Example of natural product_flavonoid engineering.pptx

Example of metabolite engineering of natural product in microbe

1. CtACO1 Overexpression Resulted in the Alteration of the Flavonoids Profile of Safflower Yanhua Tu 1,†, Beixuan He 1,†, Songyan Gao 2, Dandan Guo 1, Xinlei Jia 1, Xin Dong 2,* and Meili Guo 1,* Molecules 2019 , 24, 1128; doi:10.3390/molecules24061128 KELOMPOK 1 ANNISA KRISRIDWANY 23/515159/SFA/00314 RISMAN TUNNY 23/515794/SFA/0031914. YOUSTIANA DWI RUSITA 23/524275/SFA/00320

2. SAFFLOWER https://www.health.com/safflower-benefits-7970710

3. Background Flavonoids with various structures play a vital role in plant acclimatization to varying environments as well as in plant growth, development, and reproduction. Exogenous applications of ethylene and 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC), could affect the accumulation of flavonoids. Very few attempts have been made to investigate the effect of 1-aminocyclopropane carboxylic acid oxidase (ACO), a unique enzyme that catalyzes ACC to ethylene, on genes and metabolites in the flavonoid biosynthetic pathway.

4. Objectives In this study, two ACOs in safflower ( CtACOs ) were cloned, and then transgenic safflower with overexpressed CtACO1 was generated through the Agrobacterium-mediated floral dipping method .

5. Methods Penemuan CtACO dari database profil transkripsi . Untuk menyelidiki gen fungsional dalam safflower, dilakukan pengurutan transkriptom bunga . Tag urutan yang diungkapkan (EST) dianotasi oleh BLASTx dan BLASTn di database Nr dan Nt ( tidak dipublikasikan ). Dua gen dianotasi sebagai ACO pada bunga safflower. 1. Bahan Tanaman safflower (No. 0025), Carthamus tinctorius L. 2. Analisis Database Profil Transkripsi Safflower Untuk mengurangi variasi salinan gen pada tingkat transkripsi , perpustakaan cDNA bunga safflower yang dinormalisasi pada tahap perkembangan berbeda dibangun . Kemudian , sekuensing transkriptome safflower dilakukan untuk mendeteksi lebih banyak gen yang terkait dengan jalur biosintetik komponen aktif . Gen-gen tersebut dianotasi oleh homolog pencarian BLASTx dan BLASTn di database Nr dan Nt. Dua ACO dipilih dari gen yang dianotasi . Isolasi dan kloning CtACO . Untuk mendapatkan urutan cDNA CtACO lengkap di Carthamus tinctorius L., percobaan 5′- dan 3′-RACE dilakukan dengan menggunakan kit amplifikasi cDNA SMART-RACE ( Clontech , Mountain View, CA, USA). Primer spesifik gen yang dinotasikan sebagai GSP-1/-2 ( Tabel S1) telah dirancang . Fragmen 5'- dan 3'-RACE yang diamplifikasi diklon dalam vektor pMD-19 (Takara, Dalian, China) untuk diurutkan . Pasangan primer ACO1-F/-R dan ACO2-F/-R selanjutnya dirancang , berdasarkan hasil perakitan sekuens ( Tabel S1), untuk memperkuat cDNA full-length CtACO1 dan CtACO2. Fragmen yang diamplifikasi diklon ke vektor pMD-19 dan kemudian diurutkan .

6. 3. Penyelarasan Urutan dan Analisis Filogeni Urutan masing-masing mRNA CtACO1 dan CtACO2 telah diserahkan ke GenBank dengan nomor akses KU291182 dan KU291190. Titik isoelektrik teoretis dan nilai massa protein diprediksi menggunakan alat ExPASyProtParam (//web.expasy.org/ protparam /). Urutan protein CtACO1 dan CtACO2 diselaraskan dengan urutan protein gen ACO dari tanaman lain melalui Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). Untuk mengidentifikasi motif yang dilestarikan dari protein CtACO1 dan CtACO2, urutan asam amino tereduksinya diselaraskan dengan ACO dari tanaman lain menggunakan perangkat lunak DNAMAN 8.0 ( Lynnon Biosoft , San Ramon, CA, USA). 4. Lokalisasi Subseluler dari Protein CtACO1 Lokalisasi subseluler dari protein CtACO1 pertama kali dilakukan dengan menggunakan program prediksi online WoLF PSORT (//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html). Untuk mengidentifikasi lebih lanjut hasil prediksi , vektor rekombinan CtACO1 dan pCAMBIA-1380-CaMV35S-MCS-EGFP-NOS (PMT-39, dimodifikasi oleh laboratorium kami) dibuat dengan primer spesifik ( Tabel S1). Kemudian , fragmen yang diamplifikasi diinfus dengan vektor PMT-39 linier yang dicerna oleh Hind III dan BamH I dengan menggunakan kit kloning SunBio TM ( SunBio , Shanghai, China). Setelah verifikasi melalui pengurutan , plasmid rekombinan yang diekspresikan berlebih dan PMT-39 ditransformasikan menjadi sel elektrokompeten strain A. tumefaciens LBA4404 (Takara Bio, Shiga, Jepang ) dengan menggunakan peralatan elektroporasi . Agrobacterium monoklonal positif dipilih dan dikultur dalam medium Luria-Bertani (LB) yang dilengkapi dengan 50 mg/L kanamisin dan 100 mg/L streptomisin . Ketika nilai OD600 sekitar 1,0, Agrobacterium disentrifugasi pada 5500 rpm selama 10 menit dan diresuspensi dengan media cair Murashige dan Skoog (MS) dengan volume yang sama . Lapisan epidermis bawang merah yang telah disiapkan ditempatkan dalam media cair MS selama 20 menit , dengan pengocokan perlahan setiap 5 menit , dan kemudian diinkubasi pada agar padat MS dengan 0,4 mol/L manitol pada suhu 25 ◦C dalam gelap selama 24 jam. Fluoresensi GFP dari protein CtACO dan PMT-39 diamati di bawah mikroskop confocal (Leica TCS SP5).

7. 5. Transformasi Safflower dan Penyaringan Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang menyimpan vektor CtACO dan PMT-39 rekombinan dimasukkan ke dalam tanaman safflower menggunakan metode floral dip untuk menghasilkan tanaman safflower dengan CtACO . jaringan euphylla muda dari transforman T1 diambil untuk analisis skrining awal . Total DNA genom jaringan euphylla muda diekstraksi dengan kit Column Plant DNAout (QIAGEN, Hilden, Jerman ) dan kemudian dianalisis dengan PCR dengan menggunakan primer spesifik berlabel PMT-39F dan CtACO -R ( Tabel S1). Sistem PCR menggunakan 150 ng total DNA genom , 1 × buffer PCR untuk KOD FX, 0,2 mM dNTP, 0,5 μM primer, dan 1 U KOD FX (TOYOBO, Shanghai, Cina ). Profil termal PCR : denaturasi awal pada 94 ◦C selama 2 menit 40 siklus pada 98 ◦C selama 10 detik , pada 56 ◦C selama 30 detik , pada 68 ◦C selama 45 detik , terakhir , pada suhu 68 ◦C selama 2 menit . Setelah amplifikasi , produk PCR dideteksi dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,0% b/v dalam buffer TAE. Tanaman transgenik positif ditanam hingga tahap berbunga dan digunakan untuk analisis lebih lanjut .

8. 6. Isolasi RNA dan qPCR Analisis ekspresi CtACO1 dan CtACO2 pada bunga pada waktu pembungaan yang berbeda , bunga pada stadium I ( hari pertama saat mahkota menonjol dari sepal), tahap II ( hari kedua saat mahkota menonjol dari sepal), tahap II ( hari kedua saat mahkota menonjol dari sepal). ), tahap III ( hari ketiga saat mahkota menonjol dari sepal), dan tahap IV ( hari keempat saat mahkota menonjol dari sepal) dikumpulkan . Untuk analisis qPCR safflower transgenik yang mengekspresi CtACO1, bunga tanaman transgenik dan kontrol berumur 3 hari , serta jaringan daun , batang , dan daun bracteal , dipanen pada periode yang sama . Total RNA diekstraksi dari tanaman menggunakan reagen TransZol ( TransGen Biotech, Shanghai, China) sesuai dengan instruksi pabrik . Integritas RNA diperiksa dengan menjalankan gel agarosa 1,0% (b/v) dan dengan mendeteksi rasio A260/280. Kuantifikasi RNA dilakukan pada spektrofotometer Biomate 3S (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Selanjutnya , cDNA untai pertama disintesis menggunakan TransScript One-Step gDNA Removal dan kit SuperMix Sintesis cDNA ( TransGen Biotech, Shanghai, Cina ). cDNA diencerkan lima kali dan kemudian dicampur dengan TransStart Green qPCR SuperMix ( TransGen Biotech, Shanghai, China) dan 0,4 uM setiap primer untuk amplifikasi . Tabel S1 menunjukkan primer yang digunakan . qRT -PCR dilakukan dengan sistem deteksi PCR Real-Time ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Prosedur PCR adalah sebagai berikut : penahanan selama 3 menit pada suhu 95 ◦C, diikuti dengan 40 siklus denaturasi selama 10 detik pada suhu 95 ◦C, anil selama 20 detik pada suhu 58 ◦C, dan perpanjangan selama 30 detik pada suhu 72 ◦C. Spesifisitas amplifikasi diperiksa dengan menganalisis kurva leleh dan prosedurnya adalah 60 ◦C selama 1 menit dan 95 ◦C selama 30 detik . Tingkat ekspresi relatif gen dalam setidaknya dua ulangan sampel safflower semuanya dinormalisasi menjadi Ct60s (KJ634810) sebagai gen referensi dan kemudian dibandingkan dengan tingkat ekspresi kontrol dengan menggunakan metode 2−∆∆Ct [39].

9. 7. Ekstraksi Metabolit dan Analisis UHPLC-MS/TOF Bahan kimia dan reagen : Metanol dan asetonitril Asam format kromatografi cair tingkat tinggi Air ultra murni dibuat menggunakan sistem pemurnian air Milli-Q (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Senyawa standar : rutin , kaempferol, quercetin, apigenin, quercetin 3-β-D-glucoside, luteolin, D-phenylalanine, dan hydroxysafflor yellow A. Narigenin Kaempferol-3-O-β- rutinoside , kaempferol-3-O-β-D-glucoside, dan carthamin disintesis di laboratorium kami. Semua bahan kimia lainnya memiliki tingkat analitis , dengan kemurnian lebih tinggi dari 98%. 8. Persiapan Sampel Sebelum analisis , seluruh sampel kering digiling hingga menjadi bubuk dengan menggunakan disintegrator. Selanjutnya ditambahkan 1000 mL metanol 60% ke dalam bubuk (5 mg), kemudian direndam semalaman . Setelah perawatan dengan USG selama 40 menit dan melewati filter mikropori , supernatan bening (150 μL ) dipindahkan ke dalam botol sampel untuk analisis UHPLC-MS.

10. 9. Analisis Profil UHPLC-Q-TOF/MS dari Bagian Safflower yang Berbeda antara Kelompok Transgenik dan Kontrol Pendekatan metabolomik yang menggunakan kromatografi cair kinerja ultra ditambah dengan spektrometri massa waktu penerbangan quadrupole (UHPLC-Q-TOF/MS) dikembangkan untuk melakukan empat bagian berbeda dari safflower—F, BP, J, dan L— profil metabolik analisis dan pencarian metabolit diferensial pada kelompok transgenik dan kelompok kontrol . Atas dasar ini , penelitian ini mengeksplorasi efek metabolik dan regulasi ekspresi berlebih ACO pada metabolisme flavonoid safflower. Analisis UHPLC-Q-TOF/MS dilakukan pada spektrometer massa Agilent 6538 Accurate Mass Quadrupole Time-of-Flight (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Pemisahan kromatografi dilakukan pada suhu 25 ◦C pada kolom XBridge TM BEH C18 (2,1 mm × 100 mm, 2,5 μm ; Waters, Milford, MA, USA). Fase gerak terdiri dari asam format 0,1% (A) dan ACN yang dimodifikasi dengan asam format 0,1% (B); waktu pasca untuk menyeimbangkan sistem adalah 6 menit , dan laju aliran diatur ke 0,4 mL/ menit . Kondisi elusi UPLC yang dioptimalkan adalah : 0–2 menit , 5% B; 2–4 menit , 5–20% B; 4–6 menit , 20–21% B; 6–9 menit , 21–26% B; 9–10 menit , 26–40% B; 10–15 menit , 40–80% B; 15–17 menit , 80–95%; dan 17–19 menit , 95% B. Sumber ionisasi elektrospray (ESI) dioperasikan dalam mode positif dan negatif . Kondisi yang dioptimalkan adalah sebagai berikut : tegangan kapiler , 4 kV dalam mode positif dan 3,5 kV dalam mode negatif ; aliran gas pengeringan , 11 L/ mnt ; suhu gas, 350 ◦C; tekanan nebulizer, 45 psig ; tegangan fragmentor , 120 V; dan tegangan skimmer, 60 V. Spektrum massa dikumpulkan dalam mode pusat massa , berkisar antara 50 hingga 1100 m/z. Ion referensinya adalah 121.0509 dan 922.0098 dalam mode positif , serta 119.03632 dan 966.000725 dalam mode negatif . Semua data diperoleh dengan menggunakan perangkat lunak analisis Agilent MassHunter Workstation B.04.00. Data MS ditentukan , diekstraksi , dan diintegrasikan dengan perangkat lunak Agilent Profinder B.06.00. Semua data dinormalisasi bobotnya menggunakan Excel. Matriks data tiga dimensi , termasuk waktu retensi , data m/z, dan intensitas ion yang dinormalisasi , diimpor ke program SIMCA-P ( Umetrics , Umea, Swedia ) untuk analisis statistik multivariat guna menyaring metabolit diferensial .

11. 10. Penentuan Kuantitatif Metabolit Diferensial Target Setelah menganalisis dan menyesuaikan sampel dari empat bagian berbeda kelompok transgenik dan kelompok kontrol menggunakan metabolomik , spektrometri massa tandem kromatografi cair digunakan untuk mendeteksi konsentrasi metabolit target yang akurat di empat bagian kelompok ini . 11. Kromatografi dan Spektrometri Massa Kolom d iamati pada suhu 25 ◦C, dan laju alir 0,4 mL/ menit , dengan volume injeksi 4 μL . Sistem pelarut biner UHPLC terdiri dari fase gerak A ( asam format 0,1%) dan B (ACN dimodifikasi dengan asam format 0,1%). Kondisi UHPLC elusi gradien adalah : 0–2 menit , 5% B; 2–2,5 menit , 5–15% B; 2,5–7,5 menit , 15% B; 7,5–8 menit , 15–20% B; 8–10 menit , 20–21% B; 10–18 menit , 21–95% B; dan 18–20 menit , 95% B; sistem diseimbangkan dengan waktu posting 5 menit . Ke-12 komponen diukur dengan baik dalam mode negatif . mode negatif digunakan untuk menganalisis perbedaan . Metode spektrometri massa sama dengan seperti seperti sebelumnya .

12. 12. Persiapan Standar Larutan stok standar metanol 60%. Konsentrasi standarnya ( naringenin, 1,36 mg/mL; rutin , 1,32 mg/mL; kuersetin , 1,04 mg/mL; kaempferol, 1,11 mg/mL; kaempferol-3-O-β- rutinoside , 1,67 mg/mL; kaempferol-3-O-β- glukosida , 1,04 mg/mL; apigenin, 1,06 mg/mL; HSYA, 1,3mg/mL; isokersitrin , 1,23 mg/mL; luteolin, 1,05 mg/mL; D- fenilalanin , 3,72 mg/mL; dan karthamin , 0,266mg/ mL. ) Larutan standar dengan volume yang sama dicampur dan rasio titrasi diencerkan . L-para- klorofenilalanin ditambahkan sebagai standar internal, dengan konsentrasi akhir 10 μg / mL. 13. Validasi Metode Pengukuran Kuantitatif Kurva standar dari 12 senyawa objektif telah digambarkan . Keakuratan dan batas kuantifikasi dievaluasi . 4.14. Pengukuran Kuantitatif Metabolit Objektif Standar internal ditambahkan ke sampel pada konsentrasi yang sama . Metode kromatografi dan spektrometri massa yang disebutkan di atas digunakan untuk mendeteksi metabolit dalam sampel dari empat bagian kelompok transgenik dan kontrol . Perangkat lunak Agilent Profinder B.06.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) diterapkan untuk menyelesaikan ekstraksi dan integrasi puncak . Uji t digunakan untuk menentukan signifikansi statistik .

13. Hasil 1 . Penemuan dan Karakterisasi CtACO dari Database Profil Transkripsi Safflower alignment showed that CtACO1 and CtACO2 were both characterized by the 2-oxoglutarate binding domain RxS and the ferrous iron binding site HxDxnH as in other ACOs, implying their physiologic function in the ethylene biosynthesis pathway, or at least as related to that of ACO (Fig 1) Penyelarasan urutan menunjukkan bahwa CtACO1 dan CtACO2 keduanya dikarakterisasi oleh domain pengikat 2-oksoglutarat RxS dan situs pengikatan besi besi HxDxnH seperti pada ACO lainnya , yang menyiratkan fungsi fisiologisnya dalam jalur biosintesis etilen , atau setidaknya terkait dengan ACO. (Gambar 1).

14. 2. Ekspresi CtACO1 dan CtACO2 di Bunga pada Waktu Berbunga Berbeda Ekspresi CtACO1 dan CtACO2 pada Bunga pada Waktu Berbunga Berbeda Untuk mendeteksi pola ekspresi CtACO1 dan CtACO2 pada bunga pada waktu berbunga berbeda , dikumpulkan bunga pada stadium I, II, III, dan IV [20]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, tingkat transkrip CtACO1 dan CtACO2 pada bunga terus meningkat seiring dengan pemanjangan tabung serbuk sari.

15. 3. Lokalisasi Subseluler Protein CtACO1 Dengan menggunakan program prediksi WoLF PSORT untuk lokalisasi subseluler protein CtACO1, kami memperkirakan bahwa protein CtACO1 dapat terlokalisasi di sitoplasma atau nukleus . Untuk menguji prediksi ini , rekombinan CtACO1 dan pCAMBIA-1380-CaMV35S-MCS-EGFP-NOS (PMT-39) dimasukkan ke dalam sel epidermis bawang merah melalui mediasi Agrobacterium strain LBA4404 . Vektor kosong PMT-39 juga dimasukkan ke dalam sel epidermis bawang merah sebagai kontrol . Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, protein CtACO1-PMT lebih disukai terlokalisasi di sitoplasma dan sitomembran , sedangkan kontrol PMT memancarkan sinyal protein fluoresen hijau (GFP) di sitoplasma . Hasil gabungan menunjukkan bahwa CtACO1 adalah protein lokal sitomembran

16. 4. Untuk mengeksplorasi fungsi in vivo CtACO1, safflower transgenik yang mengekspresi CtACO1 secara berlebihan di bawah promotor CaMV 35S dihasilkan . Berdasarkan skrining dengan PCR DNA genom (Gambar S2), 14 dari 16 galur transgenik independen menunjukkan hasil elektroforesis positif . Oleh karena itu , enam baris, yaitu nomor 5, 8, 9, 17, 18, dan 19, digunakan untuk analisis lebih lanjut tingkat transkrip gen yang terlibat dalam jalur biosintesis etilen dan flavonoid. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A, dibandingkan dengan safflower yang tidak diberi perlakuan , garis transgenik menunjukkan peningkatan lebih dari 20 kali lipat tingkat transkrip CtACO1 pada daun , bracteole, bunga , dan batang . Selain itu , hampir tidak ada perbedaan morfologi tanaman , pertumbuhan dan karakteristik bunga antara WT (garis safflower tipe liar) dan p transgenik .

17. Hasil 5. Ekspresi Gen yang Terlibat dalam Jalur Biosintesis Etilen dan Flavonoid Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, protein ETR1 dalam jalur pensinyalan etilen dapat mempengaruhi akumulasi flavonoid pada tanaman , menunjukkan peningkatan regulasi tingkat transkrip pada safflower CtACO1 yang ditampilkan dalam penelitian ini. Tingkat transkrip target langsung ETR, gen responsif etilen (ERF), meningkat secara signifikan pada daun , bracteole, dan batang , tetapi tidak pada bunga . MYB12, yang telah dipastikan mengendalikan gen biosintetik flavonol dalam pola spesifik tipe jaringan dan sel , menghasilkan peningkatan akumulasi mRNA pada daun , bracteole, bunga , dan batang pada garis transgenik . Untuk menyelidiki efek ekspresi berlebih CtACO1 pada jalur flavonoid, tingkat transkrip gen yang mengkode enzim yang terlibat dalam metabolisme flavonoid pada daun , bracteole, bunga , dan batang dianalisis . Kelimpahan transkrip 4CL, PAL, CHS, CHI, F3H, FNSI, F3'5'H, dan glikosiltransferase (GT) di organ yang berbeda menunjukkan pola ekspresi yang berbeda pada garis safflower dengan CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan . Seperti yang disajikan pada Gambar 5, level transkrip 4CL dan PAL di empat organ garis safflower dengan CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan menunjukkan peningkatan lebih dari 5 kali lipat . Namun , tingkat transkrip gen hilirnya , termasuk CHS, CHI, F3H, FNSI, F3'5'H, dan UDP glikosiltransferase (UGT), berbeda antar organ. Tingkat transkrip 4CL, PAL, CHS, CHI, FNSI, F3'5'H, dan UGT di bracteole dan batang garis transgenik semuanya meningkat , sedangkan F3H menunjukkan penurunan tingkat transkrip dibandingkan dengan di bracteole dan batang kontrol . Kecuali untuk FNSI dan F3H, 4CL, PAL, CHS, F3′5′H, dan dua GT di daun garis transgenik menunjukkan peningkatan akumulasi mRNA. Bunganya merupakan bagian obat dari safflower. Tingkat transkrip CHS, FNSI, dan dua UGT pada organ ini menurun karena efek ekspresi berlebih CtACO1. Sebaliknya , level transkrip 4CL, PAL, CHI, F3H, dan F3′5′H diatur secara positif oleh ekspresi berlebih CtACO1, meningkat lebih dari 5 kali lipat .

18. 6. Analisis Profil Metabolik Berbagai Organ Safflower UHPLC-Q-TOF/MS dilakukan untuk menganalisis empat organ safflower dalam delapan kelompok ; Gambar 6 menunjukkan kromatogram ion total (TIC) yang representatif dalam mode positif dan negatif .

19. 6. mengkarakterisasi perbedaan metabolik safflower antara kelompok transgenik dan kelompok kontrol , PCA, sebuah analisis data multivariat tanpa pengawasan , pertama kali dilakukan untuk memvisualisasikan tren dan outlier dalam data untuk kelompok transgenik dan kontrol . Plot skor menunjukkan bahwa tidak ada outlier dan kelompok transgenik jelas terpisah dari kelompok kontrol baik dalam mode positif maupun negatif , yang menunjukkan bahwa metabolit dari bagian safflower yang berbeda sangat bervariasi antar kelompok . Kemudian , PLS-DA yang diamati diterapkan untuk menyaring potensi metabolit diferensial . Seperti yang ditunjukkan oleh plot skor PLS-DA (Gambar 7), kelompok transgenik jelas terpisah dari kelompok kontrol .

20. Hasil Kumulatif R2X, R2Y, dan Q2 mendekati satu seperti terlihat pada Tabel 1. Hasil uji permutasi menunjukkan tidak terjadi over-fitting baik pada mode positif maupun negatif . Sebaran PLS-DA dan plot kepentingan variabel dapat digunakan untuk mengidentifikasi karakteristik metabolit untuk membedakan kelompok transgenik dan kelompok kontrol . Dalam penelitian ini , ion dengan VIP lebih besar dari 1,5 dan p <0,05 dipilih sebagai metabolit diferensial yang penting . Terakhir , 114 metabolit pada bagian bunga (F), 192 metabolit pada bagian bracteole (BP), 245 metabolit pada bagian daun (L), dan 113 metabolit pada bagian batang (J), dengan perbedaan yang nyata antara transgenik dan transgenik . kelompok kontrol , diidentifikasi

21. Hasil 7. Deteksi Kuantitatif 12 Metabolit Target   Deteksi kuantitatif 12 Metabolit Target Dua belas metabolit target diidentifikasi dengan membandingkannya dengan standar . Jumlah metabolit ditunjukkan pada Tabel 2, delapan kelompok dideteksi oleh LC-MS, dan data regresi linier dari metabolit yang didapat menunjukkan bahwa metode deteksi kuantitatif ini memiliki stabilitas tinggi .

22. 12 metabolit terdeteksi secara akurat di F (Gambar 9), ketinggiant Perubahan kelimpahan transkrip dan senyawa pada bunga yang mengekspresikan CtACO secara berlebihan . Senyawa yang bertambah ( dengan panah merah ke atas ) dan senyawa yang berkurang ( dengan panah hitam ke bawah ) ditunjukkan pada diagram. Gen yang diregulasi ditandai dengan panah merah ke atas dan gen yang diregulasi ke bawah ditandai dengan panah hitam ke bawah .

23. Pembahasan & kesimpulan Dalam penelitian ini , dua CtACO dari safflower pertama kali dikloning dan diidentifikasi . Mirip dengan ACO dari tanaman lain, CtACO1 dan CtACO2 dikarakterisasi oleh 2-oxoglutarate dan Domain superfamili oksigenase yang bergantung pada Fe(II). Analisis bioinformasi menunjukkan fungsi fisiologis CtACO1 dan CtACO2 dalam jalur biosintesis etilen . Kadar transkrip CtACO1 pada bunga stadium I, II, III, dan IV semuanya lebih tinggi dibandingkan CtACO2. Mengenai kadar asam amino, CtACO1 sangat mirip dengan CtACO2, dengan identitas 99%. empat asam amino berbeda ; valin di posisi 21 dari CtACO1 bermutasi menjadi fenilalanin dari CtACO2, serin di 208 menjadi asparagin , arginin di 220 menjadi sistein , dan asparagin di 362 menjadi sistein asparagin , yang mungkin menyebabkan pola ekspresi yang berbeda pada waktu pembungaan yang berbeda .

24. Untuk menguji hipotesis bahwa CtACO1 dapat mempengaruhi akumulasi flavonoid dalam safflower, dihasilkan safflower transgenik dengan CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan . Dalam penelitian ini , tidak ada perubahan fenotipe yang khas pada safflower transgenik dengan CtACO1 yang diekspresikan berlebih . Namun , kelimpahan transkrip gen yang mengkode biosintesis etilen dan flavonoid pada tanaman transgenik ini menunjukkan perubahan yang signifikan . Sebuah model dibangun untuk mensintesis data kelimpahan transkrip , seperti yang ditunjukkan pada Gambar 13

25. Model ini menguraikan hubungan antara biosintesis etilen dan biosintesis flavonoid. Bunga adalah bagian obat utama safflower, yang mengakumulasi beragam senyawa . Gambar 13 menunjukkan perubahan gen dan senyawa yang terdeteksi . Kelimpahan transkrip gen CtACO1 pada safflower CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan meningkat secara signifikan . Selain itu , gen lain yang terkait dengan jalur pensinyalan etilen , termasuk CtEin2 dan CtETR1, menunjukkan peningkatan regulasi kelimpahan transkrip . Mengenai efek CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan pada gen dalam biosintesis flavonoid, berbagai efek antara gen dan metabolit telah diamati . Menariknya , meskipun kelimpahan transkrip CtCHI meningkat 9 kali lipat pada bunga CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan , naringenin yang terdeteksi menunjukkan penurunan 3 kali lipat . hasil ini mungkin karena biosintesis metabolit cenderung tertinggal dibandingkan peristiwa ekspresi transkrip gen; dengan demikian , sintesis enzim , ekspresi gen, dan perubahan metabolit mungkin berbeda untuk sementara . Flavonol merupakan salah satu jenis senyawa flavon pada safflower. Salah satu hasil yang menunjukan dari analisis transkrip dan metabolit adalah meskipun kelimpahan transkrip gen CtF3H— enzim inti yang bekerja pada percabangan jalur biosintetik flavonoid— meningkat lebih dari 40 kali lipat pada bunga setelah perlakuan transgenik , hal ini bertepatan dengan kaempferol dan turunan glikosilasinya (kaempferol-3-O-β- rutinoside dan kaempferol-3-O-β-D-glucoside) menunjukkan akumulasi yang lebih rendah pada bunga yang mengekspresikan CtACO1 secara berlebihan . Sebaliknya , quercetin yang terdeteksi dan turunan glikosilasinya (quercetin 3-β-D-glucoside dan rutin ) meningkat pada bunga

26. jalur biosintetik yang tepat dari hidroksisafflor kuning A masih belum dapat ditentukan . Berdasarkan struktur kimianya , penelitian ini berhipotesis bahwa naringenin chalcone dapat dikatalisis oleh UDP- glikosiltransferase untuk menghasilkan hidroksisafflor kuning A. Demikian pula dengan akumulasi turunan glikosilasi kaempferol, hidroksisafflor kuning A dan carthamin dalam safflower CtACO1 yang diekspresikan menunjukkan akumulasi yang sangat menurun dibandingkan dengan yang tidak diberi perlakuan . bunga safflower. Hasil ini menunjukkan adanya regulasi negatif dari gen CtACO1 yang diekspresikan berlebih pada akumulasi quinochalcones dari safflower, yang meletakkan dasar untuk mengendalikan biosintesis hidroksisafflor kuning A. Hasil ini mendukung efek potensial etilen pada quinochalcones selain dari turunan quercetin, kaempferol, dan apigenin. metode pencelupan bunga diterapkan untuk menghasilkan safflower transgenik dengan CtACO1 yang diekspresikan secara berlebihan . Sitementara u, efek ekspresi berlebih CtACO1 pada transkrip dan kadar metabolit safflower telah dikonfirmasi , yang menunjukkan efek yang bervariasi antara gen dan metabolit . Secara keseluruhan , hasil penelitian ini memvalidasi efek pengaturan baru CtACO1 pada jalur biosintetik flavonoid , sehingga memberikan landasan hipotetis dan praktis untuk upaya lebih lanjut dalam mengatur fluks metabolisme keseluruhan flavonoid dalam safflower, khususnya hidroksisafflor kuning A dan quinochalcones lainnya , dengan menerapkan strategi rekayasa genetika yang tepat

27. Kesimpulan penerapan metode pencelupan bunga pada safflower dan menunjukkan efek regulasi baru dari CtACO1 pada jalur biosintesis flavonoid. penelitian lebih lanjut mengenai pengaturan fluks metabolisme keseluruhan flavonoid dalam safflower, khususnya hidroksisafflor kuning A dan quinochalcones lainnya , dengan menggunakan strategi rekayasa genetika yang tepat .