Clase 3. COLORACION DE GRAM. PRACTICA.pptxMDsnnkvjsdnkjsdN

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1. Lago Tercero Microbiologia - COLORACION DE GRAM

2. COLORACIÓN DE GRAM El procedimiento de tinción más ampliamente usado en bacteriología, Nos permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos taxonómicos: Gram positivas y Gram negativas, según sea su comportamiento frente a la tinción.

3. COLORACIÓN DE GRAM SET DE COLORACIÓN El set de coloración de Gram está compuesto por: Cristal violeta Lugol Alcohol acetona Safranina o fucsina básica Técnica de coloración más sencilla y útil en microbiología diagnóstica. Creada por el médico danés Hans Christian Gram en 1884. Sufrió modificaciones por Hucker en 1921. Es p o sib l e o b s er v ar l a f or m a q ue tie n en l os m ic r o o rg a ni s m o s y clasificarlas en Gram positivas y Gram negativas.

4. Está a cargo de un anión Tiene carga negativa Tiñe el entorno de la célula ÁCIDOS Está a cargo de un catión Presenta carga positiva Tiñe el interior de la célula BÁSICOS Formado por soluciones acuosas de colorantes ácidos y básicos Soluble exclusivamente en alcohol Ej.: Giemsa NEUTR O S TIPOS DE COLORANTES

5. Este tipo de coloración es rápida y sencilla, ya que se usa un solo colorante por un corto tiempo. COLORACIÓN SIM P LE

6. . COLORACIÓN Diferencial Aquí los colorantes utilizados ponen de manifiesto  diferencias  entre células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la  tinción .

7. La diferencia de la reacción entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es atribuida a diferencias químicas y físicas de su pared celular. Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática mientras que las bacterias Gram negativas presentan por sobre la membrana citoplasmática una delgada capa de peptidoglicano a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína denominada “membrana externa”. La presencia de esta “membrana externa” diferencia actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: las que no la poseen, Gram positivas y las que poseen Gram negativas. FUNDAMENTO

8. En la coloración de Gram, el violeta de genciana es captado en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas y luego se forma un complejo con el lugol . El decolorante actúa extrayendo los lípidos de la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram negativas lo que produce un aumento en la permeabilidad y se pierde el complejo formado entre el violeta de genciana y el lugol . Al agregar la safranina, las bacterias Gram negativas toman el color de este contracolorante y se observan de color rosado. A diferencia de estas, en las bacterias Gram positivas el agregado del decolorante produce disminución de la permeabilidad e incrementa la retención del complejo del violeta de genciana-iodo. El resultado es que se observan de color violeta por la retención del mismo. FUNDAMENTO

9. GRAM POSITIVAS

10. GRAM NEGATIVAS

11. Mat er i a l e s Muestras Asa ba c t e r i o l óg i ca . Mechero Microscópio. Pizeta Va r ill a s de v i d r i o. C r i st a l v i o l eta . Lugol. Fucsina Alcohol acetona. Solucion salina . Agua Ace i te de i n m e r s i ó n . MATERIALES Co l o ra n tes R eacti v o s

12. ME T ODO L O G ÍA Frotis y fijación • Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados. • A partir del crecimiento microbiano en medios sólidos o líquidos: cuando la coloración de Gram se efectúa para caracterizar colonias, colocar en el portaobjeto una gota de solución fisiológica en la que se emulsionará la colonia que ha sido recolectada (mediante el uso de ansa o hisopo) del medio de cultivo en que se encuentra. En caso de que se trate de medios líquidos, depositar una alícuota de cada uno de ellos en el portaobjetos. • Directamente a partir de la muestra en estudio: es común que se preparen los extendidos directamente tomando la muestra (ejemplo pus, esputo, exudados, entre otros) con ansa, hisopo o pipeta estéril y diseminándola sobre la superficie del portaobjeto. Según la muestra, puede prepararse una suspensión en aproximadamente 1 mL de solución fisiológica estéril dentro de un pequeño tubo estéril y luego tomar una alícuota y esparcirla en el portaobjeto. • A la llama: se efectúa pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparación sobre la llama del mechero.

13. T I N C I Ó N Cubrir preparaciones con cristal violeta por un m i nuto , la var con ag u a . Cubrir frotis con lugol por un minuto, lavar. Decolorar con la mezcla alcohol-acetona, e scu rr i r d e 5 a 6 go tas y la var . C u b r i r con safra n i na d u r ante p o r 1 m i nuto , lavar. Secar la preparación y observar al microscopio coloca ndo ace i te d e i n m e rs i ón . 1 2 3 4 5

14. Resultados de las observaciones C oc o s Gram Negativos B ac i l o s Gram Negativos C oco s Gram Positivos B ac i l o s Gram Positivos

15. C onclusiones Las limitaciones de la técnica vienen dadas el hecho de que algunas bacterias no presentan pared celular. En las bacterias gramnegativas se presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, en cambio en las grampositivas presentan solo hay una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa . La coloración Gram nos permite identificar distintos tipos de bacterias según se coloree su superficie, aportando información muy útil para orientar el tratamiento antibiótico.