Copy of TUGAS BIOLOGI SEL ppt cell biology.pptx

Biology

1. ‹#› TUGAS BIOLOGI SEL METODE SANDWICH ELISA 828245220035 UPN VETERAN JAKARTA 2024

2. ‹#› Jurnal

3. Jurnal Judul: Perbedaan kadar TNF-a dalam darah vena pada pasien dengan periodontitis apikalis dan pulpa normal Metode: Sandwich ELISA Hasil: Kadar TNF-a tidak memiliki perbedaan signifikan antar 2 kelompok

4. Pendahuluan Proses resorpsi tulang di daerah periradikular dimodulasi oleh sitokin proinflamasi seperti interleukin (IL)-1β, IL-6, interferon (IFN)-γ dan tumor necrosis factor (TNF-α), dan sitokin anti-inflamasi seperti transforming growth factor (TGF)-β dan IL-4.8 TNF-α merupakan sitokin utama pada respon inflamasi akut terhadap bakteri Gram negatif dan mikroba lainnya. Infeksi yang berat dapat memicu produksi TNF- α dalam jumlah besar yang menimbulkan reaksi sistemik.9 Berdasarkan beberapa penelitian, infeksi gigi seperti PA dapat mempotensiasi patogenesis penyakit autoimun dengan meningkatkan infiltrasi sel inflamasi dan kadar serum sitokin. Elsalhy et al. pada penelitiannya membandingkan kadar sitokin pada gigi dengan pulpitis ireversibel dan gigi yang belum mengalami karies, didapatkan hasil bahwa kadar TNF-α lebih tinggi pada kelompok dengan pulpitis ireversibel.

5. Tujuan Tujuan penelitian menganalisis perbedaan kadar TNF-α dalam darah vena pasien dengan periodontitis apikalis dan pulpa normal.

6. Metode Besar sampel diperoleh dari rumus Hypothesis Testing for two sample means (two sided test) yang memberikan hasil sebanyak 20 sampel. Bahan dan instrumen yang digunakan terdiri dari pipet, microplate reader, deionized water, pencuci microplate otomatis, kertas grafik log-log, tabung standar pengenceran, plate shaker, timer, vials polypropylene, kit ELISA merek ‘Biolegend’ dengan lot number: 13221830. Sampel berupa darah vena diambil menggunakan tabung non EDTA dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 1,000x g kemudian sampel dipisahkan dan serumnya disimpan dengan suhu <-700 C. Sampel yang berupa serum darah menggunakan metode ELISA Sandwich

7. Metode Besar sampel diperoleh dari rumus Hypothesis Testing for two sample means (two sided test) yang memberikan hasil sebanyak 20 sampel. Bahan dan instrumen yang digunakan terdiri dari pipet, microplate reader, deionized water, pencuci microplate otomatis, kertas grafik log-log, tabung standar pengenceran, plate shaker, timer, vials polypropylene, kit ELISA merek ‘Biolegend’ dengan lot number: 13221830. Sampel berupa darah vena diambil menggunakan tabung non EDTA dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 1,000x g kemudian sampel dipisahkan dan serumnya disimpan dengan suhu <-700 C. Sampel yang berupa serum darah menggunakan metode ELISA Sandwich

8. Hasil Hasil penelitian menunjukkan adanya kadar TNF-α pada semua sampel serum darah vena. Kadar TNF-α pada plate ditandai dengan perubahan warna menjadi biru setelah diberi TMB reagent dan berubah menjadi warna kuning setelah diberi stop solution. Warna kuning yang dihasilkan semakin pekat, maka semakin tinggi kadar absorbansi TNF-α dan kadar absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi antigen yang diperiksa.

9. Hasil Gambar 2. Kadar TNF-α dalam 20 sampel. sumbu x nomor 1–10 merupakan pasien dengan pulpa normal dan 11-20 pasien dengan PA. Sumbu y merupakan kadar TNF-α dalam pg/mL

10. Hasil Uji T Test Independent menunjukan bahwa tidak terdapat perbedaan bermakna antara subjek dengan PA dan pulpa normal (p>0,05i).

11. Metode ‹#› SANDWICH ELISA

12. Definisi Metode Sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) adalah teknik untuk mendeteksi dan mengukur antigen spesifik dalam sampel dengan menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi penangkap (capture antibody) dan antibodi pendeteksi (detection antibody), yang mengikat antigen secara berurutan.

13. Kelebihan Sandwich ELISA 1. Spesifisitas Tinggi: Dengan menggunakan dua antibodi yang berbeda untuk menangkap dan mendeteksi antigen, metode ini memiliki spesifisitas yang sangat tinggi karena antibodi harus mengenali dua epitope yang berbeda pada antigen yang sama. 2. Sensitivitas Tinggi: Karena menggunakan dua lapisan antibodi, Sandwich ELISA biasanya lebih sensitif dibandingkan ELISA langsung atau tidak langsung. Ini memungkinkan deteksi antigen dalam konsentrasi yang sangat rend

14. Kelebihan Sandwich ELISA 3. Kompatibel dengan Sampel Kompleks: Metode ini dapat digunakan pada sampel yang mengandung protein atau komponen lain yang kompleks (misalnya serum, plasma, atau cairan tubuh lainnya) karena penggunaan dua antibodi membantu mengurangi gangguan dari komponen lain. 4. Fleksibilitas dalam Pengukuran: Bisa digunakan untuk mengukur antigen baik yang kecil maupun besar karena antibodi penangkap dan pendeteksi dapat dipilih sesuai kebutuhan.

15. Kekurangan Sandwich ELISA 1. Biaya Relatif Tinggi: Metode ini membutuhkan dua jenis antibodi spesifik, sehingga biaya cenderung lebih tinggi dibandingkan metode ELISA lainnya. 2. Persiapan Lebih Rumit: Menemukan dua antibodi yang bisa bekerja secara efektif untuk menangkap dan mendeteksi antigen yang sama memerlukan optimasi yang lebih kompleks.

16. Kekurangan Sandwich ELISA 3. Rentan Terhadap Masalah Cross-reactivity: Jika antibodi yang digunakan tidak cukup spesifik, bisa terjadi cross-reactivity dengan molekul lain, yang mengakibatkan sinyal palsu. 4. Memerlukan Waktu Lebih Lama: Proses ini umumnya membutuhkan lebih banyak langkah dan waktu inkubasi, sehingga waktu pengerjaan bisa lebih lama dibandingkan jenis ELISA lainnya.

17. Sandwich ELISA Sampel berupa darah diambil menggunakan tabung non EDTA Dilakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 1,000x g Sampel dipisahkan dan serumnya disimpan dengan suhu <-700 C. Sampel (yang berupa serum darah) menggunakan metode ELISA Sandwich, dilakukan pengenceran 20 kali wash buffer menjadi 1 kali dengan deonized water Lyophilized human IL-22 dan IL-17 standard diganti dengan ditambahkan volume dari Assay Buffer A yang diindikasikan pada label vial untuk membuat standard stock solution 20ng/mL. Sampel pada umumnya dianalisis tanpa pelarut, namun apabila pelarut dibutuhkan, maka dapat menggunakan assay buffer A sebagai pelarut.

18. Sandwich ELISA Prosedur assay dilakukan dengan menyiapkan 500 µL dari 1000 pg/mL top standard dengan melarutkan 25 µL dari standard stock solution pada 475 µL dari assay buffer A. Pelarutan dilakukan enam kali lipat dari 1000 pg/mL top standard pada tabung yang berbeda menggunakan assay buffer A sebagai pelarut. Konsentrasi human IL-22 dan IL-17 didapatkan sebanyak 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,2 pg/mL, 31,3 pg/mL, dan 15,6 ph/mL. Assay buffer A berfungsi sebagai zero standard (0pg/mL) (seperti gambar berikut)

19. Sandwich ELISA Plate dicuci sebanyak empat kali dengan sekurangnya 300 µL dari 1 kali wash buffer untuk setiap well, sisa buffer dihilangkan dengan cara menekan plate pada bagian atas dan bawahnya menggunakan kertas pengering (absorbent paper). Kemudian, sebanyak 50 µL ditambahkan dari assay buffer A untuk setiap well yang mengandung larutan standar ataupun sampel dan 50 µL dari larutan standar atau sampel pada well. Plate ditutup menggunakan plate sealer dan diinkubasi dalam suhu ruangan serta digetarkan dengan kecepatan 200 rpm selama 2 jam.

20. Sandwich ELISA Plate dicuci sebanyak empat kali dengan sekurangnya 300 µL dari 1 kali wash buffer untuk setiap well, sisa buffer dihilangkan dengan cara menekan plate pada bagian atas dan bawahnya menggunakan kertas pengering (absorbent paper). Kemudian, sebanyak 50 µL ditambahkan dari assay buffer A untuk setiap well yang mengandung larutan standar ataupun sampel dan 50 µL dari larutan standar atau sampel pada well. Plate ditutup menggunakan plate sealer dan diinkubasi dalam suhu ruangan serta digetarkan dengan kecepatan 200 rpm selama 2 jam.

21. Sandwich ELISA Isi plate dibuang lalu dicuci sebanyak 4 kali menggunakan 1 kali wash buffer dengan cara yang sama. Selanjutnya, 100 µL ditambahkan dari human IL-22 dan IL-17 detection antibody solution pada setiap well, plate ditutup, dan diinkubasi dalam temperatur ruangan dan digetarkan selama satu jam. Isi plate dibuang ke pembuangan lalu cuci plate sebanyak empat kali menggunakan 1 kali wash buffer.

22. Sandwich ELISA Sebanyak 100 µL larutan Avidin-HRP B ditambahkan pada setiap well, plate ditutup, diinkubasi dalam suhu ruangan dan digetarkan selama 30 menit. Isi pada plate kemudian dibuang dan plate dicuci sebanyak 5 kali dengan 1 kali wash buffer, dimana pada tahap pencucian terakhir well direndam dalam 1 kali wash buffer selama 30 detik-1 menit pada setiap siklus pencucian. Sebanyak 100 μL substrate solution D ditambahkan pada setiap well dan diinkubasi dalam waktu 15 menit pada keadaan gelap.

23. Sandwich ELISA Well yang mengandung human IL-22 dan IL-17 akan menunjukan perubahan warna menjadi biru dimana dengan intensitas warna yang semakin pekat maka semakin tinggi konsentrasinya. Reaksi diberhentikan dengan ditambahkan 100 μL larutan stop solution pada setiap well dan warna larutan akan berubah menjadi kuning. Tingkat penyerapan dihitung pada 450 nm setelah reaksi berhenti dalam waktu 30 menit.

24. Faktor yang mempengaruhi pengukuran IL serum Kualitas Sampel • Pengambilan dan Penyimpanan Sampel • Pembekuan dan Pencairan Berulang • Komponen Pengganggu dalam Sampel 2. Kualitas Antibodi • Spesifisitas Antibodi • Konsentrasi Antibodi 3. Kondisi Inkubasi • Suhu Inkubasi • Waktu Inkubasi 4. Reagen dan Buffer • Kualitas Reagen: • Enzim dan Substrat 5. Teknik dan Prosedur Laboratorium • Teknik Pipetasi • Pencucian (Washing) 6. Faktor Lingkungan

25. DAFTAR PUSTAKA Nuralim, E. R., Rahayu, I. D. and Bekti, R. S. (2017) ‘Analisis Perbandingan Fiksasi Menggunakan Larutan Formalin Dan Larutan Carnoy Pada Somit, Neural Tube, dan Vaskular Embrio Ayam Usia 48 Jam Dengan Pewarnaan Hematoxylin- Eosin’, 4(1). Padberg, S. (2015) Anti-infective Agents . Third Edit, Drugs During Pregnancy and Lactation: Treatment Options and Risk Assessment: Third Edition . Third Edit. Elsevier B.V. doi: 10.1016/B978-0-12-408078-2.00007-X. Pierce, B. A. (2017) Genetics: A Conceptual Approach , Archives of Biochemistry and Biophysics . doi: 10.1006/abbi.1994.1027. Rachmadian, A. P., Shodikin, M. A. and Komariah, C. (2018) ‘Faktor-Faktor Risiko Kematian Bayi Usia 0-28 Hari di RSD dr. Soebandi Kabupaten Jember’, Journal of Agromedicine and Medical Sciences , 4(2), pp. 59–65. Rahayu, I. D., Paundralingga, O. T. K. and Sari, V. P. (2018) ‘Pengaruh Paparan Genistein Terhadap Perkembangan Awal Sistem Saraf Pusat Pada Model Embrio Ayam (Gallus Gallus) Umur 48 Jam’, MNJ (Malang Neurology Journal) , 4(1), pp. 12–18. doi: 10.21776/ub.mnj.2018.004.01.3. Réhault-Godbert, S., Guyot, N. and Nys, Y. (2019) ‘The golden egg: Nutritional value, bioactivities, and emerging benefits for human health’, Nutrients , 11(3), pp. 1–26. doi: 10.3390/nu11030684. Rodwell, V. W. et al. (2018) Harper’s Illustrated Biochemistry . Sadler, T. W. (2019) Langman’s Medical Embryology , Journal of Chemical Information and Modeling . Sadler, T. W. et al. (2020) ‘Prevention of fumonisin B1-induced neural tube defects by folic acid’, Teratology , 66(4), pp. 169–176. doi: 10.1002/tera.10089. Safi, J., Joyeux, L. and Chalouhi, G. E. (2012) ‘Periconceptional folate deficiency and implications in neural tube defects’, Journal of Pregnancy , 2012. doi: 10.1155/2012/295083. Sato, K. (2020) ‘Why is folate effective in preventing neural tube closure defects?’, Medical Hypotheses , 134(October 2019), p. 109429. doi: 10.1016/j.mehy.2019.109429. Scanes, C. G. and Christensen, K. D. (2020) Poultry Science , Angewandte Chemie International Edition, 6(11), 951–952. Sherwood, L. (2015) Introduction to Human Physiology , American Journal of Public Health and the Nations Health . Brooks/Cole, Cengage Learning. doi: 10.2105/ajph.38.11.1590-b. Singh, I. (2018) Human Embryology . 11th edn. Jaypee Brothers Medical Publishers.

26. DAFTAR PUSTAKA Houser, M.E.L., Stewart, J.R. and Brewer, J.D., 2023. Psoriasis Patients Treated With Methotrexate Have an Increased Risk of Nonmelanoma Skin Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. Cureus, 15(4). Grossman, R.M., Chevret, S., Abi-Rached, J., Blanchet, F. and Dubertret, L., 1996. Long-term safety of cyclosporine in the treatment of psoriasis. Archives of Dermatology, 132(6), pp.623-629. Chaplin, S., 2019. Monoclonal antibodies for the treatment of plaque psoriasis. Prescriber, 30(9), pp.35-40. Thatiparthi, A., Martin, A., Liu, J. and Wu, J.J., 2022. Risk of skin cancer with phototherapy in moderate-to-severe psoriasis: An updated systematic review. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology, 15(6), p.68. Houser, M.E.L., Stewart, J.R. and Brewer, J.D., 2023. Psoriasis Patients Treated With Methotrexate Have an Increased Risk of Nonmelanoma Skin Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. Cureus, 15(4). Dogra, S. and Khullar, G., 2013. Tumor necrosis factor-α antagonists: Side effects and their management. Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology, 79, p.35.

27. DAFTAR PUSTAKA Silva-Abreu, M., Sosa, L., Espinoza, L.C., Fábrega, M.J., Rodríguez-Lagunas, M.J., Mallandrich, M., Calpena, A.C., Garduño-Ramírez, M.L. and Rincón, M., 2023. Efficacy of Apremilast Gels in Mouse Model of Imiquimod-Induced Psoriasis Skin Inflammation. Pharmaceutics, 15(10), p.2403. Butler, G., Michaels, J.J.C., Al-Waili, N., Finkelstein, M., Allen, M., Petrillo, R., Carrey, Z., Kolanuvada, B., Lee, B.Y., Riera, A.G. and Michaels, C.C., 2009. Therapeutic effect of hyperbaric oxygen in psoriasis vulgaris: two case reports and a review of the literature. Journal of Medical Case Reports, 3, pp.1-5. Singh, T.P., Zhang, H.H., Hwang, S.T. and Farber, J.M., 2019. IL‐23‐and imiquimod‐induced models of experimental psoriasis in mice. Current protocols in immunology, 125(1), p.e71. Fawzy, A., Putranti, I.O. and Setiyawati, E., 2023. The Potential Role of Hyperbaric Oxygen Therapy in Psoriasis Treatment: A Review of PI3K/AKT/FOXO Signaling Cascade and Interleukin-1β. International Journal of Medical Science and Clinical Research Studies, 3(06), pp.1140-1144. Weidmann, A., Foulkes, A.C., Kirkham, N. and Reynolds, N.J., 2014. Methotrexate toxicity during treatment of chronic plaque psoriasis: a case report and review of the literature. Dermatology and therapy, 4, pp.145-156.

28. ‹#› TERIMA KASIH