(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 86 by Sima Sariaslani and Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780128002629, 012800262X

(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 86 by Sima Sariaslani and Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780128002629, 012800262X
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 86 by Sima Sariaslani and Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780128002629, 012800262X
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 86 by Sima Sariaslani and Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780128002629, 012800262X

1. (Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume
86 by Sima Sariaslani and Geoffrey M. Gadd
(Eds.) ISBN 9780128002629, 012800262X download
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-
volume-86-4633920
Explore and download more ebooks at ebooknice.com

2. Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 90 by Geoffrey
Michael Gadd, Sima Sariaslani ISBN 9780128022757, 0128022752
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-
volume-90-5436310
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 93 by Geoffrey
Michael Gadd, Sima Sariaslani ISBN 9780128022511, 0128022515
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-
volume-93-5431038
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 91 by Geoffrey
Michael Gadd, Sima Sariaslani ISBN 9780128022504, 0128022507
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-
volume-91-5431032
(Ebook) Advances in Applied Microbiology, Volume 75 by Allen I.
Laskin, Geoffrey M. Gadd, Sima Sariaslani ISBN 9780123870469,
0123870461
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-
volume-75-2344590

3. (Ebook) Advances in Applied Microbiology 79 by Sima Sariaslani and
Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780123943187, 0123943183
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-
microbiology-79-4547638
(Ebook) Advances in Applied Microbiology 87 by Sima Sariaslani and
Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780128002612, 0128002611
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-
microbiology-87-4674662
(Ebook) Advances in Applied Microbiology 71 by Allen I. Laskin,
Geoffrey M. Gadd, Sima Sariaslani ISBN 0123809932
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-
microbiology-71-2163578
(Ebook) Advances in Applied Microbiology 74 by Allen I. Laskin,
Geoffrey M. Gadd, Sima Sariaslani ISBN 0123870224
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-
microbiology-74-2382918
(Ebook) Advances in Applied Microbiology by Allen I. Laskin; Sima
Sariaslani; Geoffrey M. Gadd (Eds.) ISBN 9780123748249, 0123748240
https://ebooknice.com/product/advances-in-applied-microbiology-1308100

5. Academic Press is an imprint of Elsevier
525 B Street, Suite 1800, San Diego, CA 92101-4495, USA
225 Wyman Street, Waltham, MA 02451, USA
32 Jamestown Road, London NW1 7BY, UK
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford, OX5 1GB, UK
Radarweg 29, PO Box 211, 1000 AE Amsterdam, The Netherlands
First edition 2014
Copyright©2014 Elsevier Inc. All rights reserved
No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in
any form or by any means electronic, mechanical, photocopying, recording or otherwise
without the prior written permission of the publisher
Permissions may be sought directly from Elsevier’s Science & Technology Rights
Department in Oxford, UK: phone (+44) (0) 1865 843830; fax (+44) (0) 1865 853333;
email:[email protected]. Alternatively you can submit your request online by
visiting the Elsevier web site athttp://elsevier.com/locate/permissions, and selecting
Obtaining permission to use Elsevier material
Notice
No responsibility is assumed by the publisher for any injury and/or damage to persons or
property as a matter of products liability, negligence or otherwise, or from any use or
operation of any methods, products, instructions or ideas contained in the material herein.
Because of rapid advances in the medical sciences, in particular, independent verification of
diagnoses and drug dosages should be made
ISBN: 978-0-12-800262-9
ISSN: 0065-2164
For information on all Academic Press publications
visit our website atstore.elsevier.com
Printed and bound in the USA
14 15 16 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

6. CONTRIBUTORS
Maria Alhede
Department of International Health, Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm
Center, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
Morten Alhede
Department of International Health, Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm
Center, University of Copenhagen, and Department of Clinical Microbiology,
Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark
Fahad Alkhayyat
University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, USA
Thomas Bjarnsholt
Department of International Health, Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm
Center, University of Copenhagen, and Department of Clinical Microbiology,
Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark
Jon S. Blevins
Department of Microbiology and Immunology, University of Arkansas for Medical Sciences,
Little Rock, Arkansas, USA
Ronald P. de Vries
CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherlands
Pina M. Fratamico
USDA, Agricultural Research Service, Eastern Regional Research Center, Wyndmoor,
Pennsylvania, USA
Michael Givskov
Department of International Health, Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm
Center, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark, and Singapore Centre on
Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, Singapore,
Singapore
Ashley M. Groshong
Department of Microbiology and Immunology, University of Arkansas for Medical Sciences,
Little Rock, Arkansas, USA
Nereus W. Gunther IV
USDA, Agricultural Research Service, Eastern Regional Research Center, Wyndmoor,
Pennsylvania, USA
Jos Houbraken
CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherlands
Robert A. Samson
CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherlands
ix

7. James L. Smith
USDA, Agricultural Research Service, Eastern Regional Research Center, Wyndmoor,
Pennsylvania, USA
Jae-Hyuk Yu
University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, USA
x Contributors

8. CHAPTER ONE
PseudomonasaeruginosaBiofilms:
Mechanisms of Immune Evasion
Maria Alhede*
,1
, Thomas Bjarnsholt*
,†
, Michael Givskov*
,{
,
Morten Alhede*
,†
*Department of International Health, Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm Center, University
of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
†
Department of Clinical Microbiology, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark
{
Singapore Centre on Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University,
Singapore, Singapore
1
Corresponding author: e-mail address: [email protected]
Contents
1.Introduction 2
1.1Chronic infections 2
1.2The biofilm in chronic infections 2
2.Biofilm Research Today 6
2.1Pseudomonas aeruginosa 6
2.2Quorum sensing 6
2.3Inhibition of QS 9
2.4Antibiotic tolerance 11
3.The Polymorphonuclear Leukocytes 14
3.1The innate immune system 14
3.2The PMNs 14
3.3Cell death and eDNA 16
4.The Interplay: Biofilm Versus PMNs 16
4.1The laboratory biofilm 16
4.2In vivodevice-related biofilm models 18
4.3The biofilm mode of growth and the innate immune response 19
4.4The“biofilm shield”of rhamnolipids 19
5.Biofilm Infections in Context 22
5.1The CF lung 22
5.2Chronic wounds 24
5.3Otitis media 25
5.4Medical device-related infections 26
6.Concluding Remarks 28
Acknowledgments 29
References 29
Advances in Applied Microbiology, Volume 86 #2014 Elsevier Inc.
ISSN 0065-2164 All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-800262-9.00001-9
1

9. Abstract
The opportunistic gram-negative bacteriumPseudomonas aeruginosais implicated in
many chronic infections and is readily isolated from chronic wounds, medical devices,
and the lungs of cystic fibrosis patients.P. aeruginosais believed to persist in the host
organism due to its capacity to form biofilms, which protect the aggregated,
biopolymer-embedded bacteria from the detrimental actions of antibiotic treatments
and host immunity. A key component in the protection against innate immunity is
rhamnolipid, which is a quorum sensing (QS)-regulated virulence factor. QS is a cell-
to-cell signaling mechanism used to coordinate expression of virulence and protection
of aggregated biofilm cells. Rhamnolipids are known for their ability to cause hemolysis
and have been shown to cause lysis of several cellular components of the human
immune system, for example, macrophages and polymorphonuclear leukocytes
(PMNs). In this chapter, the interplay betweenP. aeruginosaand the PMNs in chronic
infections is discussed with focus on the role of rhamnolipids and extracellular DNA.
1. INTRODUCTION
1.1. Chronic infections
Chronic infections are very difficult if not impossible to completely eradicate
with the present days armory of antibiotics as opposed to acute infections.
A chronic infection is defined as “an infection that persists in spite of anti-
biotic treatments and the action of the innate and adaptive immune system of
the host” (Høiby, Bjarnsholt, Givskov, Molin, & Ciofu, 2010). Chronic
infections are also less aggressive in the initial phase and often develop in
a concealed stage for months or years before clinical symptoms reveal the
presence of the infections (Costerton et al., 2003).
1.2. The biofilm in chronic infections
Bacterial biofilms consist of cells embedded in a self-produced matrix con-
taining extracellular polymeric substances (EPS) such as polysaccharides,
proteins, and DNA (Costerton et al., 2003; Whitchurch, Tolker-Nielsen,
Ragas, & Mattick, 2002; Wingender, Strathmann, Rode, Leis, &
Flemming, 2001). The matrix composition is extremely important for the
properties of the biofilm, since it offers structural stability and has been con-
nected to increased tolerance to antimicrobials and immune cells
(Anderson & O’Toole, 2008; Ma et al., 2009; Mulcahy, Charron-
Mazenod, & Lewenza, 2008; Stoodley, Sauer, Davies, & Costerton,
2002). Historically, the presence of biofilms was acknowledged in industrial
2 Maria Alhede et al.

10. and environmental ecosystems as well as in dentistry before they were cor-
related to the clinical setting. In the 1970sHøiby (1977)showed aggregating
bacteria in the sputum from cystic fibrosis (CF) patients and together with
electron microscopy images of biofilms in device-related infections
(Marrie & Costerton, 1984; Marrie, Noble, & Costerton, 1983), the low
efficiency of antibiotics and immune cells was suddenly explained. Since
the 1980s, the research in bacterial biofilms in the medical setting has
increased dramatically (seeFig. 1.1).
The biofilm mode of growth protects the bacteria from otherwise lethal
and harsh conditions provided by the host or the surrounding environment
(Costerton, Stewart, & Greenberg, 1999). In clinical settings, the presence of
biofilms is most often associated with chronic infections (long-term infec-
tions) due to its tolerance toward antimicrobial agents and host defense
(Høiby, Bjarnsholt, et al., 2010). In contrast, acute bacterial infections are
short-term because they involve susceptible, planktonic bacteria (single
cells) (Høiby, Bjarnsholt, et al., 2010).
1.2.1 Antibiotic tolerance of the biofilm
Treatment with antibiotics has saved millions of lives over the past 70 years,
but the development and increase in the frequency of bacterial infections
Figure 1.1Biofilm publications. Search result by year of the term“Biofilm”on
Pubmed.gov.
3P. aeruginosaVersus PMNs

11. together with increasing resistance to antibiotics was not the foreseen out-
come with the introduction of penicillin in the 1940s. The ability to with-
stand antimicrobial agents relies roughly on two separated mechanisms,
those that confer antimicrobial resistance and those of antimicrobial toler-
ance. Mechanisms of resistance encompass inherited features that directly
obstruct the functionality or efficacy of antimicrobials (for more informa-
tion, seeBeceiro, Tomas, & Bou (2013)). Resistance mechanisms allow
bacteria to actively grow and proliferate in the presence of antibiotics.
Tolerance on the other hand refers to the ability to survive exposure to anti-
microbials. Most antibiotics were identified due to their capacity to inhibit
bacterial growth. Many bacteria that display sensitivity during growth to a
certain antibiotic may in stationary conditions show tolerance: that is, they
are not eradicated by exposure to otherwise lethal concentrations of the
drug. This is often observed when the bacteria are present in the biofilm
mode of growth (Bjarnsholt, Jensen, Burmølle, et al., 2005; Pamp,
Gjermansen, Johansen, & Tolker-Nielsen, 2008).
1.2.2 Aggregates represent the biofilm mode of growth
From 1999 onwards, a biofilm was considered as “a structured community of
bacterial cells enclosed in a self produced polymeric matrix and adherent to an inert
or living surface”(Costerton, Lewandowski, Caldwell, Korber, & Lappin-
Scott, 1995; Costerton et al., 1999). This is still the generally acknowledged
definition supported by the view that biofilm infections were considered to
reside on surfaces such as those offered by medical devices and the lung
epithelia. However, with the increased knowledge of the biofilm mode
of growth, the definition of a biofilm has been thoroughly debated.
A study byBjarnsholt, Jensen, et al. (2009)indicated that the biofilms found
in the CF lung were not adhering to the lung epithelia, but rather adhering
to fellow bacteria forming aggregates embedded in mucus (Fig. 1.2A and C).
In addition, Alhede et al. (2011) andHaaber, Cohn, Frees, Andersen, and
Ingmer (2012)have contributed to the understanding of nonsurface-
attached aggregates as biofilms by showing thatin vitrogrown bacterial
aggregates show similar levels of tolerance to antibiotic treatments and
polymorphonuclear leukocytes (PMNs) as surface-attached biofilms. Fur-
thermore, antibiotic tolerance in the biofilm aggregates was shown to be
reversible due to its dependency of physical properties, which is in contrast
to resistance, which is irreversible. Besides CF patients, nonattached
bacterial aggregates have also been found in other chronic infections
4 Maria Alhede et al.

12. (Burmølle et al., 2010) such as chronic wounds (Gjødsbøl et al., 2006;
Kirketerp-Møller et al., 2008) and middle ear infections (Homoe,
Bjarnsholt, Wessman, Sørensen, & Johansen, 2009).
Since in all cases highly tolerant aggregates were observed independent
of attachment to a surface, aggregates were suggested to represent the bio-
film mode of growth, which has been the case in environmental microbi-
ology for decades (Teske & Stahl, 2002). With background in the two
studies byBjarnsholt, Jensen, et al. (2009)andAlhede et al. (2011),a
new definition of biofilms was proposed:“aggregated, often sessile bacteria,
which differ from free floating cells by slow growth and tolerance to antibiotics
and immune cells”(Alhede et al., 2011). Anin vitrogrown aggregate is
shown inFig. 1.2BandD.
Figure 1.2Images ofP. aeruginosaaggregates from (A) a CF lung, (B)in vitrostationary
culture formation of aggregates, (C) aggregate ofP. aeruginosain CF lung (red due to
specific PNA-FISH stain) surrounded by PMNs (blue, DAPI stain), (D) SEM images of an
aggregate grownin vitroas a stationary culture for 48 h. Part (C) is adopted from
Bjarnsholt, Jensen, et al. (2009)and reproduced by permission from John Wiley & Sons,
Inc. Part (B) was adopted fromAlhede et al. (2011).
5P. aeruginosaVersus PMNs

13. 2. BIOFILM RESEARCH TODAY
2.1. Pseudomonas aeruginosa
As seen inFig. 1.1, research in medical-related biofilms has evolved in latter
years.Pseudomonas aeruginosais the preferred model organism due to its
inherent biofilm-forming capacity and to its wide presence in infections.
P. aeruginosais a gram-negative bacteria belonging to theg-proteobacteria.
It is found in environments such as soil, water, plants, and common food
(Hardalo & Edberg, 1997). When the genome ofP. aeruginosawas sequenced
(Stover et al., 2000), it revealed a large genome consisting of 6.3 million base
pairs with 5570 open reading frames (ORFs). The large number of ORFs is
likely to contribute to the multitude of survival mechanisms against antibiotic
treatments as well as the host’s immune system.
The bacterium primarily infects hospitalized and immunocompromised
humans. In hospitalized patients, such as thermally injured patients, infection
withP. aeruginosais life threatening and has a rapid progression as seen with
acute infections.P. aeruginosaalso cause ventilator-associated pneumonia
(VAP) in intubated patients and bacterial pneumonia in patients with
HIV (Afessa & Green, 2000; Heininger, Krueger, Doring, & Unertl,
2002). ChronicP. aeruginosainfections are in particular common in patients
at intensive care units and are the most frequent gram-negative etiologic
agent associated with infections of indwelling catheters and foreign-body
implants (Brouqui, Rousseau, Stein, Drancourt, & Raoult, 1995). The bac-
terium causes chronic infections in the respiratory tracts of 80% of adults
with the genetic disorder CF (Bjarnsholt, Jensen, et al., 2009; Emerson,
Rosenfeld, McNamara, Ramsey, & Gibson, 2002; FitzSimmons, 1993;
Schaedel et al., 2002), in organ tissues such as hearts (endocarditis)
(Reyes & Lerner, 1983), middle ears (otitis media) (Jang & Park, 2003),
paranasal sinuses (rhinosinusitis) (Oncel, Pinar, Sener, Calli, & Karagoz,
2010), chronic wounds (Fazli et al., 2009), caries (El-Solh et al., 2004),
osteomyelitis (Sapico, 1996), and intravenous catheters and stents
(Tacconelli, Smith, Hieke, Lafuma, & Bastide, 2009).
2.2. Quorum sensing
Due to the high density of cells in biofilms,P. aeruginosais able to utilize its
cell-to-cell communication (quorum sensing (QS)) system. The QS system
ofP. aeruginosahas been shown to regulate the expression of 136 core-genes
6 Maria Alhede et al.

14. (Hentzer, Eberl, & Givskov, 2005; Hentzer, Wu, et al., 2003; Schuster,
Lostroh, Ogi, & Greenberg, 2003; Wagner, Bushnell, Passador,
Brooks, & Iglewski, 2003), which encode many secreted and excreted vir-
ulence factors that play a role in the tolerance to antibiotics and the host
immune system (Lory & Tai, 1985; van Delden & Iglewski, 1998). The QS
network inP. aeruginosaemploys twoN-acyl-
L-homoserine lactone (AHL)
signal molecule-based QS systems denotedlasandrhl. Both systems are orga-
nized with transcriptional regulators, LasR and RhlR, and synthetases, LasI
and RhlI, that produce the signal moleculesN-(3-oxododecanoyl)-
L-
homoserine lactone (3-O-C
12-HSL) andN-butanoyl- L-homoserine lactone
(C
4-HSL), respectively (Passador, Cook, Gambello, Rust, & Iglewski,
1993; Pearson et al., 1994; Pearson, Passador, Iglewski, & Greenberg,
1995). In addition to the AHL-based QS systems,P. aeruginosaalso employs
the 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone known as thePseudomonasquinolone
signal (PQS). ThepqsABCDElocus generates the biosynthetic precursor 2-
heptyl-4-quinolone, which is converted into PQS by PqsH (Diggle,
Cornelis, Williams, & Camara, 2006). The QS systems ofP. aeruginosahave
been shown to be hierarchically arranged with thelassystem controlling
therhlsystem (Latifi, Foglino, Tanaka, Williams, & Lazdunski, 1996; Pesci,
Pearson, Seed, & Iglewski, 1997), and the PQS system positioned between
thelasandrhlsystems (Pesci et al., 1999). It has been found that the PQS system
controls the activation of therhlsystem independently of thelassystem (Diggle
et al., 2003; Skindersø et al., 2008).
P. aeruginosaQS-activated virulence factors include elastase (Kharazmi,
Høiby, Do¨ring, & Valerius, 1984), lipopolysaccharide (LPS) ( Kronborg,
Fomsgaard, Galanos, Freudenberg, & Høiby, 1992), alginate (Pedersen,
Høiby, Espersen, & Koch, 1992), iron (Hentzer, Eberl, et al., 2005), and
rhamnolipids (Bjarnsholt, Jensen, et al., 2010).
2.2.1 Rhamnolipids
The QS-activated virulence factors rhamnolipids are known for their heat-
stable extracellular hemolytic properties (Johnson & Boese-Marrazzo,
1980). Rhamnolipids are a class of glycolipids produced byP. aeruginosa
and have the properties of biosurfactants. However, rhamnolipid functions
also covers solubilization, modification of surface properties, stimulation of
bacterial motility, formation and disruption of biofilms, virulence and anti-
microbial activity. Multiple roles of rhamnolipids have been uncovered, but
the reason and mechanics behind their production still remain unclear
(Chrzanowski, Lawniczak, & Czaczyk, 2012). There are two main classes
7P. aeruginosaVersus PMNs

15. of rhamnolipids, mono- and di-rhamnolipids (Abdel-Mawgoud, Lepine, &
Deziel, 2010; Rendell et al., 1990). Di-rhamnolipid was discovered by Jarvis
and Johnsen (1949) in the attempt to find compounds with antibacterial
activity. They established that rhamnolipid consisted of two units each of
an
L-rhamnose and a 1-b -hydroxydecanoic acid. In 1965 the full structure
of rhamnolipid was determined by Edwards and Hayashi (1965) with the
elucidation of the linkage of the rhamnose moieties being a 1,2-linkage.
The synthesis of rhamnolipids inP. aeruginosaproceeds by two sequential
glycosyl transfer reactions, each catalyzed by a specific rhamnosyltransferase
(Burger, Glaser, & Burton, 1963). One rhamnosyltransferase is encoded by
therhlABoperon and is responsible for the formation of the mono-
rhamnolipids whereas RhlA alone generates the lipid component,
b-hydroxyalkanoyl-b-hydroxyalkanoyl acyl carrier protein (HAA-ACP).
This lipid component of rhamnolipids is generated by utilizing
b-hydroxyacyl-ACP intermediates from the fatty acid synthesis (Zhu &
Rock, 2008). rhlBis hypothesized to encode the catalytic subunit of the
rhamnosyltransferase and is suggested to catalyze the conversion of HAA-
ACP to mono-rhamnolipid (Ochsner, Koch, Fiechter, & Reiser, 1994;
Zhu & Rock, 2008). A second rhamnosyltransferase is encoded by therhlC
gene and converts mono-rhamnolipids to di-rhamnolipids (Ochsner et al.,
1994). Both RhlA and B are encoded and coexpressed within therhlABRI
regulon (Sullivan, 1998), which is under control of QS (Mu¨ller et al., 2012).
Hence, the expression of therhlABoperon and therhlCgene is coordinately
regulated by therhlQS and PQS systems (Rahim et al., 2001).
2.2.2 Extracellular DNA
As mentioned previously, the matrix is very important for the properties of
the biofilm, by offering structural stability and tolerance to antimicrobials
and immune cells (Anderson & O’Toole, 2008; Ma et al., 2009; Mulcahy
et al., 2008; Stoodley et al., 2002).
The matrix contains extracellular EPS such as polysaccharides, proteins,
and DNA (Costerton et al., 2003; Whitchurch et al., 2002; Wingender et al.,
2001). Extracellular DNA (eDNA), which is a matrix component of both
gram-positive and gram-negative bacterial biofilms (Allesen-Holm et al.,
2006; Qin et al., 2007), has been shown to be an important part of the
biofilm structure (the matrix) as a stabilizer inin vitrogrownP. aeruginosa
biofilms (Whitchurch et al., 2002). The generation of eDNA in
P. aeruginosawild-type biofilms appears to be linked to QS via a mechanism
8 Maria Alhede et al.

16. that results in lysis of a small subpopulation of the cells (Allesen-Holm et al.,
2006; Barken et al., 2008).
Evidence for a role of eDNA as a matrix component inP. aeruginosabio-
films was shown by applying DNase to the growth medium of a forming
biofilm, which prevented the formation of a mature biofilm. However,
the DNase treatment did not have any impact on older biofilms
(Whitchurch et al., 2002) or on biofilms formed by mucoid P. aeruginosa
(Yang et al., 2012).
eDNA has also been found inin vitrogrown aggregates ofP. aeruginosa
(Alhede et al., 2011) and by means of confocal scanning laser microscope
(CSLM) and fluorescent staining eDNA was easily visualized. In the
in vitrostudy by Alhede et al. (2011) scanning electron microscopy (SEM)
images revealed a whole mesh of wire-like structures and it was speculated
that these wires may represent eDNA. DNase treatment did not result in
complete removal of the wire-like structures seen on the SEM images
but they were clearly absent on the fluorescent images. Hence, although
appearing similar to DNA (i.e., salmon sperm (van Gennip et al., 2012)),
the wire-like structures seen on the SEM images must contain additional
molecular structures besides DNA, in order to be protected from DNase
treatment. The matrix of biofilms and aggregates has also been shown to
contain mannose-rich polysaccharides such as Psl and could possibly be a
part of the fibers visualized on the SEM images (Alhede et al., 2011).
2.3. Inhibition of QS
Proof of concept of inhibition of QS as an antimicrobial strategy was deliv-
ered byHentzer, Eberl, Nielsen, and Givskovv (2003)for treatment of
infections withP. aeruginosa. Loss of QS is one of the dominating changes
that occur inP. aeruginosaduring its adaptive process in the CF lung
(D’Argenio et al., 2007). EspeciallylasRmutants have frequently been iso-
lated from the CF lung (Bjarnsholt, Jensen, et al., 2010; D’Argenio et al.,
2007; Smith et al., 2006), which prompted the question if QS-regulated vir-
ulence factor is important in the CF lung. However, a recent investigation
showed that the early colonizers of children with CF have functional QS
systems. Later, LasR-dependent QS is lost, but the strains are still able to
express rhamnolipids due to maintenance of RhlR-dependent QS regula-
tion (Bjarnsholt, Jensen, et al., 2010). These findings were in correlation
to the finding by DeKimpe and De´ziel (2009) that the expression of the
rhlsystem is only delayed inlasRmutants since RhlR is able to activate
9P. aeruginosaVersus PMNs

17. LasR-regulated genes in the absence oflasR. This results in the production
of multiple virulence determinants such as rhamnolipids during the late sta-
tionary phase and possibly also late-stage infections.
The activation of the RhlR in the absence of the LasR has recently
been attributed to the chemical signal IQS (2-(2-hydroxyphenyl)-
thiazole-4-carbaldehyde). IQS is active under settings with low phosphate
which could be a phenomenon found in the CF lung (Lee et al., 2013).
Phosphate depletion has been shown to activate a lethal phenotype in
P. aeruginosaduring intestinal colonization (Zaborin et al., 2009).
The increasing use of antibiotics paralleled by increasing occurrence of
multidrug-resistant bacteria is leaving traditional antimicrobial treatments
ineffective (Hentzer, Eberl, et al., 2003; Hentzer & Givskov, 2003). The
need for novel antimicrobials is thus urgent and many new targets are inves-
tigated including inhibition of QS. Conventional antibiotics possess relative
broad-range efficacy via toxic or growth inhibitory effects whereas QS
inhibitors (QSIs) function as an anti-pathogenic drug with less selection
for growth inhibition and thereby for resistant bacteria. Moreover,
inhibiting the bacterial communication should leave the communities of
beneficial bacteria (e.g., the gut flora) unharmed in the host (Hentzer,
Eberl, et al., 2003). Hentzer, Wu, et al. (2003), Wu et al. (2004)and
Christensen et al. (2007)demonstrated that QS could be used as an effective
antimicrobial drug target in different mouse models of biofilm infection. By
using the chemically modified QSI furanone C-30 as treatment, the toler-
ance of thein vivobiofilms was altered and a faster clearance ofP. aeruginosa
was promoted. Furanone C-30 and C-56 are chemically modifications of
the natural furanones produced by the Australian red microalgaeDelisea
pulchra,which was proven to inhibit AHL-regulated phenotypes in bacteria
(Givskov et al., 1996). The furanones C-30 and C-56 were extremely
important as experimental QSI drugs to deliver proof of concept, but both
compounds were highly reactive (i.e., being halogenated) and therefore not
suited for treatment of infections in humans (Hentzer, Eberl, et al., 2003;
Hentzer et al., 2002).
A large amount of work has been put in to screening for QSIs in food,
herbal, and fungal sources. Fresh samples, crude extracts, and pure QSI com-
pounds have been investigated using high-throughput screening assays
(Rasmussen, Bjarnsholt, et al., 2005; Rasmussen, Skindersoe, et al., 2005).
Especially, the crude garlic extract showed promising results by inhibiting
the expression of a large number of QS-controlled genes inP. aeruginosa
(Rasmussen, Bjarnsholt, et al., 2005). Due to the promising results, crude
10 Maria Alhede et al.

18. garlic extract was also tested in a pulmonary infection model in mice and
showed a significantly better clearance in the treatment group compared to
the placebo group. In addition, 5 years later in a study byHarjai, Kumar,
and Singhh (2010), garlic extract showed a significantly reduced renal bacterial
content ofP. aeruginosaat day 5 postinfection in a urinary tract infection mouse
model. Garlic has been used as a natural remedy for many years and commer-
cial garlic capsules were tested in CF patients as a pilot study and published in
2010 (Smyth et al., 2010). Although not significant, they showed an improve-
ment of lung function, weight, and symptom score.
In addition to crude garlic extract natural products have provided several
functional QSIs, among them theDelisea pulchrafuranones (Hentzer et al.,
2002), patulin fromPenicillium coprobium(Rasmussen, Skindersoe, et al.,
2005), iberin from horseradish (Jakobsen, Bragason, et al., 2012), and ajoene
from garlic ((Jakobsen, van Gennip, et al., 2012).
2.4. Antibiotic tolerance
Since the days of Koch and his fellow researchers, bacteria have been studied
in shaken cultures and most often in exponential growth, that is, the arche-
type of the planktonic life form where they are free floating cells. These
growing, planktonic cultures have been the basis for antibiotic screenings
neglecting the biofilm mode of growth for decades. With the realization
of biofilms in chronic infections, tolerance to antibiotics was added to the
challenges for these types of infections.
The antibiotic tobramycin is an effective killing agent against
P. aeruginosa(Meyer, Young, & Armstrong, 1971) and is used in the treat-
ment ofP. aeruginosain CF patients.
Resistance inP. aeruginosato tobramycin has been reported (Holmes,
Minshew, Gould, & Sanford, 1974); however, the development of resis-
tance to tobramycin inP. aeruginosaisolates from CF patients seems to be
a slow process and no significant difference in minimum inhibitory concen-
tration (MIC) was found between isolates (from the same patient) isolated in
1985 and 1991 (Ciofu, Giwercman, Pedersen, & Høiby, 1994 ).
In the Copenhagen CF Centre, the usual antibiotic maintenance therapy
of CF patients with chronic infections involves intravenous (i.v.) courses
with an aminoglycoside such as tobramycin and a beta-lactams every third
month combined with daily colistin inhalations and oral azithromycin
between i.v. courses in order to suppress the chronic infection
(Frederiksen, Koch, & Høiby, 1999; Hansen, Pressler, Koch, & Høiby,
11P. aeruginosaVersus PMNs

19. 2005). The combination of systemic and nebulized antibiotics is used in
order to treat both the conductive zone and the respiratory zone of the lungs.
Nebulized tobramycin and colistin and other antibiotics provide very high
concentrations in the conductive zone, whereas very little antibiotic reaches
the respiratory zone. On the contrary, when antibiotics are administered i.v.
or orally, very low concentrations are found in the sputum, but high con-
centrations are found in the respiratory tissue since an i.v. bolus of antibiotics
is transported directly by the blood to the alveolar capillaries before being
distributed to the rest of the body (Høiby, 2011). The antibiotic treatment
regime described above improves the lung function, symptoms of possible
acute pulmonary exacerbations are relieved, and the quality of life of CF
patients improves. Nonetheless, the antibiotic treatment regime does not
eradicate the bacteria, but reduces the mortality (Govan & Nelson, 1993;
Høiby et al., 1982; Martin, Smalley, George, Healing, & Anderson,
1980). Even though the survival of CF patients has increased markedly with
the employed treatments regimes, there is still a great need for novel ther-
apeutic strategies.
Bacteria residing withinin vitrobiofilms have been shown to be very het-
erogeneous with regards to growth rate and matrix components, which can
be correlated with their tolerance to antibiotics (Alhede et al., 2011; Pamp
et al., 2008; Walters, Roe, Bugnicourt, Franklin, & Stewart, 2003). In a bio-
film study, it was shown thatP. aeruginosatolerated a 20-fold higher
tobramycin concentration compared to planktonic cells (Nickel, Ruseska,
Wright, & Costerton, 1985). Since tobramycin target active metabolism
it only results in killing of the active outer part of the biofilm, in contrast
to the inner part with low metabolism.In vitroboth ciprofloxacin and
tobramycin fail to eradicate the entire biofilm, which were suggested to
be due to low metabolic activity and the anaerobic nature of the inner bio-
film (Walters et al., 2003). However, targeting both the active metabolism
and low metabolism parts of a biofilm (e.g., with combinations of antibi-
otics) has been shown to significantly increase the killing of the biofilm
(Pamp et al., 2008).
Thus, no single antibiotic is able to eradicate an established chronic
P. aeruginosabiofilm infection and often, even combinations of different classes
of antibiotics will fail (Christensen et al., 2012; Høiby et al., 2011; van Gennip,
Moser, et al., 2009). The understanding of the protective role of the biofilm in
relation to chronic infections has lead to a divergence in guidelines of how to
treat acute and biofilm infections (Hall-Stoodley et al., 2012). Since it has been
shown that it is possible to eradicate initial infection with nonmucoid
12 Maria Alhede et al.

20. P. aeruginosaby applying early aggressive anti-pseudomonas treatment in CF
patients (Douglas et al., 2009; Frederiksen, Koch, & Høiby, 1997; Gibson
et al., 2007; Littlewood, Miller, Ghoneim, & Ramsden, 1985; Ratjen,
Do¨ring, & Nikolaizik, 2001; Valerius, Koch, & Høiby, 1991), one strategy
for preventing biofilm infections is early aggressive treatment before the bio-
film is formed. However, when the biofilm is established and if it cannot be
removed physically, chronic suppressive antibiotic treatment has been shown
to be the best strategy (Høiby, Bjarnsholt, et al., 2010).
Biofilm tolerance to tobramycin has been shown to be QS-dependent.
Treating a QS-deficientP. aeruginosaleads to efficient killing of anin vitro
biofilm (Bjarnsholt, Jensen, Burmølle, et al., 2005). In addition to
growth-dependent tolerance mechanisms, slow penetration and binding
of antimicrobials are contributing to biofilm tolerance. Especially, periplas-
mic glucans produced byP. aeruginosa(Mah et al., 2003) and eDNA in spu-
tum from CF patients (Hunt, Weber, Berger, Ramsey, & Smith, 1995) have
been shown to bind to tobramycin, and thereby prevent it from reaching its
site of action. Mulcahy et al. (2008) identified a novel role for eDNA in
P. aeruginosabiofilms, where its ability to chelate cations serves to impose
a cation limitation on cells and induces expression of genes essential for anti-
biotic tolerance and immune system evasion. Especially, an induced
aminoglycoside tolerance inP. aeruginosabiofilms is a result of the DNA-rich
environment in the biofilms (Mulcahy et al., 2008). This was recently con-
firmed in a study by Chiang et al. showing that eDNA contributes to
aminoglycoside tolerance inP. aeruginosa in vitrobiofilms by acting as an anti-
microbial shield (Chiang et al., 2013).
2.4.1 Antibiotics as QSIs
Conventional antibiotics have been shown to exert strong QS-inhibitory
activity (Skindersø et al., 2008; Tateda et al., 2001). A range of antibiotics
was examined for their effects on QS-regulated virulence factor production
inP. aeruginosaand three (i.e., azithromycin, ceftazidime, and ciprofloxacin)
showed significant inhibition of several QS-regulated virulence genes
including rhamnolipids (Hoffmann et al., 2007; Skindersø et al., 2008).
Macrolides such as the erythromycin derivative azithromycin have been
shown to inhibit the enzymatic activity of guanosine diphosphomannose
dehydrogenate in the alginate biosynthetic pathway of mucoid
P. aeruginosastrains at concentrations well below the MIC (Ichimiya
et al., 1996). Several clinical studies have shown that long-term treatment
with azithromycin improves lung function and body weight in patients with
13P. aeruginosaVersus PMNs

21. CF (Equi, Balfour-Lynn, Bush, & Rosenthal, 2002; Saiman et al., 2003),
which could be attributed to its QSI effect.
In addition, it has been suggested that azithromycin treatment inhibits
PMN recruitment to the lung by reducing the levels of expression of
proinflammatory cytokines and inhibition of PMN migration, resulting in
a significant reduction in airway-specific inflammation (Tsai et al., 2004).
3. THE POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES
3.1. The innate immune system
Innate immunity provides the host with the ability to respond within
minutes or hours after infection. Host cells express a range of receptors that
act as microbial sensors. These receptors sense microorganisms and transduce
signals that activate immune responses. Molecular alarm signals generated in
response to tissue damage and/or a microbial invasion are recognized by
antigen-presenting cells such as macrophages or dendritic cells. Host cells
use several strategies to recognize specific pathogen-associated molecular
patterns (PAMPs) and damage-associated molecular patterns (DAMPs) in
order to alert the immune system. The aim is to activate innate and adaptive
immune responses, eliminate the encountered pathogens, and establish
long-lasting protective immunity against them. PAMPs and DAMPs are
sensed by pattern recognition receptors (PRRs). Several types of PRRs
and their corresponding ligands are known but PRRs specific for
biofilm-growing microorganisms have not yet been identified (Jensen,
Givskov, Bjarnsholt, & Moser, 2010). The best-characterized PRRs are
Toll-like receptors (TLRs), which have evolved to recognize PAMPs from
fungi, bacteria, viruses, and parasites. TLR3, TLR7, TLR8, and TLR9
detect microbial nucleic acids, whereas TLR2, TLR4, and TLR5 recognize
lipoproteins, LPS, and flagellin, respectively. Another family of PRRs is the
NOD-like receptors, which detect bacterial and viral molecules in the cyto-
plasm. Among the members of this family are NOD1 and NOD2, where
NOD1 has been shown to recognize the peptidoglycan ofP. aeruginosa.
NODs also trigger the secretion of inflammatory cytokines (Diacovich &
Gorvel, 2010; Soehnlein & Lindbom, 2010).
3.2. The PMNs
PMNs constitute the most abundant of the circulating leukocytes. The esti-
mated time that PMNs spend in circulation has been debated. Recently,
14 Maria Alhede et al.

22. their expected lifespan was extended more than 10-fold from an average of
5–10 h to 5.4 days (Pillay et al., 2010). PMNs have acquired several names
through the years. Paul Ehrlich coined the term “neutrophil” due to a ten-
dency to retain neutral dyes and Metchnikoff called them PMNs due to the
lobulated nucleus (Amulic, Cazalet, Hayes, Metzler, & Zychlinsky, 2012).
The major role of the PMNs in acute inflammation is to phagocytize
microorganisms and foreign materials. The PMNs are normally the first
phagocytes to appear in high numbers at the site of infections (Nathan,
2006) and they are recruited from the blood in response to a number of sig-
nals (Downey, Bell, & Elborn, 2009). Arriving at the site of infection PMNs
start to phagocytize invading or colonizing bacteria and contribute to the
generation of inflammation. The process of phagocytosis involves recogni-
tion of the injurious agent followed by PMNs attachment, engulfment, and
killing or degradation. The resolution of inflammation involves PMNs
undergoing apoptosis and engulfment by macrophages of the dying PMNs.
However, in absence of the macrophages the granule content and fragmen-
ted PMNs lead to the release of toxic compounds such as elastase, oxidants,
and nuclear DNA which cause increased inflammation (Cox, Crossley, &
Xing, 1995).
The activation of PMNs leads to the expression of antimicrobial activities
including the controlled release of granule components, that is, crucial for an
effective innate immunity (Silva, 2011). Granules, the hallmark of
granulocytes, are stores of proteins that can kill microbes and dissolve tissues.
The granules are classified into three distinct subsets based on the presence of
characteristic granule proteins. The largest are the primary or azurophilic
granules that contain the enzyme myeloperoxidase (MPO). MPO is impor-
tant in the oxidative burst that is an increase in oxygen consumption in acti-
vated PMNs. Production of reactive oxygen species (ROS), such as
hydrogen peroxide and superoxide, is most prominent in PMNs compared
with macrophages. ROS are produced as a consequence of NADPH oxidase
activity, which pumps superoxide (O
2
) into the phagocytic vacuole (Segal,
2005). In CF sputum there is also a formation of O
2
resulting in a depletion
of O
2(Kolpen et al., 2010). The primary granules also contain defensins,
lysozyme, and other antimicrobial compounds. The secondary or specific
granules contain the glycoprotein lactoferrin but also a wide range of
other antimicrobials. The last subset is the tertiary or gelatinase granules,
which only contain a small subset of antimicrobials but serve as storage
for a number of metalloproteases (Amulic et al., 2012; Borregaard,
Sørensen, & Theilgaard-Monch, 2007).
15P. aeruginosaVersus PMNs

23. 3.3. Cell death and eDNA
Apoptotic PMNs undergo a programmed cell death, which involves
removal from the inflamed site by macrophages and thereby tissue homeo-
stasis is maintained. When PMNs undergo a necrotic cell death due to cell
injury by, for example, rhamnolipids (Jensen et al., 2007), the cellular con-
tent will be released and contributes to the tissue damage (Berger, 1991).
Besides apoptosis and necrosis, two new terms regarding death of PMNs
have been described in the literature during the last decade: secondary
necrosis (Silva, 2010) and NETosis (Steinberg & Grinstein, 2007). Second-
ary necrosis distinct itself from primary necrosis when the macrophages fail
to clear the apoptotic cells and thereby release products that generate
proinflammatory signals (Amulic et al., 2012). NETosis is a form of cell
death that occurs during the formation of neutrophil extracellular traps
(NETs) (Brinkmann et al., 2004), which is a release of nuclear DNA-
containing antimicrobials from the PMNs in order to kill bacteria
(Brinkmann et al., 2004; Pilsczek et al., 2010). However, recently Yipp
et al. (2012) showed that PMNs release NETs without cell lysis in the fight
against gram-positive infections.
Interestingly, the DNA-like structures observed by Alhede et al. (2011)
have also been observed in a biofilm developedin vivoin a study by van Gen-
nip et al. (2012). Since thesein vivobiofilms were intermingled with dead
PMNs, the origin of the eDNA was put into question. Due to its present
inin vitrobiofilm it seems likely that the eDNA originates from the bacteria,
but it remains to be fully elucidated since PMNs also have been shown to
release DNA.
4. THE INTERPLAY: BIOFILM VERSUS PMNs
4.1. The laboratory biofilm
In order to understand the biofilm mode of growth in thein vivosetting, the
biofilm lifestyle ofP. aeruginosahas been studied intensively in laboratory
settings as surface-based biofilms. Assays using microtiter plates in combina-
tions with crystal violet have been developed to study surface-attracted
biofilm-forming bacteria (Pitts, Hamilton, Zelver, & Stewart, 2003). The
continuous-culture once-through flow cell system in combination with
CSLM has contributed greatly to our understanding ofP. aeruginosabiofilms
and with this system it was shown that sessile bacteria grow in matrix-
embedded microcolonies interspersed with fluid channels (Christensen
16 Maria Alhede et al.

24. et al., 1999; Lawrence, Korber, Hoyle, Costerton, & Caldwell, 1991).
Microscopic investigations of biofilm development on a surfacein vitrowere
shown to involve five steps and these steps have often been depicted in car-
toons. The model inFig. 1.3A was presented by Stoodley et al. (2002).
Unfortunately, thein vitrosystems lack important players such as the
immune systems, which also are present in chronic infections.
Figure 1.3B and C gives a visualization of anin vitroandin vivogrown biofilm
obtained with SEM. We have found several major differences between the
two types of biofilms especially one being the formation of mushrooms.
Figure 1.3Development of surface-attached biofilms. (A) Microscopic investigation
showing the development of a biofilm as a five-stage process (Stoodley et al., 2002).Stage
1: initial attachment of cells to the surface.Stage 2:productionofEPSresultinginmore
firmly adhered“irreversible”attachment.Stage 3: early development of biofilm architec-
ture.Stage 4: maturation of biofilm architecture.Stage 5: dispersion of single cells from the
biofilm. (B) SEM images showing three steps in the development of anin vitrocontinuous-
culture once-through flow cell biofilm. The images were obtained 1.5, 24, and 72 h post-
inoculation. (C) SEM images showing three steps in the development of anin vivobiofilm
on a silicone tube. Images were obtained 6, 24, and 72 h post-insertion in the peritoneal
cavity of a mouse. The arrows point to PMNs.Picture of implant in Figure C Copyright©
American Society for Microbiology (van Gennip et al., 2012).
17P. aeruginosaVersus PMNs

25. Exploring the Variety of Random
Documents with Different Content

26. Tämä oli raskasta muitten kuulla. Eikä tämän kauhistavan
sanoman paino suinkaan keventynyt siitä, että Robert yhä vastusti
Henriä väittäen ettei maa ollut saarta. Useimmat pojista ymmärsivät
sentään liiankin hyvin Henrin olevan oikeassa.
"Kunnes omin silmin olemme nähneet vettä joka puolella", intti
Robert, "siihen asti en kuitenkaan missään tapauksessa…"
"Hyvä!" virkkoi Gordon. "Siinä olet oikeassa, Robert! Meidän täytyy
itse tulla vakuuttuneiksi siitä, miten asian laita on. Ja minä ehdotan,
että huomenna lähdemme pitkälle kiertomatkalle. Nimittäin jos on
kaunis sää. Pahalla säällä meidän on paras pysyä aluksessa. Mitä
arvelette?"
"Hyvä! Huomenna lähdemme matkaan! Sitä mieltä minäkin olen",
kaikui poikien suusta! Tuollainen "suurenmoinen retki" oli kaikille
mieleen.
"Odottakaa!" sanoi Gordon rauhoittavasti. "Emmehän voi kaikki
viisitoista lähteä. Minun tarkoitukseni oli lähettää ensiksikin Henri ja
Robert ja sitten…"
"Pääsenkö minä?"
"Ja minä?"
Sekä William että Jack kohottivat kätensä ylös ja pyysivät rukoillen
päästä mukaan.
"Olkoon menneeksi", sanoi Gordon. "Päätämmekö siis, että nämä
neljä lähtevät huomenna matkaan. Me muut emme liikahda
paikaltammekaan, jäämme vain rauhallisesti alukseen, kunnes
varmasti tiedämme, olemmeko joutuneet saareen vai mantereelle."

27. Koko päivän kohosivat eripuraisuuden laineet korkealle nuoressa
pikku yhteiskunnassa. Robert ajoi järkähtämättä asiaansa. Henri oli
hänen mielestään liian hätiköiden ratkaissut kysymyksen saariko vai
manner. Ja Robertin sokeat ihailijat taistelivat uljaasti hänen
rinnallaan. Vihdoin Gordonin onnistui hiukan jäähdyttää eri puolien
intoa. Mutta sinä yönä ei moni pojista saanut unta silmiinsä
jännitykseltä, eivät nekään, jotka päivän kuluessa olivat tehneet
eniten työtä. Huomispäivähän oli lopullisesti ratkaiseva tärkeän
arvoituksen, niin että siitä sitten enää oli turha keskustella ja
kiistellä.
Mutta seuraava päivä ei sittenkään ratkaissut mitään. Jo varhain
aamulla sateli, ja ilmapuntari ennusti pahaa. Niinpä täytyi neljän
tähystäjän armotta nielaista karvas pala ja jäädä paikoilleen, vaikka
jalkoja poltti kiihkeä retkeilynhalu.
Sen päivän Gordon kulutti tutkimalla suurta karttakirjaa, joka oli
löytynyt kapteenin kajuutasta. Hän tutki tarkoin Tyynen meren
karttaa ja erityisesti niitä saaria, jotka sijaitsivat Uuden Seelannin
itäpuolella. Oikeastaan saattoi olla kysymys vain kahdesta
saariryhmästä, nimittäin Chiloesaarista Chilen rannikolla ja Tulimaan
saarista, jotka olivat aivan Etelä-Amerikan eteläisimmässä nenässä.
Alakuloisena Gordon pudisti päätään ajatellessaan, että he ehkä
olivat joutuneet johonkin näistä saarista. Vaikkapa heidän
onnistuisikin päästä mantereelle, heillä olisi kuitenkin satojen
peninkulmien taival kuljettavana, ennen kuin he pääsisivät ihmisten
ilmoille. Sellainen matka kysyisi varmaan liiaksi voimia ja kestävyyttä,
Gordon arveli, ja samaa mieltä olivat sekä Henri että Baxter. Kunpa
vain Robert tahtoisi olla ymmärtäväinen eikä keksisi mitään
tyhmyyksiä.

28. Kaksi viikkoa umpeen satoi ja tuuli lakkaamatta niin ilkeästi, että
poikien täytyi pysyä alallaan. Mutta aluksessa oli työtä yllin kyllin.
Päivä päivältä tuulet ja sateet jyrsivät runkoa yhä enemmän. Kansi
halkeili ja vuotoja täytyi paikata, ja nyt oli joka miehen näppärästi
käytettävä käsiään, muuten kävisi olo aluksen kajuutoissa tukalaksi.
Haaksirikkoisten poikien, pienimpienkin, täytyi myöntää, että
heidän pian kyllä oli pakko etsiä toinen asuinsija. Puoleen vuoteen ei
voinut ajatellakaan lähteä edemmäksi itään päin, mutta niin kauan ei
"Eteenpäin" nähtävästi tulisi pysymään pystyssä. Minne silloin voisi
majoittua? Töyräässä ei ollut ainoatakaan luolaa merelle päin, ei
pienintäkään syvennystä, jossa olisi voinut olla tuulensuojassa. Mutta
ylängön tuolla puolen, missä sen rinteet tasaisesti viettivät
sisämaahan päin, saattoi hyvinkin olla tuulensuojaa. Sinne saattoi
ehkä rakentaa turvallisen ja tilavan majan.
Kun myrsky kerran hetkeksi tyyntyi, lähtivät Robert, Webb ja
William ampumaan. Garnett, Jack, Cross ja pikkupojat lähtivät myös
pyyntiretkelle, mutta ilman ruutia ja luoteja, mukanaan siimat ja
kalastusvehkeet. Meressä aivan vilisi kaloja. Varsinkin suuria turskia
oli runsaasti, ja aivan rantatöyräällä vesi oikein kiehui pikkukaloista,
niin että niitä saattoi pyytää vaikka paljain käsin.
Virrassa sitä vastoin kalansaalis oli mitätön. Sieltä ei saatu koskaan
mitään muuta kuin pikkuruisia simppuja. Niitä saattoi tosin syödä,
mutta, käyttääksemme Costarin sanoja, ne maistuivat samalta kuin
kourallinen tyhjää.
27. maaliskuuta oli ikimuistettava päivä nuorten kalastajien
elämässä. Oli satanut koko päivän, ja pikkupojat kiiruhtivat
kalastusneuvojen kanssa hyvää vauhtia rannalle.

29. He eivät ennättäneet kovinkaan kauas aluksesta, kun Gordon ja
Moko, jotka askaroivat kannella, kuulivat heidän huutavan ja
kirkuvan täyttä kurkkua. Ensin kuului avunhuutoja, sitten vain
kaikuvaa naurua ja äänekkäitä riemuhuutoja. Mistä oli kysymys?
Gordon ja laivapojat kutsuivat Henrin ja Jackin mukaansa ja
juoksivat ääntä kohti minkä jaloista lähti. Eipä aikaakaan kun he
keksivät pikkupojat ja ymmärsivät nyt, mikä huudot aiheutti. Costar
ratsasti kummallisen elukan selässä. Otus riensi rantaa kohti sellaista
vauhtia, että Costar istui sydän kurkussa ja huusi yhtä mittaa: "Seis!
Seis! Minä tahdon pois! Minä tahdon pois!" John oli myös
kepsahtanut eläimen selkään, mutta hän otti asian iloiselta kannalta,
huusi vain: "Hei hops, heponi!" ja nauroi minkä jaksoi hassua
ratsastusretkeä.
Henri ymmärsi myös heti, ettei ollut minkäänlaista vaaraa.
Kummallinen eläin oli näet kilpikonna! Pojat olivat heittäneet
silmukan sen kaulaan, mutta he eivät voineet sitä hallita,
mokomaakin suurta ja väkevää möhkälettä.
"Seis nyt, niin kauan kuin naurua riittää!" huusi Gordon. "Hyppää
alas, John, ja auta myös Costar pois!"
Mutta eipä ollut Johnin niinkään helppo päästä pois. Gordon juoksi
silloin apuun ja nosti sekä hänet että Costarin kummallisen ratsun
selästä. Tämä vain hetkeäkään pysähtymättä juosta köpitti mereen
päin. Näyttipä jo siltä kuin se pääsisi livahtamaan pakoon, vaikka
koko liuta veti köydestä tarmonsa takaa. Mutta silloin Moko sai
loistavan päähänpiston. Yks kaks hän riensi alukseen ja toi sieltä
muutamia aimo tankoja. Näiden avulla poikien onnistui kääntää
kummitus selälleen. Siinä venyi nyt kilpikonna avuttomana eikä
voinut paikaltaan liikahtaa. Tuokion kuluttua pisti sen pää esille

30. kilven reunasta, ja silloin Henri antoi sille aimo iskun, niin että se
heitti henkensä.
Costar, joka oli vielä pyörällä huimasta ratsastuksestaan, uskalsi
nyt lähestyä eläintä ja katseli sitä suu ammollaan.
"Älä pelkää, ei se pure", sanoi Henri. "Katso vain, että ruokahalusi
on kunnossa, sillä nyt meidän on pidettävä huoli siitä, että tämä
tulee syödyksi."
"Syödyksi", matki Costar; hän luuli Henrin laskevan leikkiä.
"Niin juuri: syödyksi!" sanoi Henri. "Etkö sinä mokomakin
herkkusuu tiedä, että kilpikonnanliha on maailman parasta herkkua?"
"Olenhan minä joskus kuullut puhuttavan kilpikonnaliemestä",
tuumi
Costar, "mutta…"
"No niin, mutta se liemi, jota sinä tarkoitat, on
valekilpikonnalientä. Tämä otus tässä sitä vastoin on oikea ja sata
kertaa hienompi. Mitä Moko arvelee? Etkö luule osaavasi valmistaa
tätä niin, että se maistuu Costarille?"
"Niinpä luulisin", virkkoi Moko. "Mutta ensin se on paloiteltava.
Emmehän saa tuommoista möhkälettä kotiin raahatuksi. Kuka
juoksee noutamaan poraa — ja nuijaa?"
Joku pikkupojista juoksi noutamaan niitä, ja sen jälkeen alettiin
miehissä hakata ja leikata otusta pieniksi kappaleiksi. Noin pulskaa
saalista ei vielä ollut alukseen kuljetettu. Ja maukkaampaa ateriaa
eivät Moko ja Jack vielä olleet tarjonneet. Kilpikonnalientä ja
pannussa paistettua kilpikonnanlihaa! Molemmat ruokalajit

31. maistuivat taivaallisilta, vaikka Jack olikin hiukan kärventänyt paistin
toista kylkeä. Pan nuoli autuaana huuliaan, sellainen ruoka oli sille
mieleen!
Parasta oli kuitenkin se, että pikku yhteiskunnalla nyt oli lihaa
pitkiksi ajoiksi. Kuudettakymmentä naulaa lihaa saatiin tästä yhdestä
ainoasta saaliista.
Näin kului maaliskuu, eivätkä haaksirikkoiset kärsineet mitään
puutetta. Huhtikuun ensi päivinä sää muuttui ilahduttavasti. Tuuli
säästi voimiaan, auringon valta vahvistui, ja pian ehkä saatettiin
lähteä kauan toivotulle kiertomatkalle.
Robert oli joka päivä aamusta iltaan murissut sitä, että
matkallelähtöä turhaan viivyteltiin. Hän koetti kylvää
tyytymättömyyttään muihinkin ja uskotteli heille, että Henri ja
Gordon eivät uskaltaneet lähteä retkelle sisämaahan. Joka ilta
maatapanon aikana hän ehdotti pilkallisella tavallaan, että varhain
seuraavana aamuna lähdettäisiin matkaan: "ellei meidän ankara
herramme ja mestarimme pelkää saavansa nuhaa". Mutta Henri ei
välittänyt hänen ivallisista sanoistaan. Hän itse ja Gordon halusivat
hartaasti saada oikein varmasti tietää, minne maan ääriin he
lopultakin olivat joutuneet, mutta he olivat kumpikin kyllin järkevät
ymmärtääkseen, ettei voinut lähteä matkaan suin päin. Lapsen
täytyy ensin oppia ryömimään, sitten vasta kävelemään, sille ei voi
mitään!
Mutta eräänä iltana huhtikuun alkupäivinä, kun Robert taas veti
vanhaa virttään: "Emmekö vihdoin viimein pääse lähtemään?" kuului
Henrin vastaus kaikkien iloksi toisin kuin ennen.

32. "Eiköhän huomenna, luullakseni", hän virkkoi. Ja Gordon nyökäytti
päätään arvellen hänkin: "Niin, huomenna!"
Nyt alettiin innokkaasti laatia matkasuunnitelmaa. Gordon, jonka
oli määrä jäädä kotiin alukseen pikkupoikien kanssa, painosti lujasti
neljän löytöretkeilijän — Henrin, Robertin, Williamin ja Jackin —
mieleen, että heidän täytyy palata niin pian kuin mahdollista, ainakin
vuorokauden kuluttua. Myös Henri arveli, että he kyllä ennättäisivät
vuorokaudessa tarkoin tutkia seudun. Mutta hän piti kuitenkin
parempana varustautua eväillä pariksi kolmeksi päiväksi, sillä kukapa
tiesi, vaikka olisi hyvinkin vaikea raivata tie metsien halki.
"Niin, siinä olet kun oletkin oikeassa, Henri", sanoi Gordon. Robert
sitä vastoin tokaisi: "Pyh! Mokomakin metsikkö!" ja näytti
pöyhkeältä, aivan kuin raivaamattomissa aarniometsissä
samoaminen olisi varhaisesta lapsuudesta ollut hänelle jokapäiväistä
leipää.
Niinpä valmistauduttiin nyt kaikin tavoin pikku retkeilyyn. Kukin sai
ison eväspussin, siitä piti Moko huolen, ja sen lisäksi retkikunta otti
mukaansa neljä revolveria, neljä hyvää pyssyä, kaksi kirvestä,
taskukompassin, kaukoputken, ja muutamia paksuja lämpöisiä
matkavaippoja.
Nyt pojat saivat näyttää, minkä verran heissä oli löytöretkeilijää.
Gordon ei ollut oikein tyytyväinen siihen, että Henristä ja Robertista
tuli matkatovereita. Mutta sille ei mitään mahtanut, eihän hän itse
voinut lähteä mukaan rauhanvälittäjäksi, pikkupojat eivät voineet
jäädä yksin laivaan.
Gordon ei siis voinut tehdä muuta kuin pyytää Henriä vakavasti
lupaamaan, että hän kaikin tavoin koettaisi välttää joutumasta riitaan

33. Robertin kanssa.
Ja sen Henri ilomielin lupasikin.

34. SEITSEMÄS LUKU
Tutkimusmatkalla
Kello seitsemän seuraavana aamuna pojat ynnä Pan lähtivät
liikkeelle aluksesta eli leiristä, joksi pojat olivat laivansa ristineet.
Ei pilvenhattaraakaan näkynyt taivaalla, aurinko helotti kirkkaana
ja sää oli ihana. Kaikesta päättäen oli edessä kaunis päivä.
Pojat lähtivät kulkemaan tietä myöten, joka koukerteli pitkin
rantaa korkean töyrään juurella, eikä aikaakaan kun jo metsä oli
kätkenyt heidät Gordonin ja toisten poikien silmiltä. Pohdittuaan
asiaa vähän aikaa pojat päättivät seurata Henrin neuvoa ja kulkea
suoraan niemeä kohti, kunnes he saapuisivat samalle niemekkeelle,
jonka kukkulalta Henri oli nähnyt merelle.
Robert juonitteli kyllä hetken aikaa ennen kuin suostui tähän
ehdotukseen. Hän koetti myös kiivetä ylös jyrkkää töyrästä
päästäkseen oikotietä, mutta kyllästyi pian siihen leikkiin. Hänen
täytyi niellä karvas pala ja seurata kiltisti muita.

35. Kun he olivat kulkeneet noin tunnin ajan, pysähtyi Henri äkkiä ja
katseli etsien ympärilleen.
"Hyvänen aika, mihin Jack on jäänyt?" hän huudahti.
Niin, missä oli Jack? Ja Pan?
"Jack!… Jack!… Pan!… Pan!" huusi Henri, ja muut yhtyivät
huutoon. Ensin ei kuulunut muuta vastausta kuin kaiku, joka
raikkaasti kajahti vastaan töyräästä, mutta pian kuului Panin kimeä
haukunta ja vähän sen jälkeen Jackin huhuileva ääni.
Pojat lähtivät juoksujalkaa ääntä kohti. Hetkisen kuluttua he
löysivät Jackin, eikä hänelle, Jumalan kiitos, ollut tapahtunut mitään.
Hän oli vain tehnyt hyödyllisen keksinnön, huomannut kuoppaisen
vaon, jonka äskeiset sateet olivat kaivaneet erääseen kohtaan pitkin
töyrästä. Hänen mieleensä oli heti juolahtanut, että uraa voisi
käyttää tienä, jota myöten pääsisi kiipeämään mäen huipulle.
Ja aivan oikein! Kepeäjalkaiset ja notkeat pojat kiipesivät kuin
oravat pitkin luonnon käden muodostamaa polkua. Robert käytti
ilomielin hyväkseen tilaisuutta näyttääkseen etevämmyyttään toisten
rinnalla ja pian hän olikin korkealla harjanteella. Henri pelkäsi vähän,
että maa hänen allaan oli liian pehmeätä ja lähtisi vierimään, mutta
Robert pääsi ehein nahoin uhkapelistään. Kukkulalle päästyään hän
kajautti raikuvan eläköönhuudon tovereilleen.
Muutaman minuutin kuluttua olivat harjalla myös Henri, William ja
Jack. Sillä aikaa kun he hiukan hengähtivät kapuamisen vaivoista,
käytti Robert ahkerasti kaukoputkea, jonka hän suuntasi etupäässä
itää kohti, yli suuren metsän.

36. "No, miten on veden laita?" kysyi William. "Näetkö merta?"
Ei, Robert ei nähnyt veden tippaakaan. Hän loi sanomattoman
ylimielisen katseen Henriin, pudisti päätään ja sanoi:
"Vettäkö? Siinä ei ole vettä minun pikkusormeni vertaa! Johan sen
heti sanoin!" hän lisäsi ja nosti itsetietoisena nenäänsä.
"Mitä kummaa, ettäkö ei vettä?" ihmetteli Henri. "On kuin onkin
siellä vettä."
"Niin, sinun mielikuvituksessasi kyllä", väitti Robert. "Mutta tuolla
kaukana ei ole muuta kuin pilviä. Myönnä sinä vain erehtyneesi."
Mutta Henri ei taipunut. Hän tiesi voivansa varmasti luottaa
näköönsä, ja hän oli todella nähnyt vettä idän suunnassa. Mistä
johtui, ettei… Nyt hän keksi. Hän oli katsonut merelle niemekkeen
korkeimmalta kohdalta. Töyräs oli siis matalampi kuin niemeke.
Näköala ei täällä ollut laaja eikä vapaa.
Henri koetti selittää tovereilleen tätä huomiotaan. Mutta Robert ja
William eivät tahtoneet sellaisesta kuulla puhuttavankaan. Eivätkä he
suostuneet Henrin ehdotukseen, että mentäisiin eteenpäin metsän
halki itää kohti, kunnes saavuttaisiin merelle.
"Ei, kuulepa", sanoi William nauraen. "Jos aiomme kävellä kunnes
saavumme merelle, niin saammepa kulkea aikamoisen taipaleen."
"Niin minäkin arvelen", lausui Robert. "Emme siis kulje
kauemmaksi."
"Sama se" sanoi Henri. "Jack ja minä menemme sitten yksin."
Näin hän sanoi vain siksi, että tiesi Robertin ja Williamin silloin kyllä

37. suostuvan. Nämä eivät enää vastustaneetkaan, vaan seurasivat
kauniisti toisia alas kaltevaa mäkeä, jossa siellä täällä ruohikosta
kohosi sammalpeitteinen kivi ja joskus heidän täytyi tunkeutua
korkean, sananjalkaa ja orjantappuroita kasvavan viidakon halki.
Alkuosa matkasta sujui helposti ja esteettömästi, mutta sitten he
saapuivat metsään, ja siellä he saattoivat kulkea vain askel askelelta.
Koko ajan heidän täytyi näet kavuta kaatuneiden puitten yli, joiden
latvat olivat lujasti kietoutuneet toisiinsa, tai tunkeutua tiheän
viidakon läpi, koko ajan karsien kirveellä oksia. Kului tunti, kului
toinen, eivätkä he olleet päässeet kuin kappaleen matkaa eteenpäin.
Oli helppo huomata, ettei tätä metsää kuuna päivänä mikään
ihmisjalka ollut tallannut. Ihmiskäsi ei ollut kaatanut puita, jotka
makasivat maassa tietä sulkemassa, ikä tai myrsky oli ne kukistanut.
Eläimistä ei sitä vastoin ollut puutetta. Sen näki siitäkin, että ruoho
oli sotkettu lakoon. Ja silloin tällöin pojat näkivät vilahdukselta
jonkun säikähtyneen nelijalkaisen otuksen, joka piiloutui viidakkoon
rauhanhäiritsijöiden lähetessä. Robertin oli kovin vaikea hillitä
metsästyshimoaan, mutta hän kuitenkin ymmärsi säästää ruudin
parempaan tarpeeseen.
Kello kahden tienoissa löytöretkeilijämme levähtivät. Tällä kertaa
he istahtivat aukealle paikalle pienen, iloisesti lorisevan puron
reunalle. Joku heistä huomasi, että puron yli kulki oikea pieni silta.
Joukko litteitä kiviä oli näet sijoittunut niin, että saattoi kuivin jaloin
astua pienen virran yli.
Henri alkoi heti tarkoin tutkia kiviä, mutta oli mahdotonta päättää,
oliko silta tehty vai olivatko kivet noin vain sattumalta joutuneet
tällaiseen asentoon.

38. Puro virtasi koillista kohti, ja kun pojat taas jatkoivat matkaansa,
he lähtivät seuraamaan sen juoksua kappaleen matkaa. Mutta parin
tunnin kuluttua kompassi ilmoitti heille, että puro oli kääntynyt
pohjoista kohti, ja silloin heidän täytyi luopua siitä ja ruveta taas
samoamaan raivaamattoman metsän halki.
Eikö tällä metsällä ollut loppua. Kello kävi jo seitsemää, ja yhä vain
riitti puita, loppumattomiin, niin pitkälle kuin silmä kantoi. Alkoi
vähitellen pimetä, ja nyt ei ollut muuta neuvoa kuin asettua
lepäämään ja tyytyä metsän tarjoamaan yömajaan.
Niin pojat tekivätkin. Ensiksi he kävivät hyvällä ruokahalulla Mokon
varaamien eväiden kimppuun ja alkoivat sitten etsiä itselleen sopivaa
makuupaikkaa. Jack keksi parhaan, pienen rauhallisen viidakon. Sen
keskeltä kohosi puu, jonka riippuvat oksat melkein koskettivat
maata. Yks kaks pojat haalivat kuivuneita lehtiä läjään puun juurelle,
kääriytyivät vaippoihinsa ja vetivät pian unta.
Pan, joka oli otettu matkaan vartijaksi, ei ollut erikoisen valpas
sinä yönä. Se oli lopen väsynyt kovan päivätyön jälkeen ja kuorsasi
niin että kaikui. Silloin tällöin se kuitenkin säpsähti unestaan ja
murahti. Se oli kuullut jonkun eläimen hiipivät askeleet puitten
välistä tai oli vain unessa kuulevinansa.
Yö kului levossa ja rauhassa. Päivän valjetessa heräsi Jack.
Samassa silmänräpäyksessä hän oli jalkeilla ja puhkesi äänekkääseen
ihmettelyyn, joka herätti muutkin.
"Hei! Mikä sinua vaivaa". Näillä sanoilla Robert, Henri ja William
toivottivat hyvää huomenta Jackille. Mutta samassa
silmänräpäyksessä hekin hämmästyivät.

39. Mitä he sitten näkivät? 'Puu', jonka riippaoksien suojassa he olivat
nukkuneet, ei ollutkaan puu. Eikä 'viidakkokaan' ollut viidakko.
Molemmat olivat muuttuneet ränsistyneeksi majaksi, joka oli
kömpelösti punottu kokoon paksuista ja hienoista oksista.
Täällä asui siis sittenkin ihmisiä! Nyt oli helppo tietää, kuka oli
rakentanut sillan puron yli.
"Mutta nämähän ovat oikein herttaista väkeä", arveli Jack. "Oikein
herttaisia ja vieraanvaraisia ihmisiä, rakentavat tällaisia somia
majoja, aivan kuin meitä varten."
Mutta Henri ja Robert pudistivat päätään, heitä tämä keksintö ei
ilahduttanut. Ja mitä näitten metsäihmisten herttaisuuteen tuli, se
saattoi olla varsin epämääräistä laatua — todennäköisemmin he
olivat ihmissyöjiä.
Miehissä kierrettiin nyt maja läpikotaisin, mutta ei löytynyt mitään,
josta olisi voinut päätellä, kuka majan oli rakentanut ja siinä asunut.
Pojille ei ollut muuta neuvoa, kuin lähteä jatkamaan
tutkimusmatkaansa, yhä vain itää kohti.
Tänäänkin matka sujui hyvin hitaasti, joka hetki nousi vastaan
jokin este, jonka vain kirveen avulla saattoi raivata tieltä pois. Mutta
vihdoin viimein vaivat päättyivät, ja he saapuivat metsän reunaan.
Heidän eteensä aukeni taas vihreitä kenttiä, sitten leveä hiekka-alue,
ja lopuksi kauimpana meri.
Henrin silmät eivät olleet pettäneet!
Robertin asema oli tällä hetkellä jotenkin nolo. He olivat siis
sittenkin ajautuneet saareen. Hämillään Robert vilkuili Henriin,

40. näyttiköhän tämä hyvin mahtailevalta, koska oli ollut oikeassa? Mutta
Henrillä ei ollut mitään halua ylpeillä. Päinvastoin, hän oli melkein
pahoillaan, että Robert oli ollut väärässä. Olisihan ollut paljoa
parempi heille kaikille, jos he olisivat joutuneet mannermaalle.
Alakuloisina ja väsyneinä, kaksin verroin väsyneinä nyt, kun
jännitys oli ohi, pojat astuivat rantaan, istuivat hiekalle ja avasivat
eväspussinsa. He aikoivat ensin syödä kylliksensä ja sitten heti
lähteä kotimatkalle. Siinä tapauksessa he olisivat perillä aluksessa jo
ennen illan tuloa.
Kun ateria oli päättynyt, he seisoivat vähän aikaa ja katselivat ulos
merelle, ennen kuin saivat lähteneeksi. Oli niin vaikeata päästää
silmistään taukoamatta loiskuvia laineita, joiden tuolla puolen oli
maailma ja ihmisten yhteiskunta, kaukana kaukana heistä.
Mutta yhtäkkiä Pan kävi levottomaksi. Se hyökkäsi pystyyn ja alkoi
juosta alas rantaan. Jack vihelsi sitä luokseen, mutta se ei totellut,
juoksi vain eteenpäin. Ja samassa se syöksyi mereen, pisti kuononsa
veteen ja alkoi ahmien juoda.
"Mitä ihmettä!" huudahti Robert. Ja "mitä ihmettä!" huudahtivat
hänen toverinsakin. Koira sammuttaa janonsa suolavedellä!
Robert ryntäsi koiran perässä. Tultuaan rantaan hän otti kouraansa
vettä ja maistoi sitä.
Se oli suolatonta!
Vesi heidän edessään ei siis ollut merta, se oli järvi!

41. KAHDEKSAS LUKU
P.J.-luola ja luuranko
Nyt oli jouduttu ojasta allikkoon. Pojat olivat peräti ymmällä. Sen
verran he tiesivät, että jos maa oli saarta, se oli mahdottoman laaja
saari, koska siihen mahtui suuri järvi.
Robert tietysti piti yhä mantereen puolta, hän arveli maan olevan
Etelä-Amerikan mannerta. Mutta Henri ja hän olivat kerrankin yhtä
mieltä siitä, että oli joka tapauksessa mahdotonta nyt heti ottaa
asiasta selkoa. Heidän oli pakko odottaa leudompaa vuodenaikaa.
Mutta eivät he myöskään voineet jäädä alukseen asumaan koko
talveksi. Täytyi siis etsiä jokin paikka, jonne saattoi majoittua kesän
tuloon asti. Sen vuoksi pojat päättivät hetkisen neuvoteltuaan ensin
hiukan tarkemmin tutkia seutua ja palata rannikolle vasta päivän tai
parin kuluttua.
Kenties he saattaisivat keksiä jonkin sopivan rakennuspaikan. Ja
voisihan ilmaantua uusia elonmerkkejä ihmisistä, jotka palmikoidusta
majasta ja sillasta päätellen varmaankin asuivat jossain näillä
seuduin.

42. Kellon käydessä yhdeksää pojat lähtivät liikkeelle ja suuntasivat
kulkunsa pitkin suuren järven rantaa. He kulkivat etelää kohti ja
tulivat siten samalla lähemmäksi alusta.
Pan oli aina hyvän matkaa muista edellä. Vähän väliä se pelotti
lentoon suuria peltokanaparvia kanervaisilta kentiltä. Matka kävi
nopeasti sinä päivänä, olikin aivan toista astua täällä järven laakealla
hiekkarannalla kuin raivata tietä köynnöskasvien ja viidakkojen halki.
He kulkivat yhä, mutta eivät kohdanneet ainoatakaan ihmisolentoa,
eivät myöskään huomanneet heikointakaan savua millään suunnalla.
Sitä vastoin he näkivät paljon eläimiä, ei kuitenkaan ainoatakaan
petoeläintä eikä märehtijää. Iltapuolella näkyi kaukana metsän
reunassa muutamia kummannäköisiä otuksia. Ensin pojat eivät
voineet ymmärtää, mitä ne olivat, mutta viimein heille selvisi, että ne
olivat strutseja.
Strutsejako? Sen mukaan maa olisi mannerta, Amerikkaa, sillä
Amerikassahan noita jättiläislintuja on tuhansittain.
Seitsemän ajoissa nuoret löytöretkeilijät päättivät matkansa siltä
päivältä, söivät illallisensa ja asettuivat lepäämään suuren puun
suojaan. Tämäkin yö kului levollisesti, mutta aamupuolella yötä Pan
rupesi murisemaan eikä voinut pysyä levollisena. Se murisi
murisemistaan, juoksenteli sinne tänne ja nuuski joka suunnalla,
aivan kuin olisi ollut metsänriistan jäljillä.
Kun joka mies oli päässyt jalkeille ja saanut suuhunsa leipäpalasen
ja kulauksen maailman kirkkainta lähdevettä, he alkoivat tarkoin
tutkia ympäristöä. Kaikki neljä, sekä Robert ja Henri että William ja
Jack, olivat samaa mieltä, nimittäin: että siihen sopii hyvästi
rakentaa asunto. Robertia paikka miellytti siitä syystä, että aivan

43. lähellä oli suuri suo, joka vilisi villisorsia ja kurppia — niissä oli yllin
kyllin metsänriistaa. William ja Jack taas valitsivat paikan siitä syystä,
että sen läheisyydessä virtasi kalaisa joki. Henri puolestaan oli tehnyt
sen huomion, että paikka oli erinomaisesti tuulensuojassa ja että se
ylimalkaan vallan mainiosti soveltui pienen poikayhteiskunnan
tulevaksi kodiksi.
Matkatoverit kulkivat yhdessä pitkin virranreunaa. Äkkiä William
viittasi kiviröykkiöön, jossa kivet olivat aivan samanlaisessa
asennossa kuin äskeiset kivet purossa. Nyt ei ollut enää
epäilemistäkään — tässä maassa oli siis ihmisiä. Entä tuossa! Robert
äkkäsi muutamia veneenlankkuja, jotka laineet olivat heittäneet
äyräälle, eräässä näkyi vielä ruostunut rautarengas.
Mutta mikä Pania vaivasi! Se vain lakkaamatta nuuski ja haki. Nyt
se seisoi hiljaa kieli riipallaan ja toinen käpälä pystyssä. Yhtäkkiä se
nuolen nopeudella syöksyi muutamien tuuheiden puitten väliin, jotka
kohosivat juuri sillä kohdalla, missä virta laski järveen. Pojat
seurasivat koiran jäljessä. Mitähän se oli löytänyt? Se pysähtyi
vanhan pyökin juurelle, jonka kuoreen oli piirretty kaksi kirjainta:
P.J.
ja niiden alla vuosiluku 1807.
Se oli vihdoinkin löytö, joka kävi jostakin!
Kaikki neljä poikaa seisoivat hetkisen aivan sanattomina. Pan oli
sillä välin taas saanut käpälät alleen ja kadonnut näkyvistä, mutta se
haukkui vimmatusti. Oliko se kohdannut joukon villejä? Vai oliko siltä
jalka katkennut?

44. Henri kutsui sitä nimeltä, ja Robert vihelsi sille, mutta Pan oli yhtä
kuuro kumpaisellekin. Se pysyi siellä, missä oli.
"Pysytellään kaikki hyvin yhdessä!" kuiskasi Henri toisille. "Eihän
sitä tiedä vaikka täällä olisi vaarallisia vihollisia lähellä, intiaaneja
Etelä-Amerikan tasangoilta."
Hiljaa ja varovasti pojat hiipivät eteenpäin koiran haukuntaa kohti.
Heidän pyssyjensä hanat olivat vireessä, ja he olivat valmiina
laukaisemaan heti, jos vihollinen karkaisi heidän päälleen.
Mutta kaikki pysyi yhä hiljaisena ja rauhallisena, ainoastaan Panin
ulina rikkoi metsän äänettömyyden.
Joen äyrästä kulkiessaan Robert kumartui maahan ja otti käteensä
jonkin esineen, jonka hän oli keksinyt. Se oli tavallinen, ruostunut
lapio, jonka varsi oli niin laho, että saattoi nähdä sen viruneen
maassa jo vuosia.
Siltä kohden maa oli ilmeisesti aikoinaan ollut viljelty, mutta siinä
kasvaneet jamssinjuuret olivat kauan sitten metsittyneet.
Vihdoin Robert taas näki Panin. Sekin huomasi pojat ja tuli heti
juosten heidän luokseen, ulisi ja nyki heitä vaatteista saadakseen
heidät mukaansa.
Ja niin he seurasivat koiraa tiheään pensaikkoon, joka rehotti
korkean töyrään juurella. Siirtäessään muutamia oksia sivulle Henri
näki aukon, joka näytti johtavan jonkinlaiseen maaluolaan.
"Katsokaa!" hän sanoi osoittaen tovereilleen Panin merkillistä
löytöä. "Mitähän siellä on sisällä? Mennäänkö katsomaan?"

45. Mutta pian huomattiin, että aukkoon tunkeutuminen olikin
helpommin sanottu kuin tehty, ensin täytyi kirveellä raivata tiheäksi
kietoutunut oksaverkko, joka oli edessä.
Nyt oli tie auki. Ensiksi tassutti luolaan Pan. Se haukkui yhä yhtä
kiivaasti, mutta muutoin luolasta ei kuulunut pienintäkään ääntä.
Luola oli ilmeisesti asumaton.
"Emmekö mene sisään?" sanoi William.
"Menemme, mutta ensin meillä pitää olla 'lyhty kokassa'", arveli
Henri, ja niin sanoen hän iski poikki pihkaa tihkuvan oksan
lähimmästä kuusesta ja raapaisi siihen tulitikulla tulta. Se hulmahti
heti palamaan, ja tämä soihtu vasemmassa kädessään ja pyssy
valmiina oikeassa astui Henri toveriensa edellä ahtaaseen käytävään.
Jo muutaman askelen astuttuaan he huomasivat käytävän
väljenevän, ja pian he seisoivat suuressa kammiossa, jonka lattiassa
oli laajuutta ja laessa korkeutta.
Tämä "lattia" oli hienoa, kuivaa hiekkaa. Lattialla oli jakkara ja
huojuvajalkainen pöytä sekä sen päällä saviruukku, muutamia isoja
näkinkenkiä, vanha ruostunut puukko ja läkkirasia. Seinässä oli
pöydän kohdalla laudanpätkistä karkeatekoisesti kyhätty laatikko ja
siinä muutamia vaaterepaleita, miehenpuvun tähteitä. Perimpänä
tässä maanalaisessa majassa oli sänky, muutamia höyläämättömiä
riukuja, joiden päälle oli heitetty reikäinen peite. Päänpuolella
olevalla penkillä oli läkkikuppi ja puinen kynttilänjalka.
Kuka asui tässä luolassa? Tai kuka oli siinä asunut? Olikohan ehkä
risaisen peitteen alla ruumis?

46. Henri rohkaisi ensiksi mielensä. Hän astui vuoteen ääreen ja
tempaisi ripeästi peitteen syrjään.
Viheliäinen vuode oli tyhjä.
Peloissaan pojat riensivät takaisin päivänvaloon. Pan oli taas
juossut heidän luotaan, he kuulivat sen ulvovan vähän kauempana.
Tuokion etsittyään he löysivät koiran ja huomasivat samalla, mikä
oli syynä sen levottomuuteen: vanhan pyökin juurella oli luuranko,
ihmisen, luolan asukkaan vaalenneet luut.

47. YHDEKSÄS LUKU
Kuollut merimies
Mutta toveruksilla ei ollut aikaa hukattavanaan, heidän täytyi
kiirehtiä, jos aikoivat ehtiä takaisin kuunariin ennen iltaa.
Ensiksi he kuitenkin tahtoivat huolellisesti tarkastaa luolan. He
ryömivät takaisin sinne ahtaasta aukosta, ja sytyttivät tulitikun. Sen
valossa Jack keksi käärön, joka oli vuoteen alla. Sen huomattiin
sisältävän kynttilöitä, jotka oli valettu rasvasta puretusta vaatteesta
tehtyjen sydänten ympärille. Yksi niistä sytytettiin heti, ja sitten alkoi
tarkastus täydellä todella.
Pojat huomasivat nyt, että luolan seinät eivät olleet multaa,
niinkuin he ensin olivat luulleet, vaan jonkinmoista kalkkikiveä, jota
oli verrattain helppo hakata. Se ei merkinnyt niinkään vähän, sillä
silloinhan luolaa ja käytävää täytyi voida laajentaa, ja laajentaa niitä
täytyikin, jos haluttiin saada tilaa kaikille viidelletoista. Samalla luola
tulisi ilmavammaksi ja valoisammaksi oleskella.
Muutoin ei siellä ollut suuria nähtäviä. Eräästä nurkasta löytyi lasso
ja sitten kummallinen ase, jota Robert ensin luuli joksikin

48. Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebooknice.com