Clase 1 tecnica Espectrofotometria .pptx

analisis de la tecnica espectroscopica

1. ESPECTROSCOPIA La espectrofotometría se utiliza en diversas aplicaciones como: Análisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un laboratorio de investigación Estandarización de colores de diversos materiales como plásticos y pinturas Detección de niveles de contaminación en aire y agua Determinación trazas de impurezas en alimentos y en reactivos

2. ( ) ( E) ESPECTRO DE ABSORCION

3. La radiación electromagnética con una longitud de onda entre 400 y 700 nm es detectado por el ojo humano y percibida como luz visible (VIS). O tras longitudes de onda también son llamadas luz sobre todo cuando la visibilidad no es relevante. El infrarrojo (IR) cercano ( > 700 nm ) y el ultravioleta (UV , < 400 nm ).

4. ESTADO ELECTRONICO EXCITADO: Muestra curvas similares en relación a la distancia interatómica pero a niveles de energía más elevados. ESTADO BASAL: Cualquier tipo de enlace (interacción átomo-átomo) se conforman en el estado de energía más baja.

5. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN La espectrometría de absorción es una técnica en la cual la energía de un haz de luz (radiación) se mide antes y después de la interacción con una muestra. La energía radiante absorbida en cualquier transición determina la longitud de onda ( ) de la radiación necesaria para lograr esa transición. Las moléculas que se encuentran en un estado excitado, vuelven al estado basal a través de una transferencia de energía calórica . .

6. CONCEPTOS PRACTICOS DE ESPECTROSCOPIA

7. ESPECTRO DE BARRIDO El espectro de barrido es un gráfico de absorbanción de luz en función de diferentes longitudes de onda ( ) en el rango del ultravioleta y/o luz visible. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el máximo de absorbancia en el espectro se llama longitud de onda máximo (λ máx ).

8. ESPECTROFOTÓMETRO Es el instrumento utilizado para medir los cambio en la intensidad de la luz en relación a la concentración de una solución determinada. Realiza un barrido desde el IR cercano hasta el UV, pasando por el visible . Fuente de luz (lámpara de tungsteno o de deuterio) Monocromador o rejilla de difracción (separa las diferentes longitudes de onda de la luz) Cubeta o soporte para la muestra, dependerá el tipo de muestra Detector 1 2 3 4

9. El espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (SIMPLE HAZ), toda la luz pasa a través de la muestra, por lo cual el blanco, cero o referencia debe ajustarse previo a la medición de la muestra.

10. En un instrumento de doble haz , la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia , y el otro haz de luz pasa a través de la muestra . También pueden tener dos detectores y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo.

11. ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (I ). La relación I/I se llama transmitancia , y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). Transmitancia

12. La absorbancia (A) se relaciona con la transmitancia (T) como A = - log T T=I/I . Las unidades de absorbancia van de 0 a 2 dado que A= 2 – log %T A= absorbancia T= transmitancia I = intensidad de la luz incidente I= intensidad de luz transmitida

13. Ley de Beer La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de la solución. A= a  b  c = ε  l c a= ε = absortividad o coeficiente de extinción molar. Es una constante particular para una molecula en un solvente dado (U/M * cm). b =l = la longitud del paso de luz a través de la muestra. c= la concentración de las especies absorbentes.

14. A= ε  l  c ε : es una propiedad específica característica para cada sustancia a una determinada longitud de onda (  ), solvente, pH de la solución, temperatura, sustancias interferentes y concentración de electrolitos. l: Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de paso de luz. Las muestras suelen ser colocadas en una cubetas transparentes hechas de cuarzo, vidrio o plástico. La mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles. 1 ~

15. Curva de Calibración Para medir la concentración de una sustancia se elige por lo general, la región de máxima absorción del espectro, denominada longitud de onda máxima. Todo método espectrofotométrico se basa en la determinación de la absorbancia de una sustancia de concentración conocida la cual se denomina solución patrón o estándar.   Para descartar la absorbancia de las interferencias es necesario medir la absorbancia de unamuestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones.

16. LEY DE BEER-LAMBERT La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución. TUBO BSA [ 0,4 mg/ mL ] H 2 O ( mL ) Reactivo de cobre alcalino ( mL ) Reactivo deFolin A ( mL ) (650 nm) mL Blanco 1,0 1,0 4,0 S1 0,1 0,9 1,0 4,0 S2 0.2 0,8 1,0 4,0 S3 0,3 0,7 1,0 4,0 S4 0,4 0,6 1,0 4,0 S5 0,5 0,5 1,0 4,0 MP1 --- c.s.p. 1mL 1,0 4,0 MP2 --- c.s.p. 1mL 1,0 4,0 MP3 --- c.s.p. 1mL 1,0 4,0

17. 1. Medir la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo método y medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. 2. Expresar el resultado en una gráfica de absorbancia ( A ) en función de la concentración ( c ). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una línea recta que pasa cerca del origen. 3. Determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida ( c x ) midiendo la absorbancia de la muestra ( A x ) e interpolando en la curva de calibración. A= m C+n A= absorbancia m=pendiente C=concentración n=intercepto eje x r=coeficiente de correlación (~1)

18. El valor de la concentración de la muestra analizada corresponde a C x calculado a partir de la ecuación de la recta A x = m C x +n A x = absorbancia para la muestra analizada m=pendiente determinada por la ecuación de la recta C x =concentración n=intercepto eje x, determinado por la ecuación de la recta

19. Espectrometría de emisión Es una técnica espectroscópica que analiza las longitudes de onda de los fotones emitidos por los átomos o moléculas durante su transición desde un estado excitado a un estado de inferior energía.

20. Dado que la energía emitida como fluorescencia siempre es menos que el cuanto que se absorbió inicialmente, la longitud de onda de la luz emitida siempre será más larga que la longitud de onda de excitación ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA La espectrometría de fluorescencia usa fotones de energía más elevada para excitar una muestra, que emitirá entonces fotones de inferior energía. Esta técnica se ha hecho popular en aplicaciones bioquímicas y médicas, y puede ser usada con microscopía confocal , transferencia de energía entre partículas fluorescentes, y visualización de la vida media de fluorescencia

21. RESUMEN ESPECTROMETRIA Y SUS APLICACIONES AL ESTUDIO DE LA BIOQUIMICA

22. Aplicaciones de la espectrofotometría visible y ultravioleta. Gran utilidad en el análisis de espacies químicas sobre todo para el químico analítico. En bioquímica se utiliza por ejemplo para: Identificar compuestos por su espectro de absorción. Conocer la concentración de un compuesto en una solución (curva de calibración). 3.Determinar la concentración de diferentes analitos en sangre en un laboratorio de análisis químico. 4. Seguir el curso de reacciones químicas y Enzimáticas (cinética enzimática) . 5. Análisis cuantitativo de proteínas y ácidos nucleicos (ADN y ARN).

23. Las longitudes de onda de los picks de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. Las proteínas, carbohidratos y ácidos Nucleicos son moléculas complejas que pueden absorber radiación en un amplio margen del espectro. Espectrometría ultravioleta-visible (UV-VIS)