Columnas Empacadas

Columnas Empacadas HPLC

1. HPLC: Columnas Empacadas Daniel S. Parra González Diseño, Desarrollo y Aplicación de Métodos Cromatográficos Universidad Nacional de Colombia Bogotá , mayo de 2017

2. CONTENIDO Aspectos Generales Soportes Fases Estacionarias Clasificación Selección de la columna

3. Partes de la columna Empalme externo Tubería Funciones : No debe permitir el derrame de líquido bajo las presiones de HPLC. Debe distribuir el flujo de fase móvil y la muestra en la sección transversal de la columna. Debe retener el empaque dentro de la columna. Funciones : Contiene al lecho empacado Debe resistir las presiones de HPLC.

4. Empalme Externo

5. Mecanismo de Sello Tomado de sitio web de HPLC-Supply Inc. Disponible en: www.hplcsupply.com. Consultado: 17-05-2017

6. Los distribuidores permiten tener certeza que se da la distribución en el área longitudinal de la columna. Aunque aplica más en columnas preparativas, si el ratio diámetro:longitud excede ~0.05 empieza a tener influencia en la separación (4.6mm x 50mm empacada con 3 μ m) Distribuidores Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

7. Filtro TIPOS DE FILTRO Fritas de partículas de acero sinterizado Gran capacidad filtrante Porosidad 30 a 40% Espesor mínimo de un 1mm Malla de acero tejido Porosidad 5% Espesor mínimo de 0.1mm Sin capacidad filtrante se puede tapar Malla híbrida Polvo a presión en malla Espesor de 0.1 mm Capacidad filtrante Malla de PEEK o PE No tiene capacidad filtrante Se puede deshacer con solventes (no NP-HPLC) El Filtro presente en el empalme tiene como fin: Contener las partículas en el sistema Constribuir a la distribución de la muestra Proteger al empaque de material particulado Tomado de sitio web de HPLC-Supply Inc. Disponible en: www.hplcsupply.com. Consultado: 17-05-2017

8. Tubería En la mayor parte de los casos es acero inoxidable 316. La rugosidad de la superficie interna altera la uniformidad del lecho empacado. Un diseño exitoso ha consistido en un tubo externo de resistencia y un tubo interno con un acabado sofisticado. Tubería de PEEK no soportada en acero, <350bar Tubería de vidrio no soportada en acero, <100bar Tomado de sitio web de HPLC-Supply Inc. Disponible en: www.hplcsupply.com. Consultado: 17-05-2017

9. Empaque de la columna   Para una part ícula de 10 μ m con porosidad 75%, la velocidad de sedimentación es 0.02 cm/s. Pero en el empaque se alcanzan 1.33 cm/s. Lo que determina la calidad del empaque son las interacciones entre partículas ADICIÓN AG. DEFLOCULANTE Stoke’s

10. Química de las Columnas Soportes inorgánicos Poseen resistencia mecánica; soportan altas presiones. No se hinchan o encogen cuando se exponen a diferentes disolventes. Son empaques porosos, cuyas características físicas se pueden controlar mediante procesos tecnológicos. Se disuelve en pH alcalinos. Soportes de polímeros orgánicos Tienen un rango de pH de uso de 1 a 14. No soportan grandes presiones (< 150 bar); poca resistencia mecánica. En comparaciones siempre tienen menor eficiencia, puesto que la transferencia de masa es reducida. Pueden imbibir o sufrir sinéresis de acuerdo al tipo de disolvente.

11. Soporte de Sílice (1) Procesos de obtención Hidrólisis completa de silicato sódico Policondensación de polietoxisiloxano emulsificado, y deshidratación Gel de Sílica (Irregular o Esférico) pH Concentración Aditivos V. de agitación Volumen reactor Cont. metales

12. Soportes de Sílice (2) Siloxano Hidrofóbicos Poco reactivos ↑ con trat. térmico Silanol Grupo ácido Ionizable a pH>3 Genera colas Adsorción en NP-HPLC Centro reactivo en RP-HPLC Silanol Vecinal No tienen acidez Ávidos por -OH Silanol Geminal No tienen acidez Conc. silanol en superficie 8 – 14 μ mol/m 2 (4.6-8 grupos/nm 2 ) Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

13. Contenido de Metales La presencia de metales como aluminio es indeseable, genera grupos silanol. Genera fuerte adsorción de compuestos básicos Sílicas convencionales: 250 ppm Na + ; 150 ppm Al 3+ Sílicas modernas: < 1 ppm Na + , Ca 2+ , Mg 2+ , Al 3+ , Fe 3 + . Contenido de Metales en Sílice

14. pH Concentración Aditivos V. de agitación Volumen reactor Cont. metales Proceso de manufactura Amplitud de poro Área de superficie específica Distribución de amplitud de poro Densidad Sílica 2.2 g·cm-3 Empaque 0.3-0.6 g·cm-3 Una distribución uniforme permite picos simétricos En RP-HPLC > 50 Å . En SEC > 300 Å. 100m 2 ·g -1 para 300Å 300m 2 ·g -1 para 100Å 500m 2 ·g -1 para 60Å Proceso de Manufactura LA AMPLITUD DE PORO Y EL ÁREA DE SUPERFICIE ESPECÍFICA ALTERAN LA RETENCIÓN EL DIÁMETRO DE PARTÍCULA ALTERA LA PRESIÓN Y TIEMPO DE ANALISIS ! !

15. Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

16. Fases Enlazadas (1) Se hace modificación química de los grupos silanoles libres por: A. Esterificación Se usa principalmente para GC, esta reacción se da con grupos silanol superficiales. La fase enlazada es susceptible de hidrólisis en presencia de FM acuosa. Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

17. Fases Enlazadas (2) B. Enlace con cloruro de tionilo y amina El enlace tipo imina es menos susceptible a la hidrólisis. Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

18. Fases Enlazadas (3) C . Formación de enlaces siloxanos Las fases enlazadas con un enlace siloxano son las más estables de todas. El octadecilsilano (ODS) es uno de los productos mas utilizados en RP-HPLC. Se pueden tambier utilizar silazanos para generar la unión ODS Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

19. Fases Enlazadas (4) D. Formación de polisiloxanos Se pueden producir estructuras poliméricas con estructura de aceite de silicona. Estas columnas tienen unas estabilidad mayor frente a pH alcalino. Tomado de Meyer VR. Practical HPLC. 5 ed. London, UK 2010. Wiley and Sons, Ltd

20. Superficie Cubierta   Donde χ - superficie de cobertura, %C - contenido de carbono SA - área superficial MW - peso molecular nC – número de átomos de carbono La superficie de cobertura máxima para columnas de sílica es 4 μ mol/m² Como la superficie posee hasta 8 μ mol/m² de grupos silanol, tras la reacción queda la mitad de los grupos sin reaccionar. Capping Con el fin de minimizar los grupos silanol residuales tras la adición de FE se adicionan grupos trimetilsilil - con ClSi(CH 3 ) 3 - para eliminar sitios de adsorción que producen tailing . Inclusive con capping es imposible eliminar del todo la influencia de la adsorción en la separación

21. Fase Estacionarias (1) C18 C12 C8 C6, hexil Usar cadenas lineales de HC aumenta levemente la selectividad hasta el umbral C18 RP-HPLC

22. Fases Estacionarias (2) Ciclohexil Fenil Alquilfenil Alquil-F5-fenil Útil para separar compuestos aromaticos RP- HPLC Se presentan diferencias importantes cuando se compara selectividad con cadenas de hidrocarburos lineales.

23. Fases Estacionarias (3) C4 C3 C2 C1 Usado para capping RP-HPLC

24. Fases Estacionarias (4) Ciano, nitrilo Amino Diol SAX – Strong Anion Exchange SCX – Strong Cation Exchange Intercambiadores iónicos IEC y HILIC Polar HILIC Polar SEC acuoso Polar NP-HPLC y RP-HPLC

25. Fases Estacionarias (5) Nitro SymmetryShield RP8 - Alquilcarbamato Supelcosil ABZ Selectividad por compuestos aromaticos NP-HPLC Fases apolares con grupos polares incrustados RP-HPLC Previene la interacción del analito con silanoles libres Los compuestos exhiben significativa selectividad en comparación con fases con HC

26. Fases Estacionarias (6) Fase Estacionaria Bifuncional Fases Quirales

27. LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LA FASE ESTACIONARIA ALTERAN LA SELECTIVIDAD DE LA SEPARACIÓN Tomado de sitio web de: Advanced Chromatography Technologies Ltd. Disponible en: http://www.ace-hplc.com/products/product.aspx?id=105. Consultado el 16-05-2017 Efecto de FE en Separación ! Se cambia el órden con el cual los picos son eluidos con FE

28. Reproducibilidad Intramarca El desarrollo de la industria de columnas ha permitido reducir la variabilidad lote a lote en una misma marca

29. Otros soportes: Alumina Es efectiva para la separación de hidrocarburos aromáticos policíclicos e isómeros estructurales. Es estable a pH 2 a 12, pero tiene fuertes propiedades quimiosorptivas ( tailing ) En general, tienen menos eficiencia que columnas de sílica. Puede actuar como intercambiador de cationes o aniones de acuerdo a su tratamiento. Tomado de sitio web de Advanced NanoFabric Engineering. Disponible en: http://voitlab.com/courses/thermodynamics/index.php?title=Advanced_NanoFabric_Engineering Consultado el 16-05-2017

30. Otros soportes: Zircón o Titanio El zircón se puede usar en NP-HPLC y RP-HPLC Tiene muchos grupos básicos en superficie, algunos ácidos Estable a pH entre 1 y 13 El titanio se puede usar en NP-HPLC y RP-HPLC Tiene grupos básicos en superficie Estable a pH alto Tomado de sitio web de ZirChrom Newsletter. Disponible en: https://www.zirchrom.com/newsletters/2005-07.asp Consultado el 16-05-2017 Tomado de sitio web de ZirChrom Newsletter. Disponible en: https://www.zirchrom.com/newsletters/2005-07.asp Consultado el 16-05-2017

31. Otros soportes : Estireno-Divinilbenceno Fueron originalmente desarrollados para cromatografía de macromoléculas. Basados en unión de monómeros de isómeros de estireno y divinilbenceno. Utilizados principalmente en IEC y SEC La proporción de DVB determina el entrecruzamiento y tamaño de poro: Si DVB (<6%) – poca estabilidad frente a presión y no es útil para HPLC Si DVB (8%) – se trata de poliestireno semirígido; estable a 80 bar; se hincha o encoge dependiendo la fase móvil. Si DVB (>10%) – se tiene poliestireno rígido que es un material que no se hinchan y soporta presiones hasta 350 bar Estireno p-divinil benceno ↑ alta hidrofobicidad

32. Otros soportes: Estireno-Divinilbenceno Los empaques microporosos se producen con menor entrecruzamiento, son no porosos en estado seco y adquieren volumen de poro al imbibir solvente (usualmente uno no polar). Se utilizan más para SEC de moléculas pequeñas y analitos oligoméricos . En los empaques macroporosos, los poros no se encuentran dentro del retículo del polímero y se trata de espacios entre esférulas de polímero sólido. La estructura de poro y superficie específica es permanente. Estos empaques se usan más en SEC de moléculas grandes y cromatografía de retención .

33. Otros soportes : Metacrilato Son preparados de metacrilato y un agente de entrecruzamiento apropiado como etilenglicol metacrilato. El monómero más usado es glicidoximetacrilato, el grupo epoxi se puede derivatizar con grupos funcionales. Se pueden formar resinas micro y macroporoso con el mismo rango de tamaño de poro que en resinas de poliestireno. Son estables a hidrólisis entre pH 2 y 12; estas resinas son útiles para HILIC y SEC acuosa . La resina se puede derivatizar para formar intercambiadores aniónicos .

34. Otros soportes : V inilalcohol La estructura es muy hidrofílica, y al tener cadenas de hidrocarburo lineal es resistente a hidrólisis en extremos de pH . Si se adicionan cadenas largas de ácido graso se puede obtener resinas útiles para RP-HPLC. Como ventaja clave es que no se tienen grupos silanol ácidos libres.

35. Otros Soportes de HPLC Silicato de Magnesio Agarosa Vidrio de poro controlado (CPG) Hidroxilapatita Carbono poroso grafítico Materiales de acceso restringido Pese a que existen una gran variedad de columnas en LC no siempre se piensa en todas

36. Propiedades Físicas de la Columna       Longitud Diámetro interno Tamaño de partícula Resolución Tiempo de análisis Contrapresión de la columna LAS PROPIEDADES FÍSICAS DE LA COLUMNA ALTERAN LA EFICIENCIA DE LA SEPARACIÓN !

37. Las columnas más grandes pueden ser usadas para análisis con alta resolución , pero como tiene un tiempo de análisis muy largo. Las columnas más pequeñas pueden ser usadas para análisis rápidos a costa de la resolución. Influencia de la Longitud en la Separación Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

38. Influencia de la Longitud en la Separación (2) 5 cm 10 cm 15 cm Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

39. Influencia de Tamaño de Partícula A menores tamaños de partículas se tiene mejor resolución posible. Pero al aumentar este se tiene un rango dinámico más amplio. Se debe reservar una columna con rango intermedio para propósitos generales, se puede usar una columna con rango pequeño para alta resolución. Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

40. Efecto del Tamaño Partícula 5 μ m 10 μ m 15 μ m Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

41. Efecto del Ratio l :d p La resolución máxima y el tiempo de análisis son determinadas por el ratio entre longitud y dp solamente. Se deben escoger los menores valores de dp, a medida que se escala la longitud hasta alcanzar el límite de presión. Los ratios óptimos tienen problemas con sobrecalentamiento Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

42. Influencia del Diámetro de la Columna Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

43. Influencia del Diámetro de la Columna (2) USAR MENOR ID Ventajas Ahorro de solvente El tamaño de la muestra puede ser más pequeño Desventajas No siempre el equipo se adapta a un ID pequeño Sobrecarga de volúmen Sobrecarga de masa Tomado de Neu UD. HPLC Columns. Wiley-VCH. Canada, 1997.

44. Elección de Columna – Desarrollo de Métodos A priori Definir el conocimiento de la muestra Definir los objetivos para el método de separación Eliga la columna a considerar En el laboratorio Elija la química inicial de la fase móvil Elija el tipo de detección y parámetros de inicio Evalúe las colúmnas potenciales para la muestra Optimize las condiciones de separación (G o I) para la columna escogida Valide

45. Desarrollo del Método Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

46. Desarrollo del Método Relacione los objetivos del método con la columna Una columna adecuada para empezar es: 15cm x 4.6 mm, 5 µm, 200m 2 /g, 100Å, 10% C, monomérica, esférica)

47. Desarrollo del Método Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

48. Ejemplo (1) Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

49. Ejemplo (2) Mezcla de compuestos Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

50. Ejemplo (3) Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

51. Ejemplo (4) Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017

52. Ejemplo (5) Tomado de: Young CS, Weigand J. An Efficient Approach to Column Selection in HPLC Method Development. Alltech Associates, Inc. Deerfield, IL, Consultado el 16-05-2017