Método ELISA

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1. ELISA Enzyme-Liked I mmunosorbent Assay R ealizado por : Cristina Barón Lozano Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas

2. ANTÍGENO (Ag): Molécula exógena, que se encuentra en la superficie de un agente patógeno, y que al entrar en contacto con el organismo, induce la producción de una respuesta del Sistema Inmune específica (formación de Acs) ANTICUERPO (Ac): Proteína producida como respuesta a una sustancia “extraña” (Ag) y que tiene la capacidad de combinarse con él (complejo Ag-Ac). Antes de nada quería recordaros que…

3. ¿Qué es un INMUNOENSAYO? Es una prueba que usan complejos antígeno:anticuerpo ( también denominados inmunocomplejos) para medir la presencia de un analito ¹ específico en una muestra . “ Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que hace que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando hay una unión Ag-Ac. Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorio (como las pruebas colorimétricas) ya que usan complejos Ac-Ag para generar una señal que pueda medirse . Los Acs son la base de los inmunoensayos , ya que poseen una alta especificada y afinidad para un Ag específico. Es esta unión lo que permite la detección de analitos por medio de una variedad de técnicas de inmunoensayo. ¹ Analito es todo lo que se mide en una prueba de laboratorio. En el inmunoensayo, el analito puede ser tanto un Ac como un Ag.

4. INTRODUCCIÓN: El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo (inmunoadsorbente ) la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar, la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

5. TIPOS: ELISA no competitivo: Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color. Directo: Detectan Ag Indirecto: Detectan Ac ELISA Sandwich Doble (DAS) Heterólogo (HADAS) ELISA competitivo: El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el Ac presente en la muestra.

6. Pasos generales… Tapizado del pocillo con el Ag o Ac. Adición de la muestra problema con la mezcla de Ags o Acs . Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el pocillo . Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido. Adición del Ac secundario marcado con la enzima. Unión del Ac secundario al Ag o Ac. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida. Adición del sustrato. Unión del sustrato a la enzima. Coloración. El primero es el ELISA directo, seguido del indirecto

7. ELISA directo Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos . Lavado con solución salinaTween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados. Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan reaccionado.

8. ELISA directo Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. Los lectores ELISA se llaman espectrofómetros !!

9. ELISA indirecto Consta de las siguientes etapas: Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado . Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan reaccionado.

10. ELISA indirecto Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado .

11. ELISA indirecto Por si no les ha quedado claro…

12. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática de microplacas . Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada.

13. APLICACIONES CLÍNICAS: Enfermedades producidas por parásitos Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas… Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis , brucelas, Estreptococos, Salmonelas… Enfermedades producidas por virus Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia felina… Otras aplicaciones Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..) Cuantificación de inmunoglobulinas ( IgG , IgE , IgA ) Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos circulantes)

14. Bibliografía: ELISA Palacios, L. (2012). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. http://www.slideshare.net/lexass/presentacion-elisa-13245114 Cultek (2006). Fundamentos y Tipos de ELISAs. http:// www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf Dra. Fernández, N. (2007). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. http :// www.slideshare.net/aselle/elisa-14876995?from_search=2 Jose , M. (2009). Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay ) http:// es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay   Escobedo , J., Bautista, A., Correa, P., Mier, J., Pam , W., Valladares, J . (2012). Técnicas aplicadas a la Proteómica . http ://www.slideshare.net/angelicashantay/elisa-pasos-elaborado-por-jos-mier

15. 2º Anatomía Patológica y Citología