Electroforesis capilar

1. ELECTROFORESIS CAPILAR
Técnicas avanzadas de análisis

2. PROGRAMA: ELECTROFORESIS CAPILAR
INTRODUCCIÓN
FUNDAMENTOS BÁSICOS EN
ELECTROFORESIS CAPILAR
 INSTRUMENTACIÓN BÁSICA
TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

3. ¿Qué es la electroforesis?
Técnica de separación que se basa en la diferencia de movilidad o
velocidad de migración de partículas cargadas debido a la acción de
un campo eléctrico.
Campo eléctrico E
Voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación.
E v
Medio de separación
Conductor de la corriente eléctrico
Controla la carga eléctrica

4. ELECTROFORESIS – EVOLUCIÓN
HISTÓRICA
REUSS (1809) describe el fenómeno Elektro = electricidad y
phoresis = acción de llevar.
TISELIUS (1930), Uso de Electroforesis en disolución libre
en tubos verticales en forma de U
MARTIN & EVERAERTS (1967)
Electroforesis en tubos abiertos de vidrio y rellenos con
hidroximetilcelulosa
HJERTEN (1967)
Electroforesis en tubos de 3.0 mm
VIRTANEN (1969)
Electroforesis en tubos de 200 y 500 μm
JORGENSON (1981)
Electroforesis Capilar. Columnas de 75 μm
y utilización de elevados voltajes
ACTUALIDAD

5. Electroforesis
 Técnica de separación basada en el movimiento de los
analitos en un medio conductivo en respuesta a la
aplicación de un campo eléctrico.
 El medio conductivo es generalmente una disolución
tampón.
 En ausencia de otros factores, las especies catiónicas
migran hacia el cátodo (electrodo -) y las especies
aniónicas migran hacia el ánodo (electrodo +).
 La velocidad de migración es una relación directa entre
el tamaño y la carga de cada especie.

6. Electroforesis
Dependiendo de la presencia o ausencia de
soporte o
medio de estabilización, podemos hacer dos
claras
divisiones en las Técnicas electroforéticas:
Métodos en solución libre
La muestra se introduce en un tubo en forma de
U el cual está rellenado de una disolución
tampón.
No existe sistema de soporte o medio de
estabilización.
Cuando se aplica el campo eléctrico las
especies migran en función de su relación
carga/masa.
Tiselius en 1948 recibió el Premio Nobel por la
aplicación en la purificación de proteínas.

7. Electroforesis
Métodos con soporte o medio de estabilización
 Presencia de un medio soporte como papel, gel

o un material empaquetado.
 La muestra es colocada físicamente sobre el
soporte.
 Existe una disolución que cubre totalmente el
soporte o medio de estabilización.

8. ELECTROFORESIS EN PAPEL
El soporte utilizado en este caso es un papel
El papel está introducido en una disolución acuosa
tamponada.
La muestra se sitúa en un punto determinado del
soporte.
Un potencial de corriente continua (100-1000V) es
generalmente aplicado durante la separación (las
corrientes medidas suelen ser del orden de mA).
Las especies iónicas migran hacia puntos
específicos del soporte.
Después de un tiempo apropiado para la separación
el soporte es retirado y secado.
En caso de ser necesario, el papel es tratado con un
agente colorante con el fin de observar las bandas
de desplazamiento

9. ELECTROFORESIS EN
PAPEL

10. ELECTROCROMATOGRAFÍA EN
PAPEL
Es posible desarrollar una separación
continua con una orientación adecuada
del papel.
Introduciendo la muestra en la parte
superior, las fracciones pueden ser
recogidas en la parte inferior.

12. Electroforesis Convencional

13. Electroforesis Convencional

14. Inconvenientes de la
electroforesis convencional
Son técnicas lentas y laboriosas
Tienen tendencia a ser poco
reproducibles
No permiten la automatización.

15. Principios Electroforesis Capilar
Movilidad electroforética
n
EP
= m
Ep
E
m
Ep
= q
6 phr
• Flujo electroosmótico

16. TEORÍA DE ELECTROFORESIS
CAPILAR
Dos son los factores que causan la movilidad de los
solutos:
Movilidad Electroforética
Específica para cada soluto o analito.
Dependiente de la relación carga/tamaño.
Los cationes migran hacia el cátodo, los aniones al
ánodo y los compuestos neutros no se ven afectados
por el campo eléctrico.
Flujo Electrosmótico
Movimiento general de todo lo existente en el
interior del capilar como consecuencia del campo
eléctrico aplicado.
Bajo condiciones normales, el movimiento global es
hacia el cátodo.
Su componente de velocidad es mayor, en general,
que las
componentes electroforéticas de los solutos a
separar.

17. MOVILIDAD
ELECTROSMÓTICA
Los cationes del tampón son atraídos hacia la
pared del capilar, resultando la formación final
de una doble capa de cationes.
La capa interna “capa fija”, está constituida
por cationes fuertemente enlazados al capilar.
La capa externa “capa móvil”, es una capa con
un enlace más débil.
Al aplicar el campo eléctrico, la capa móvil
migra hacia el cátodo.
La disolución que rellena la columna es
arrastrada por esta capa móvil en la dirección
del cátodo.

18. Fenómenos electrocinéticos:
Movilidad electroforética
Flujo electroforético
Movilidad electroforética efectiva
ELECTROMIGRACIÓN
me

19. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS
Capilar (donde se produce la separación) Sílice fundida

20. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS
Capilar con la pared cargada negativamente

21. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS
Se introduce el tampón de separación
Las cargas (+) del tampón se unen a las (-) de la
pared

22. Al aplicar campo eléctrico
El resto de las cargas (+) se mueven hacia el polo (-)
Se genera un flujo de tampón que arrastra todo lo que hay
en el interior del capilar
Movilidad electroosmótico m
eo
ELECTROÓSMOSIS
Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS

23. FENÓMENOS
ELECTROCINÉTICOS
Electroforético ± Electroósmosis
Movilidad electroforética aparente ma

24. Características EC
Elevada eficacia, alcanzándose de 10
5
a 10
6
platos
teóricos.
Las separaciones pueden complementarse en
periodos cortos de tiempo.
La puesta a punto de métodos de análisis es simple
y bastante rápida.
El consumo de muestras y reactivos es mínimo y
prácticamente no genera residuos.
Es una técnica relativamente barata y de bajo
impacto ambiental.
Es una técnica muy adecuada para el análisis de
muestras de pequeño tamaño, células vivas y
ensayos de microdiálisis.

25. Limitaciones de EC
Relativa sensibilidad.
Relativa reproducibilidad en análisis
cuantitativo.
Problemas a escala micropreparativa.

26. Componentes básicos de un
sistema de EC

29. FUENTE DE ALTO
VOLTAJE
La migración (separación) comienza una vez se
aplica el campo eléctrico.
Cuando el campo eléctrico utilizado se elevado,
se obtienen tiempos de análisis cortos, buenas
separaciones y las mejores resoluciones.
Cuando se disminuye el tamaño del capilar, los
voltajes aplicados pueden ser cada vez más
altos. El máximo voltaje es de 40 kV.
Las corrientes son del orden de los
microamperios.
Las fuentes permiten invertir la polaridad
fácilmente.

31. Corte de capilares

32. INTRODUCCIÓN DE
MUESTRA
Introducción básica de muestra
El capilar es inicialmente rellenado con
una disolución tampón.
La muestra se introduce por uno de los
extremos de la columna, el cual se ha
sumergido en la disolución que
contiene la muestra, provocando que la
muestra se introduzca posteriormente
en el capilar, de dos posibles formas:
Introducción hidrodinámica
Introducción electrocinética

33. SISTEMAS DE
DETECCIÓN
Prácticamente los mismos que los utilizados en HPLC.
Los más utilizados:
Absorción UV/vis: directa e indirecta
Fluorescencia: directa e indirecta
Fluorescencia inducida por Láser
Espectrometría de Masas
Amperométrica
Los menos utilizados:
Conductividad
Potenciométrica
Índice de refracción
Radiométricos

35. MODOS DE ELECTROFORESIS
CAPILAR
ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA
LIBRE
ISOTACOFORESIS
ISOELECTROENFOQUE
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES
O REDES POLIMÉRICAS
CROMATOGRAFIA ELECTROCINÉTICA
MICELAR

36. 1. ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA
 Capilar vacío
 Separación en función q/m
 Separa iones (+) y (-)
 No partículas neutras
No separa compuestos por Pm
Problemas de ADSORCIÓN
(capilar neutro)

37. ELECTROFORESIS CAPILAR DE
ZONA
La más simple de las técnicas
Un tubo capilar se rellena de una disolución tampón,
la muestra es cargada en uno de los extremos del
tubo capilar. Tras esto se coloca de nuevo la
columna en sendos viales que contienen el mismo
tampón y se aplica el campo eléctrico.
En condiciones normales, la muestra se sitúa en el
ánodo, y los solutos migran hacia el cátodo.
Usualmente los cationes migran los primeros. Siendo
los más rápidos los que tienen mayor carga y menor
tamaño, y los últimos los de menor carga y gran
tamaño.
Los elementos neutros aparecen englobados en una
sola señal.
Los aniones, son los últimos. Su orden es el
contrario al de los cationes

39. Capilar neutro, no hay FEO

40. VARIACIÓN DEL FLUJO
ELECTROSMÓTICO
Voltaje Aplicado: Su aumento provoca un aumento del
flujo electrosmótico. El aumento indiscriminado produce
Efecto Joule.
Electroferogramas mostrando el
efecto del voltaje aplicado sobre el
tiempo de migración. El pico 5 no es
mostrado a 10 kV. Tampón: 0.06M
SDS, 0.06M borato sódico, pH 8.92 en
85% agua/15% metanol. Capilar de
sílice, 75 μm d.i., 50 cm de longitud
efectiva. Detector: UV a 214 nm.
Temperatura 25ºC. Picos: 1.
Niacinamida, 2. Cianocobalamina, 3.
Clorhidrato de Piridoxina, 4. Niacina, y
5. Clorhidrato de tianamina

41. ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA
Efecto de la concentración del tampón de separación

42. ELECTROFORESIS CAPILAR
DE ZONA

43. ELECTROFORESIS CAPILAR DE
ZONA
El orden de elución puede invertirse tras
la adicción de sales de alquilamonio.
La “cabeza” polar de las sales de
alquilamonio es atraida por las paredes
de la columna.
La parte no polar, “cola”
de la sal forma una barrera hidrofóbica, a
la que se une una nueva capa de
moléculas de sal, generando un cambio
en la carga de la pared de la columna.
El resultado final es que la pared de la
columna capilar tiene una carga final de
tipo positivo.

44. 2. ISOTACOFORESIS
Electrolito frontal
Electrolito terminal
analito
Formato “sandwich”
 Pequeño margen de movilidades
 Se utiliza como técnica de concentración
de muestra.
 Solutos orgánicos e inorgánicos de Pm ¯

45. ISOTACOFORESIS
CAPILAR
Electroforesis basada en desplazamiento a
igual velocidad.
La muestra en el interior de la columna se
rodea, en forma de sandwich, por un tampón
líder y un tampón terminal.
Los cationes y los aniones no pueden ser
separados en un solo análisis.
En condiciones normales el flujo
electrosmótico es nulo. Los iones se mueven a
la misma velocidad que los iones del tampón
líder.
La señal obtenida es totalmente diferente al
resto de los tipos de electroforesis capilar. La
señal es en forma de escalera.

46. 3. ISOELECTROENFOQUE
Aplicación principal: análisis de proteínas
Separación por puntos isoeléctricos
Capilar neutro: no hay FEO
Procedimiento:
- Introducción de mezcla de anfolitos (diferente pH)
- Preenfoque de los anfolitos (gradiente de pH) y separación
- Presión

47. ISOELECTROENFOQUE
CAPILAR
La separación está basada en la diferencia
entre puntos isoeléctricos.
Su principal aplicación es la separación de
proteínas.
La columna se rellena de una disolución de
anfolitos y la muestra, tras la aplicación del
voltaje se genera un gradiente de pH en el
interior de la columna capilar.
Una vez alcanzado el enfoque, las proteínas se
sitúan en zonas de pH igual a su punto
isoeléctrico, se produce el movimiento de toda
la disolución hacia el detector. Se mantiene el
voltaje de separación.

48. EJEMPLOS CIEF
Separación por CIEF de una mezcla estándar de proteínas
Capìlar recubierto de poliacrilamida

49. 4. ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES
Separación basada en Pm
Gel en el interior del capilar actúa como tamiz molecular

50. ELECTROFORESIS CAPILAR
DE GELES
Combinación de la electroforesis en
geles con la instrumentación y
principios de la Electroforesis Capilar.
La separación se basa en la diferencia
de tamaños y cargas.
Para la misma relación carga/tamaño,
la separación está basada únicamente
en el tamaño.
La introducción de muestra,
generalmente, es
electrocinética.
Aplicada a la separación de grandes
biomoléculas, como fragmentos de
DNA.

51. 4. ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES
Problemas de los geles de
poliacrilamida
- resistencia
- durabilidad
- reproducibilidad
- burbujas
Sustitución por redes poliméricas
- polímero disuelto en tampón
- interacción entre moléculas de polímero
formando red
- se introduce en cada separación
(reproducibilidad mayor)
Aplicaciones principales
proteínas, ADN, polisacáridos

52. Ejemplos CGE
Separación en escalera por CGE de 1 kbp utilizando un gel
minimamente entrelazado de poliacrilamida
Condiciones: Bis-poliacrilamida entrecruzada (3% T, 0.5% C), Tampón Tris-
Borato 100 mM pH 8.3, E=250 V/cm, L= 40 cm, l= 30 cm, i.d.= 75 μm, λ= 260 nm

53.  Separación de mezclas con partículas neutras
 Incorporación de tensoactivos o surfactantes al tampón de
separación con formación de micelas (CMC)
 La separación se basa en la diferente afinidad de los analitos entre
las micelas y el solvente
5. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

54. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA
CAPILAR MICELAR
Combina la separación cromatográfica
y el movimiento por electroforesis
capilar.
Capacidad de separar compuestos
neutros.
Aditivos más comunes utilizados como
fase
semiestacionaria: surfactantes.
Orden de migración: compuestos
hidrofílicos , menos hidrofóbicos, más
hidrofóbicos.

55. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA
CAPILAR MICELAR
 Puesto que las micelas están
negativamente cargadas migrarán hacia el
cátodo, a menos velocidad que los
cationes.
 Las especies neutras alcanzarán un
equilibrio de partición entre las
micelas y el tampón.
Las especies neutras a ser separadas,
deberán tener cierta solubilidad entre las
micelas y la disolución tampón. Si no
son solubles en ellas, se moverán como en
CZE

56. MEKC-
CICLODEXTRINAS

57. MEKC-CICLODEXTRINAS:
EJEMPLOS
Tampón: 100 mM Tris-250 mM
Borato pH 8.3 con 7 M urea.
Gel: 5% T, 3.3.% C adicionado
en el tampón
a) Sin β-ciclodextrina
b) Con 75 μM β-ciclodextrina
Capilar: 150 mm x 75 μm
Potencial: 400 V/cm
Detección UV a 254 nm
Condiciones:
DNS-L-Glu,
2 DNS-D-Glu,
3 DNS-L-Ser,
4 DNS-D-Ser,
5 DNS-L-Leu,
6 DNS-D-Leu
SEPARACIÓN DE DNS-dl-AMINOÁCIDOS

58. EJEMPLOS CEC
Separación de drogas de
características ácidas
Separación de esteroides

59. Modos de separación Acrónimo Principio de separación
Electroforesis capilar en zonaECZ Carga/tamaño
Cromatografía capilar
electrocinética micelar
CCEM
Interacción hidrofóbica/iónica
con micelas del surfactante
Electroforesis capilar quiralECQ
Formación de complejos
estereoespecíficos.
Electroforesis capilar por
afinidad
ECA
Interacciones moleculares
entre ligandos y analito.
Cromatografía capilar
electrocinética micelar con
microemulsiones
CCEMM
Mecanismos electroforéticos
y reparto cromatográfico.
Electroforesis capilar en gelECG Tamaño molecular
Isoelectroenfoque capilar IEEC Punto isoeléctrico
Isotacoforesis capilar ITFC
Capacidad de migración entre
tampones de distinta
naturaleza
Electrocromatografía capilarECC
Movilidad en una solución
libre y retención
cromatográfica.

60. Semejanzas entre EC y HPLC
Ambas Técnicas utilizan sistemas
de detección que recogen la señal
respuesta frente el tiempo.
Ambas emplean diferentes modos y
existe un paralelismo entre los
modos electroforéticos y los modos
en HPLC.
Ambos pueden ser automatizados.

61. Diferencias entre EC y HPLC
Capacidad para facilitar la separación de
macromoléculas en disolución.
Mayor eficacia.
No hay correlación entre tiempos de
retención y tiempos de migración.
Volumen de fase móvil utilizado.
La longitud del paso de luz en la celda de
detección en HPLC es de mm y en EC es de
mm
La correlación del área en función del
tiempo de migración es necesaria para
llevar a cabo el análisis cuantitativa
mediante la EC.

62. Perfil de flujo en EC
EC HPLC

63. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS
ELECTROFORÉTICAS CAPILARES
En general se cubre un amplio abanico de
posibilidades gracias a los diferentes tipos
de
Electroforesis Capilar existentes
Compuestos cuya relación carga/tamaño sea
diferente, separados por CZE.
Compuestos neutros con diferente
hidrofobicidad, separados por MEKC.
Compuestos de tamaño diferente con la
misma relación carga/tamaño, separados
por CGE.
Biomoléculas de tamaño similar y similar
relación carga/tamaño, con diferentes
puntos isoeléctricos, separados por CIEF.

64. MINIATURIZACIÓN DE SISTEMAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

65. MINIATURIZACIÓN DE SISTEMAS DE
ELECTROFORESIS CAPILAR
SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA EN UN μ-TAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR CON
DETECCIÓN UV Introducción electrocinética: 250 V entre B y C durante 30 s, Voltaje de
separación 3 kV entre A y C Tampón Tris-Borato 50 mM de pH 8.5 Concentración de
muestra 20 μM

66. VARIACIÓN DEL FLUJO
ELECTROSMÓTICO
Modificaciones de la pared del capilar: Se puede
disminuir, anular o invertir el flujo electrosmótico.
Electroferograma mezcla de seis
componentes: 1 Formiato, 2 Acetato,
3 Propanoato, 4 Butanoato, 5
Pentanoato, 6 Hexanoato. Voltaje: 20
kV. Columna de sílice 75 μm d.i., 40 cm
de longitud efectiva, 42 de longitud
total. Electrolito 10 mM MES/His a pH
5.9. (a) CZE normal, (b) CZE con
polaridad invertida, (c ), igual que b
pero tampón conteniendo 0.5 mM de
TTAB (Bromuro de Tetradecil Trimetil
Amonio). La concentración de todos los
componentes es la misma (5.0x10-4 M9.