Determinación de leghemoglobina

Determinación de leghemoglobina

1. Determinación de
leghemoglobina
BIOGEOQUÍMICA
BIOQUÍMICA, FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMCIA-UBA
DRA. MARÍA FLORENCIA IANNONE
2014

2. Desarrollo de la clase
1- Introducción teórica
2- Explicación del protocolo a desarrollar
3- Hacer extractos vegetales
4- Centrifugación de extractos- Cálculos para
concentración de curva de calibración
5- Discusión de paper (Durante el calentamiento
con ácido oxálico)
6- Espectrofluorómetro
7- Análisis de resultados
8- Informe individual

3. Ciclo del nitrógeno

4. Planta de soja infectada por Bradyrhizobium japonicum.
Interacción selectiva entre especie de Rhizobium y planta leguminosa a infectar

6. Objetivo del TP
Determinar el contenido de leg-hemoglobina en
nódulos de plantas de soja sometidas a estrés
salino y de esta manera, evaluar la fijación de N
2
.

7. Material vegetal
Plantas de Soja de 45 días de crecimiento

Inoculadas con un cultivo líquido (medio de cultivo basal de extracto de
levadura-MBL) de Bradyrhizobium japonicum 10
8
bacterias/ml
Inóculo
Regadas con N
NO
3
-
y NH
4
+
Refuerzo de
inóculo
Regadas sin N
200 mM NaCl.
Sin N
0 7 35 45 días
Cosecha

8. Observaciones a realizar
•Planta entera: diferencias fenotípicas
•Nódulos: morfología
•Interior de nódulos: color rojo (presencia de Leg-Hb)

9. Pesar 0,5g de nódulo y agregar 5ml de Solución A
¿Qué contiene dicha solución?
¿Por qué creen que se realiza el extracto con
esa solución?

10. •Centrifugar 15000 rpm durante 20 min
•40 µl de sobrenadante lo llevan a 200µl con
solución A + 2ml de ácido oxálico
TRIPLICADO
2 tubos (olla a presión 0.75 atm, 40 min)
1 tubo (temperatura ambiente)

11. 2 curvas de calibración Temp amb.
Olla a presión
Estándar: Hemoglobina

12. ¿Por qué creen que los tubos que dejan a
temperatura ambiente son los blancos?

13. Determinación de Leg-hemoglobina se
fundamenta en la técnica descripta por:
LaRue y Child (1979)

Producto fluorescente estableLegHb
Ác oxálico + calor
Hierro

14. ¿Es una técnica
selectiva?

15. Si
debido a que casi todas las
hemoproteínas solubles en el
nódulo son Leg-Hb

16. •Medición en el espectrofluorómetro a λ
excitación
405nm y λ
emisión
650nm
•Cálculos de concentración de legHb.
•Expresión de los resultados como mg de LegHb/g PF de
nódulo
•Nos juntamos a discutir los resultados obtenidos
•Finalmente, realizaran el informe individual

17. ¿Dudas?

18. Bibliografía
Guía de Trabajos Prácticos de Biogeoquímica, Cátedra de
Química Biológica Vegetal, Facultad de Farmacia y
Bioquímica-UBA (2014).
Bothe H, Ferguson SJ y Newton WE (2007). Biology of the
Nitrogen Cycle, ISBN:978-0-444-52857-5.
Udvardi M y Poole PS (2013) Transport and Metabolism in
Legume-Rhizobia Symbioses. Annu. Rev. Plant Biol.
64:781–805.
Xu G, Fan X y Miller AJ (2012) Plant Nitrogen Assimilation
and Use Efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 63:153–182.
Oldroyd GED y Downie JA (2008) Coordinating Nodule
Morphogenesis with Rhizobial Infection in Legumes.
Annu. Rev. Plant Biol. 59:519–546.