CRISPRCas9-mediated genome editing from basic research to gene therapy.pptx

Bioteknologi terkait CRISPR

1. BIOTECHNOLOGY PENGEDITAN GENOM DENGAN CRISPR/CAS9: DARI RISET DASAR HINGGA TERAPI GEN

2. Introduction Terapi gen merupakan teknik medis revolusioner untuk mengobati berbagai kelainan genetik. Prinsip dasar terapi gen adalah mengatasi akar penyebab penyakit pada tingkat gen dengan memperkenalkan, menonaktifkan, memodifikasi, atau mengedit gen yang dimaksud untuk mengurangi kelainan genetik tertentu. Berbagai jenis teknologi penyuntingan gen manusia yang dikembangkan untuk terapi gen berdasarkan nuklease rekayasa atau nuklease bakteri telah menunjukkan potensi luar biasa untuk mengubah gen manusia yang diinginkan dengan efek samping minimal. Adapun teknologinya yaitu, nuklease efektor mirip aktivator transkripsi (TALEN), nuklease jari seng (ZFN), sistem CRISPR/Cas dan homing endo nuklease atau mega nuklease.

3. Sistem CRISPR/Cas9 CRISPR, singkatan dari "clustered regularly interspaced short palindromic repeats," adalah Sistem CRISPR/Cas dalam dekade terakhir menjadi metode pengeditan gen yang sangat inovatif karena kesederhanaannya, presisi tinggi, cepat, dan lebih hemat biaya dibandingkan teknologi pengeditan gen lainnya. Sistem CRISPR/Cas9 sekarang menjadi metode paling canggih dan sering digunakan untuk pengeditan genom dalam terapi gen. Tipe II CRISPR/Cas9, yang menggunakan protein Cas tunggal dari bakteri Streptococcus pyogenes (SpCas9), adalah yang paling sering digunakan untuk pengeditan gen. Metode ini dikenal sebagai "gunting genetik" dan telah mengubah pendekatan klinis dalam mengobati berbagai gangguan genetik. FDA menyetujui penggunaan terapi gen berbasis CRISPR/Cas9 yang disebut Casgevy untuk mengobati sickle cell disease dan beta thalassemia pada pasien berusia 12 tahun ke atas yang sering mengalami krisis vaso-oklusif. Terapi ini juga mengatasi masalah seperti toksisitas imunogenik dan risiko kanker yang terkait dengan metode terapi gen konvensional.

4. CRISPR/CAS9 sebagai sistem pertahanan pada bakterI STRUKTUR DAN CARA KERJA TEKNOLOGI PENGEDITAN GEN CRIPSR/CAS9

5. bakteriofag (virus yang menyerang bakteri) menginfeksi sel bakteri dengan memasukkan materi genetik asing (antigen asing). Ketika antigen asing (materi genetik dari bakteriofag) terdeteksi, bakteri menghasilkan bagian CRI (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), yang adalah segmen DNA bakteri yang telah menyimpan potongan kecil dari DNA virus sebelumnya. CRISPR RNA (crRNA) kemudian terbentuk sebagai RNA panduan. Bagian ini memuat urutan spesifik yang cocok dengan DNA virus yang pernah menyerang. crRNA ini bekerja bersama dengan gRNA (guide RNA) untuk memandu sistem Cas9 Setelah crRNA/gRNA terikat dengan target DNA asing, mereka memandu Cas9, sebuah enzim yang berfungsi sebagai gunting molekuler. Cas9 mengenali target dengan bantuan urutan PAM (Protospacer Adjacent Motif), yang merupakan urutan pendek DNA yang harus ada di samping target agar Cas9 bisa bekerja. STRUKTUR DAN CARA KERJA TEKNOLOGI PENGEDITAN GEN CRIPSR/CAS9 CRISPR/CAS9 sebagai sistem pertahanan pada bakterI

6. CRISPR/Cas9 adalah sistem yang awalnya digunakan oleh bakteri untuk pertahanan imun, dan kini diadaptasi untuk mengedit genom manusia. Dalam proses ini, dua komponen RNA (crRNA dan tracrRNA) digabung menjadi satu RNA tunggal yang disebut guide RNA (gRNA). RNA ini bertindak seperti "GPS" yang mengarahkan enzim Cas9, yang diambil dari bakteri Streptococcus pyogenes, ke lokasi spesifik dalam genom untuk memotong DNA di dekat urutan PAM yang sesuai. Pemotongan ini menciptakan kerusakan pada DNA untai ganda, yang memungkinkan pengeditan gen di lokasi tersebut. gRNA bisa dibuat secara sintetis di laboratorium sebagai satu untai RNA yang disebut sgRNA, dan urutan targetnya harus mendahului urutan PAM yang spesifik agar Cas9 dapat bekerja. Sistem CRISPR/Cas9 ini dapat mengedit DNA dengan sangat presisi, bahkan hingga level satu pasangan basa. STRUKTUR DAN CARA KERJA TEKNOLOGI PENGEDITAN GEN CRIPSR/CAS9 Mekanisme kerja sistem CRISPR/Cas9 sebagai alat penyuntingan gen

7. Mekanisme kerja sistem CRISPR/Cas9 sebagai alat penyuntingan gen STRUKTUR DAN CARA KERJA TEKNOLOGI PENGEDITAN GEN CRIPSR/CAS9

8. Metode berbasis plasmid: Cas9 dan sgRNA dimasukkan ke dalam plasmid (materi genetik lingkaran kecil) yang memungkinkan ekspresi berkelanjutan di dalam sel. Namun, tantangannya adalah membawa plasmid ke inti sel. Pengiriman mRNA Cas9 dan sgRNA: mRNA Cas9 dan sgRNA dikirim langsung ke dalam sel, tetapi karena mRNA tidak stabil, modifikasi gen hanya bersifat sementara Pengiriman langsung protein Cas9 dan sgRNA: Metode ini cepat, stabil, dan lebih sedikit memicu respon imun dibandingkan metode lainnya, sehingga lebih efisien untuk mengedit gen. STRUKTUR DAN CARA KERJA TEKNOLOGI PENGEDITAN GEN CRIPSR/CAS9 Cara memasukkan CRISPR/Cas9 ke dalam sel target

9. APLIKASI CRISPR/CAS9 Terapi gen CRISPR bisa diberikan in vivo (langsung ke dalam tubuh) atau ex vivo (di luar tubuh, kemudian dimasukkan kembali ke tubuh). Saat ini, ada banyak penelitian dan beberapa uji klinis yang mempelajari penggunaan CRISPR/Cas9 untuk mengobati mutasi genetik tertentu, seperti anemia sel sabit dan fibrosis kistik, mengedit gen penyebab kanker (onko-gen), meningkatkan imunoterapi dengan CAR-T cell therapy, serta mengatasi penyakit menular seperti HIV dan hepatitis B. CRISPR juga sedang diteliti untuk memperbaiki mutasi gen penyebab penyakit saraf seperti Huntington's disease dan gangguan mata bawaan yang menyebabkan kebutaan pada anak-anak (Leber congenital amaurosis). Teknologi ini berkontribusi pada perkembangan pengobatan presisi, yaitu terapi yang disesuaikan dengan profil genetik individu.

10. APLIKASI CRISPR/CAS9 Kelainan darah seperti sickle cell disease (SCD) dan beta thalassemia (TBT) yang bergantung pada transfusi adalah target awal terapi gen berbasis CRISPR. Kedua penyakit ini mempengaruhi hemoglobin dalam sel darah merah (RBC). Dalam uji klinis, fokusnya adalah mengaktifkan kembali gen hemoglobin janin (HbF), yang biasanya hanya ada pada janin dan bayi muda. Mengaktifkan HbF pada pasien SCD atau TBT membantu mengimbangi hemoglobin yang rusak, khususnya di area gen BCL11A BCL11A adalah faktor transkripsi yang menghambat produksi Y-globin dan hemoglobin janin di sel darah merah. Dalam terapi berbasis CRISPR, sekitar 80% alel di lokasi ini berhasil dimodifikasi tanpa efek samping (off-target editing). Setelah myeloablation (penghapusan sel induk di sumsum tulang), pasien SCD dan TBT disuntik dengan sel CD34+ autolog yang sudah diedit menggunakan CRISPR untuk menargetkan enhancer BCL11A. Kedua pasien menunjukkan tingkat pengeditan gen yang tinggi di sumsum tulang dan darah, peningkatan hemoglobin janin, serta tidak lagi memerlukan transfusi. Pada pasien SCD, terapi ini menghilangkan krisis vaso-oklusif, yaitu penyumbatan pembuluh darah kecil yang khas pada penyakit tersebut. GANGGUAN DARAH

11. APLIKASI CRISPR/CAS9 Tujuan utama dari penggunaan CRISPR/Cas9 dalam terapi kanker adalah untuk menghilangkan mutasi gen yang menyebabkan kanker dan memulihkan DNA yang normal di sel-sel kanker. PACT Pharma Inc. di AS mengembangkan T-sel yang direkayasa menggunakan CRISPR untuk 16 pasien dengan berbagai jenis kanker, seperti kanker kepala dan leher, usus besar, kandung kemih, ovarium, prostat, payudara, dan paru-paru yang sudah bermetastasis. Dalam proses ini, CRISPR digunakan untuk memodifikasi T-sel dengan dua cara: Knock-out: Menonaktifkan gen T-sel asli. Knock-in: Menambahkan reseptor T-sel (TCR) khusus yang disesuaikan dengan tumor pasien. T-sel yang telah diedit ini mampu menargetkan mutasi spesifik dari tumor setiap pasien. T-sel tersebut diberi reseptor TCR spesifik neoantigen (neoTCR) yang memungkinkan mereka menginfiltrasi tumor dan membantu mengurangi ukurannya, seperti yang terlihat pada salah satu pasien dalam uji klinis tahap 1 di AS. Ini menunjukkan bahwa CRISPR dapat digunakan untuk mengedit gen T-sel tanpa menggunakan virus, menciptakan T-sel transgenik yang dapat menargetkan tumor secara spesifik. KANKER

12. APLIKASI CRISPR/CAS9 Dalam studi terbaru, teknologi CRISPR telah digunakan untuk memberikan manfaat terapeutik dalam pengobatan COVID-19 melalui produk terapeutik bernama Cas13d. Cas13d adalah enzim CRISPR yang dipandu oleh RNA, khususnya untuk menargetkan dan memotong RNA, yang berasal dari bakteri Ruminococcus flavefaciens. Teknologi ini telah dimanfaatkan untuk mengembangkan sistem antivirus pencegahan yang disebut PAC-MAN (Prophylactic Antiviral CRISPR in human cells), yang dirancang untuk menghancurkan beberapa target RNA secara bersamaan. Hal ini menjadikan Cas13d strategi antivirus spektrum luas yang efektif melawan virus SARS-CoV-2, yang dikenal karena tingkat mutasi dan rekombinasi yang tinggi. Studi ini menyaring dan mendesain RNA CRISPR (crRNA) untuk menargetkan bagian virus yang tetap tidak berubah (konservatif) dan menemukan crRNA yang dapat menargetkan SARS-CoV-2 dengan efektif. Temuan ini juga menunjukkan peran asli CRISPR dalam melawan infeksi virus pada bakteri. Selain itu, platform pengeditan gen, termasuk CRISPR, telah digunakan untuk pengobatan penyakit virus lainnya seperti HIV. Dalam kasus HIV, CRISPR dapat mengubah gen inang seperti CCR5, yang merupakan reseptor kunci yang digunakan oleh virus untuk menginfeksi sel. Terapi ini juga dapat menargetkan gen virus yang diperlukan untuk replikasi virus. Pada tahun 2022, perawatan berbasis CRISPR yang disebut EBT-101 telah diuji dalam uji klinis tahap awal di AS oleh Excision Biotherapeutics. Perawatan ini menggunakan vektor virus AAV9 yang membawa gRNA untuk mengarahkan Cas9 memotong genom HIV di tiga lokasi yang berbeda dalam sel inang, sehingga meminimalkan kemungkinan virus untuk meloloskan diri. Perusahaan Locus Biosciences yang berbasis di AS juga telah menyelesaikan uji coba fase 1b untuk pengobatan infeksi saluran kemih menggunakan terapi CRISPR Cas3 yang disebut LBP-ECO1. Terapi ini menggunakan tiga bakteriophage yang direkayasa dengan CRISPR Cas3, yang dimasukkan langsung ke kandung kemih melalui kateter untuk menargetkan tiga strain utama E. coli yang menyebabkan infeksi saluran kemih. Cas3, seperti Cas9, adalah protein CRISPR yang bertindak seperti "penghancur molekuler" untuk merusak segmen besar DNA. Hasil awal dari terapi ini menunjukkan penurunan signifikan tingkat E. coli tanpa mempengaruhi bakteri baik di kandung kemih peserta. INFEKSI VIRUS DAN BAKTERI

13. Tantangan terbesar adalah bagaimana sistem CRISPR/Cas9 bisa disampaikan secara efektif di dalam tubuh (in vivo). Metode-metode pengiriman yang ada saat ini, seperti menggunakan vektor virus (contohnya adeno-associated virus atau lentivirus), serta metode non-virus seperti nanopartikel berbasis lipid atau polimer, atau metode fisik seperti mikroinjeksi dan elektroporasi, memiliki keterbatasan. Masalahnya termasuk efisiensi yang rendah, potensi memicu reaksi imun, atau kesulitan dalam menargetkan jenis sel atau jaringan tertentu KETERBATASAN DAN TANTANGAN Pembelahan untai DNA yang tidak sesuai target akibat ketidakcocokan PAM dan sgRNA menyebabkan mutasi yang tidak sesuai target dan penataan ulang DNA akibat inversi dan translokasi. Sasaran yang tidak tepat tersebut dapat menyebabkan tumor ganas walaupun kemungkinan terjadinya sangat rendah, tetapi tidak dapat diterima dalam situasi klinis Respons imun ini bisa menghentikan kerja CRISPR/Cas9 sebelum mencapai tujuannya di sel target. Selain itu, vektor virus yang digunakan untuk mengirimkan komponen CRISPR/Cas9 ke sel dapat dikenali sebagai patogen oleh sistem imun, memicu respons inflamasi melalui kekebalan bawaan atau menyebabkan kematian atau disfungsi sel oleh sel T yang bersifat sitotoksik. Ini bisa menurunkan efektivitas terapi CRISPR. Salah satu kekhawatiran utama adalah penggunaan CRISPR/Cas9 untuk mengubah genetika embrio demi menciptakan keturunan dengan karakteristik tertentu, baik secara fisik atau kemampuan, sebuah konsep yang dikenal sebagai eugenika. Jika perubahan dilakukan pada sel-sel germinal (sperma dan sel telur), maka perubahan tersebut akan diwariskan ke generasi berikutnya, yang menimbulkan risiko etis yang serius. Ketakutan ini semakin besar karena liputan media tentang bayi yang diedit dengan CRISPR.

14. KESIMPULAN CRISPR/Cas9 adalah salah satu inovasi bioteknologi paling penting dalam beberapa tahun terakhir, terutama dalam bidang terapi gen. Teknologi ini memungkinkan peneliti untuk mengedit DNA sel secara tepat, baik dengan menghapus, menambahkan, atau mengubah bagian tertentu dari DNA. Cara kerjanya menggunakan enzim bakteri Cas9 yang bertindak sebagai gunting molekuler, dipandu oleh urutan RNA yang didesain khusus untuk memotong bagian DNA yang bermasalah, sehingga dapat memperbaiki mutasi genetik yang menjadi penyebab penyakit. CRISPR/Cas9 lebih spesifik dan efisien dibandingkan metode pengeditan gen sebelumnya, sehingga lebih cocok digunakan dalam terapi gen, yang bertujuan untuk memperbaiki gen cacat yang menyebabkan penyakit. Teknologi ini telah membawa kemajuan revolusioner dalam bidang kedokteran, dengan uji klinis yang sedang berlangsung menawarkan harapan bahkan untuk penyakit yang kompleks seperti penyakit jantung, kanker, dan gangguan neurodegeneratif.

15. Thank you!