INGENIERÍA MOLECULAR DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL.pptx

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1. INGENIERÍA MOLECULAR DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL TGF- Β

2. INTRODUCCION: Las células perciben su entorno y responden a él mediante una complicada red de señalización. Las señales externas son detectadas, procesadas y traducidas en respuestas celulares específicas por diferentes proteínas de señalización, compuestas por distintos dominios funcionales con una gran modularidad en sus estructuras. La transducción de señales en las células se inicia en parte por proteínas secretadas, como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas. El factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) es una de las citocinas más importantes que desempeña funciones esenciales en la regulación del desarrollo y la homeostasis de los tejidos. La disfunción de la señalización del TGF-β se ha relacionado con muchas enfermedades humanas como el cáncer, las enfermedades fibróticas y los trastornos del tejido conectivo

3. MODULARIDAD DE LA SEÑALIZACIÓN DEL TGF La red de señalización de TGF-β se compone de elementos de señalización comunes: Sensores (receptores de TGF-β) que perciben la entrada de señal de TGF- β Efectores intracelulares (Smad2/3 regulado por el receptor y Smad4 socio común) Reguladores de retroalimentación (por ejemplo, Smads inhibidoras, Smad7) que modulan las actividades de señalización respuestas biológicas (por ejemplo, salidas transcripcionales) Un número creciente de estudios ha demostrado que los cambios en la señal de entrada de TGF-β se codifican en los patrones temporales de los factores de transcripción Smad, que influyen en diversos resultados transcripcionales Sin embargo, los resultados biológicos posteriores de la señalización de TGF-β dependen en gran medida del contexto celular: no sólo están determinados por las proteínas Smad, sino también por las actividades de vías no Smad . -β

4. INGENIERÍA DE LIGANDOS DEL TGF-Β PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE SEÑALIZACIÓN DEL TGF- β El TGF-β señala uniéndose a TβRII, que recluta a TβRI para formar un complejo heteromérico en la superficie celular. Las isoformas del TGF-β (TGF- β1, -β2 y -β3) son polipéptidos homodiméricos de 25 kDa. Comparten elementos estructurales comunes pero muestran diferentes afinidades de unión a TβRII. TGF-β1 y -β3 se unen a TβRII con una alta afinidad, mientras que TGF-β2 se une a TβRII con una baja afinidad . Estudios previos sugieren que los epítopos de unión de los receptores TGF-β dentro de cada monómero de los ligandos de la superfamilia TGF-β.

5. INGENIERÍA DE RECEPTORES SINTÉTICOS DE TGF-Β QUE PROPORCIONAN NUEVAS ESTRATEGIAS PARA ESTUDIAR LA SEÑALIZACIÓN DE TGF- β La estrategia para generar células que se dirijan a una proteína específica, redirijan las respuestas celulares y reprogramen las interacciones célula-célula. Este enfoque también se ha adoptado para sondear el mecanismo molecular de activación de la señal de TGF-β y encontrar nuevas formas de controlar la señalización de TGF-β. Por ejemplo, en algunos de los primeros estudios, se construyeron receptores quiméricos de TGF-β y expresados en células específicas mediante la combinación de los dominios citoplasmáticos de los receptores TGF-β con el dominio extracelular del receptor de la eritropoyetina o del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos La invención de la opto genética ha proporcionado excelentes herramientas para controlar la señalización celular mediante la estimulación lumínica . Las herramientas opto genéticas han sido ampliamente adoptadas para modular y diseccionar redes de señalización intracelular, incluyendo Ras- Erk , FGF, activación del calcio, p53 y otros tipos de señalización , En un estudio reciente, Li et al ., desarrollaron un sistema optogenético (optoTGFBRs), en el que la luz azul desencadena la formación de complejos receptores de TGF-β y la señalización de Smad en células individuales. Además, guiados por simulaciones de modelos de la dinámica de señalización de TGF-β, es posible generar dinámicas transitorias, sostenidas y osciladas de Smad2 manipulando la frecuencia de los pulsos de luz azul .

6. INGENIERÍA DE REPORTEROS PARA LA VISUALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN DE TGF- β En trabajos posteriores, se construyeron líneas celulares que expresan de forma estable proteínas Smad2 o Smad4 fluorescentes. Estas líneas celulares permiten a los investigadores utilizar imágenes de células vivas y enfoques de modelización matemática para investigar la relación cuantitativa entre los resultados de la señalización descendente y la señalización ascendente de TGF-β Schmierer y colaboradores] demostraron que la dinámica nucleocitoplasmática de Smad sirve como un sistema de interpretación . Además, descubrieron que la dinámica de señalización de TGF-β depende de la velocidad de aumento de las concentraciones de TGF-β Parece que la dependencia de la dinámica transcripcional de las proteínas Smad es específica de cada gen. Tidin et al . midieron recientemente la dinámica de la translocación nuclear de Smad2/4 y la respuesta transcripcional del gen del factor de crecimiento del tejido conectivo endogénico ( ctgf ) en células individuales. Encontraron que la eficiencia de la translocación nuclear de Smad2/4 tenía poco impacto en la activación transcripcional del ctgf Las proteínas Smad marcadas con fluorescencia se expresan de forma heterogénea en células individuales. En consecuencia, la translocación nuclear de estas proteínas varía de forma subestatal entre las células. La gran cantidad de datos generados a partir de experimentos de imagen de células vivas plantea un reto en el análisis de la señalización heterogénea de Smad en células individuales. Afortunadamente, los recientes avances en el análisis de imágenes han facilitado la cuantificación de la dinámica de señalización en células individuales. Por ejemplo, mediante el seguimiento de la dinámica de las señales nucleares de Smad3 con resolución unicelular.

7. EL RECABLEADO DE LA SEÑALIZACIÓN DEL TGF- Β HACIA APLICACIONES CLÍNICAS Dada la importancia de la señalización del TGF- β en el desarrollo y en las enfermedades, la orientación de la señalización del TGF-β tiene posibles aplicaciones clínicas. Casi todos los componentes de la vía de señalización canónica del TGF-β han sido objeto de diversos tipos de fármacos, como inhibidoras de moléculas pequeñas, oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido, trampas de ligandos y anticuerpos. El recableado del flujo de información de señalización de TGF-β se ha realizado de dos maneras diferentes: (1) construyendo un nuevo sistema de señalización que se une específicamente al ligando de TGF-β y genera nuevas salidas de señalización personalizadas, y (2) mediante la ingeniería de proteínas sintéticas que se dirigen a las proteínas de señalización de TGFβ e inhiben las actividades de señalización endógenas de TGF-β. La inmunoterapia basada en inhibidores de puntos de control y células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) representa un gran avance en la terapia del cáncer . Cada vez hay más pruebas de que el TGF-β es una potente citocina inmunosupresora que interviene en las respuestas inmunitarias supresoras Además, se ha informado de que en los carcinomas colorrectales se encuentran con frecuencia niveles elevados de TGF-β, que se asocian clínicamente con una mala supervivencia de los pacientes . Por lo tanto, no es de extrañar que se hayan realizado grandes esfuerzos para dirigir la señalización del TGF-β al tratamiento del cáncer . Los investigadores han empezado a diseñar células T que expresan CAR que se unen específicamente al ligando TGF-β y superan su efecto inmunosupresor . Chang et al. diseñaron células T TGF-β CAR con un sistema de entrada-salida recableado, en el que el TGF-β pasó de ser un ligando inmunosupresor a una citoquina potente para células T humanas primarias.

8. RETOS Y PERSPECTIVAS Se han realizado muchos esfuerzos en la ingeniería de la señalización de TGF-β. Estos estudios han proporcionado excelentes herramientas para explorar el mecanismo molecular de la señalización de TGF-β y dirigir la señalización de TGF-β para posibles aplicaciones clínicas. Sin embargo, aún quedan grandes retos por superar. Dado que la señalización de TGF-β depende en gran medida del contexto celular y que diferentes tipos de ligandos que comparten TGF-βcontra el cáncer . A pesar de la potencial aplicación de estas células, debe tenerse gran precaución debido a las impredecibles toxicidades de las células T de ingeniería . La activación del TGF- β in vivo es un proceso complicado, que hace difícil distinguir la actividad del TGF-β en el tejido normal de la que se produce en los tumores sólidos. No está claro si la generación actual de células CAR-T de TGF-β puede evitar una toxicidad inaceptable en el mismo tipo de células, por lo que no es fácil diseñar una "bala mágica" que perturbe de forma óptima la señalización de TGF-β y cure una enfermedad humana. Además, aún carecemos de una comprensión cuantitativa clara de la señalización del TGF-β y su interacción con otras vías de señalización. Por lo tanto, los efectos fuera del objetivo en la modulación de la señalización de TGF-β son difíciles de predecir. Aquí describimos algunas necesidades no cubiertas en la ingeniería de la vía del TGF-β que podrían mejorar la comprensión de la dinámica de señalización del TGF-β. Estos experimentos pueden proporcionar información semicuantitativa sobre la actividad del TGF-β, pero requieren mucho tiempo y no implican la visualización directa del ligando del TGF-β en células vivas. Un enfoque alternativo para estudiar cualitativamente la función del ligando TGF-β es establecer un sistema reportero que pueda monitorizar directamente el ligando TGF-β activo. Tal solución se ha establecido con éxito para otros subconjuntos de ligandos de la superfamilia TGF-β. El Decapentaplegic marcado con fluorescencia (GFP- Dpp ) se ha utilizado ampliamente para estudiar el papel de Dpp en la formación de patrones y el crecimiento . Además, la proteína morfogénica ósea 2 (BMP2) se ha marcado con fluorescencia, y este constructo se ha utilizado para analizar cuantitativamente su dinámica en las células. En el futuro, el campo de la señalización de TGF-β se beneficiará de la ingeniería de sensores y reporteros que permitan la cuantificación directa y el seguimiento del ligando TGF-β activo en células y tejidos. Ha sido un largo camino para elucidar y desenredar el rompecabezas de la señalización de TGF-β. A pesar de los grandes avances logrados en la comprensión de muchos componentes de la señalización del TGF-β, aún estamos lejos de desvelar cómo la señalización heterogénea del TGF-β está determinada cuantitativamente por el contexto en células individuales y diferentes tipos de células. Todavía no se han aplicado con éxito en el ámbito clínico fármacos y terapias celulares dirigidos a la vía del TGF-β. Para abordar estas cuestiones, los estudios interdisciplinarios que integran enfoques de ingeniería, experimentales y de modelado han acercado el campo a una mejor comprensión cuantitativa y predictiva de la señalización de TGF-β a nivel de sistemas. En este contexto, prevemos que la ingeniería molecular en la intersección de los sistemas y la biología sintética seguirá desempeñando un papel vital en el estudio de la biología del TGF-β.

9. Referencias:   W.A. Lim, C.H. June, Los principios de la ingeniería inmunológica células para tratar el cáncer, Cell. 1 C. Kiel, E. Yus , L. Serrano, Engineering signal transduction pathways , Cell. 140 (2010) 33-47. R.M. Gordley , L.J. Bugaj , W.A. Lim, Modular engineering of cellular signaling proteins and networks , Curr . Opin . Struct . Biol. 39 (2016) 106-114. C.J. Bashor , J.J. Collins, Understanding biological regulation through synthetic biology , Annu . Rev. Biophys . 47 (2018) 399-423. Y.E. Antebi , N. Nandagopal , M.B. Elowitz , An operational view of intercellular signaling pathways , Curr . Opin . Syst . Biol. 1 (2017) 16-24. A. PT, M. Fussenegger , Engineering mammalian cells for disease diagnosis and treatment , Curr . Opin . Biotechnol . 55 (2018) 87-94.

10. GRACIAS