1 mM NaF
và 1 mM DTT, pH 7,4). Tất cả các hợp chất được thử nghiệm đều được hòa tan trong
DMSO ở nồng độ 5 mM, pha loãng thành 250 lM bằng 5 mM HCl và thử nghiệm
ngay lập tức ở nồng độ cuối cùng là 50 lM. Sau 10 phút ủ, phản ứng dừng lại bằng
cách thêm 5 ll H3PO4 3%, các phần nhỏ được chấm trên P-81 phosphocellulose
(Whatman, Hoa Kỳ) sau đó được rửa 3 · bằng 5% H3PO4 và cuối cùng được sấy khô
trong không khí. Các phép đo ức chế kinase sử dụng máy phân tích hình ảnh kỹ thuật
số BAS-1800 (Fujifilm, Nhật Bản). Hoạt động của kinase được thể hiện dưới dạng
phần trăm hoạt động tối đa (tức là không có chất ức chế).
4.11. Xét nghiệm kinase thực vật
Các xét nghiệm ức chế kinase với protein liên kết với p13Suc1-Sepharose
được thực hiện theo phương pháp đã công bố.27 Tóm lại, A. thaliana cv. được nuôi
cấy. Tế bào Columbia được đồng nhất hóa, các protein được liên kết với p13Suc1-
Sepharose và được thử nghiệm trong sự hiện diện của hợp chất được thử nghiệm với
histone H1 (Sigma loại IIIS) và 10 lM ATP + 0,05 lCi [c33P]ATP trong thể tích cuối
cùng là 20 ll. Các phản ứng được ủ ở 30 C trong 15 phút và kết thúc bằng đệm mẫu
3 · SDS. Sau khi tách trên 12% SDS PAGE, các gel khô được phân tích bằng máy
chụp ảnh sinh học BAS-1800 (Fujifilm, Nhật Bản).

21. Lời cảm ơn
Công trình này được hỗ trợ bởi Cơ quan tài trợ của Cộng hòa Séc (GA 203/04/1168),
Viện Hàn lâm Khoa học Cộng hòa Séc (S 4055304), Bộ Giáo dục Séc (MSM
153100008) và Volkswagen Stiftung (I/76865). Chúng tôi muốn cảm ơn Jarmila
Balonova´, Eva Friesnerova´, Olga Husta´kova´, Katerˇina Faksova´ và Miloslava
Sˇubova´ vì sự hỗ trợ kỹ thuật khéo léo.
Dữ liệu bổ sung
Dữ liệu bổ sung liên quan đến bài viết này có thể được tìm thấy trong phiên bản trực
tuyến tại doi:10.1016/ j.bmc.2005.09.004.
Nguồn, mục lục và tài liệu tham khảo: https://doi.org/10.1016/j.bmc.2005.09.004