Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính Lan Hồ Điệp (phalaenopsis sp.)

1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
-------------------

TRỊNH THỊ HƢƠNG

ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI
QUÁ TRÌNH NHÂN NHANH PHÔI VÔ TÍNH
LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 29
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà lạt, 5/2009

https://bienphap.net/

2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC
-------------------

ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI
QUÁ TRÌNH NHÂN NHANH PHÔI VÔ TÍNH
LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Dƣơng Tấn Nhựt
ThS. Vũ Quốc Luận

Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Hƣơng

Đà lạt, 5/2009

https://bienphap.net/

3
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả và số liệu
trong khóa luận này chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Đây là một
phần nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu qui trình tạo phôi vô tính và nhân
nhanh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.)” do TS. Dương Tấn Nhựt chủ trì, Sở
Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng cấp kinh phí.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này.

Đà lạt, 24/05/2009

Tác giả

Trịnh Thị Hương

https://bienphap.net/

4
Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các
thầy cô, các anh chị, các bạn và gia đình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt và các phòng ban đã tạo điều kiện tốt cho
em hoàn thành chương trình học của mình ở trường.
Quý Thầy Cô khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt đã truyền đạt cho em những
kiến thức và kinh nghiệm quý báu.
Thầy Dương Tấn Nhựt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
Thầy, người đã trực tiếp gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chu đáo, truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu, hết lòng sửa chữa những sai sót giúp em hoàn thành trọn vẹn đề
tài này và cũng là người dìu dắt em trong bước đi đầu tiên để tiếp cận đến với chân
trời của khoa học rộng lớn. Không chỉ là truyền đạt kiến thức, Thầy còn dạy cho em lối
sống, cách làm người. Thầy cũng là một tấm gương về lòng nhiệt huyết, cống hiến hết
mình cho sự nghiệp của khoa học, để chúng em học hỏi, noi theo.
Em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Quốc Luận, người trực tiếp hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình cũng như luôn tạo mọi điều kiện cho em trong những ngày đầu
tiên thực tập tại viện và trong suốt quá trình tiến hành các thí nghiệm của đề tài.
Cô Hoàng Thị Sâm đã định hướng cũng như luôn chia sẻ những kiến thức, kinh
nghiệm và chỉ bảo cho em rất nhiều điều trong cuộc sống.
Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại viện.
Các anh chị trong phòng Sinh học phân tử & Chọn tạo giống cây trồng (viện Sinh
học Tây Nguyên): anh Bình, anh Nam, chị Hiền, chị Thu Ba, chị Phượng, chị Hằng.
Em cảm ơn các anh chị đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập
cũng như tiến hành các thí nghiệm của đề tài.
Ngoài ra bên cạnh em còn có các anh chị, các bạn của trường ĐH Bách Khoa
TP.HCM, ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, ĐH Nha
Trang, ĐH Đà Lạt, ĐH Yersin. Cảm ơn anh Nam, bạn Thu, bạn Thương, Thành,
Cương đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn
sự nhiệt tình của các anh chị và các bạn.
Cảm ơn anh Thắng, Na, Dung, các thành viên của gia đình 1/29b và tất cả những
người bạn thân đã luôn bên tôi, cùng tôi chia sẻ những niềm vui và cả những khó khăn.
Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong mọi sự
lựa chọn của mình. Đặc biệt là mẹ, người đã luôn tin tưởng, cho con nghị lực và sức
mạnh những khi con gặp khó khăn nhất để vươn lên trong cuộc sống.
Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

https://bienphap.net/

5
Lời mở đầu

Thiên nhiên tươi đẹp đã ban tặng cho cuộc sống rất nhiều món quà. Và sự xuất
hiện của các loài hoa chính là món quà tuyệt vời nhất của tạo hóa. Cùng với sự phát
triển của xã hội, con người ngày càng hướng tới cái đẹp thì hoa tươi đã trở thành món
ăn tinh thần không thể thiếu được. Trong đó, hoa lan được mệnh danh là loài hoa
“vương giả” đã dần dần len lỏi xuất hiện ở mọi nơi, như một điều kỳ diệu mà thiên
nhiên đã ban tặng cho con người. Có lẽ hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp
quanh mình nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê
hoặc con người một cách vô điều kiện như loài hoa này. Trong không gian lung linh
màu sắc và hương thơm quyến rũ đó, chúng ta phải kể tới sự hiện diện của
Phalaenopsis. Từ rất lâu, loài hoa này đã xuất hiện trong các khu vườn làm cảnh cũng
như trong trang hoàng nhà cửa, văn phòng. Phalaenopsis không chỉ mang một vẻ đẹp
đài các, sang trọng, ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm
ẩn, luôn mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót
nặng lòng với loài hoa vương giả này.
Ngày nay, nhu cầu hoa tươi nói chung, hoa lan nói riêng trong nước và trên thế
giới ngày càng tăng, xu hướng chơi lan cũng ngày càng lan rộng. Hoa lan không chỉ
mang giá trị cao về mặt tinh thần, thẩm mỹ mà còn có giá trị cao về mặt kinh tế. Việt
Nam là nước có điều kiện khí hậu thuận lợi để phát triển ngành trồng lan. Tuy nhiên,
chúng ta vẫn phải phụ thuộc nguồn giống từ Thái Lan, Đài Loan… Đây là một điều bất
cập trong tiềm năng nhân giống, lai tạo ra các giống lan độc đáo quý hiếm, mang nét
đặc trưng của Việt Nam phục vụ thị trường nội địa cũng như cho xuất khẩu.
Năm 2005, Tp.HCM khẳng định hoa lan (lan cắt cành như Dendrobium, Mokara,
Oncicidium…) sẽ trở thành cây giống chủ lực của thành phố trong vòng 5 năm tới.
Chương trình phát triển hoa 2004 – 2010 đã được sở Nông nghiệp - Phát triển nông
thôn Tp.HCM thông qua với mục tiêu Tp.HCM phấn đấu đạt kim ngạch xuất khẩu hoa
kiểng là 10 triệu USD vào năm 2005 và 15 triệu USD vào 2010.
Để có thể phát triển được ngành trồng hoa lan, trước mắt chúng ta cần phải chủ động
được nguồn giống, dần dần không phải nhập giống, lai tạo ra một số giống có chất
lượng cao để cung cấp cho thị trường trong nước và sau đó xuất khẩu. Ngoài ra, kỹ
thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô đang là công cụ đắc lực để giúp chúng ta có thể có
đủ giống trong một thời gian ngắn. Như vậy, trong nước chúng ta cần phải có thêm
nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô có quy mô lớn, chất lượng cao để có thể đáp ứng
được nhu cầu nhân giống.

https://bienphap.net/

6
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về Phalaenopsis
1.1. Nguồn gốc và phân bố
Lan Hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định
dưới tên là Angraecum. Đến năm 1753, Linne đổi lại là Epidendrum. Chi
Phalaenopsis do C.L Blume phát hiện vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn gọi là
lan Hồ điệp. Tên Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy Lạp: “Phalama” (con bướm
đêm) và “opsis” (trông giống như) nghĩa là loài hoa có hình dạng như bươm bướm.
Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng, sống ở bán đảo Mã
Lai, Indonesia, Philippin, các tỉnh ở phía đông Ấn Độ và Châu Úc. Chúng sống trên
cây hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m (Dương Công Kiên,
2006).
Ở Việt Nam có khoảng 5 - 6 loài Hồ điệp thuần chủng bao gồm: Phalaenopsis.
gibbosa Sweet, Phalaenopsis. mannii Rchob.f, Phalaenopsis. braceana (Hook.f),
Christenson, Phalaenopsis. Lobbii (Rchob.f), Phalaenopsis. fuscata Rchob.f. Hầu
hết đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc sặc sỡ và hương thơm độc đáo. Bên cạnh những
loài lan Hồ điệp thuần chủng, những người yêu thích loài hoa này không ngừng sưu
tầm, nhập và thuần dưỡng các giống ngoại khiến chủng loại, màu sắc của lan Hồ
điệp ở nước ta ngày càng đa dạng.
1.2. Vị trí phân loại
Giới Plantae Thực vật
Ngành Magnoliophyta Ngọc lan
Lớp Liliopsida Hành
Phân lớp Lilidae Hành
Bộ Orchidales Lan
Họ Orchidaceae Lan
Chi Phalaenopsis Lan Hồ điệp
Loài Phalaenopsis amabilis Lan Hồ điệp trắng
https://bienphap.net/

7
Hình 1: Sự đa dạng về màu sắc và hình dáng của Phalaenopsis sp.
https://bienphap.net/

8
1.3. Đặc điểm thực vật
1.3.1. Cơ quan sinh dƣỡng
1.3.1.1. Thân
Cây đơn thân, không có giả hành. Các đốt thân rất ngắn và thường được bao
bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân.
1.3.1.2. Lá
Lá đơn nguyên dày, mọng nước, không cuống và có bẹ ôm lấy thân. Lá có
hình elip thuôn hay hình lưỡi mác. Lá mang đặc tính của thực vật CAM.
1.3.1.3. Rễ
Rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá. Rễ phát triển mạnh,
màu lục, xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc (velamen). Lớp mô xốp này dễ
dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây đồng thời đóng vai trò
đặc biệt quan trọng trong việc giữ nước. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp.
1.3.2. Cơ quan sinh sản
1.3.2.1. Hoa
Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa). Hoa mọc thành cụm,
lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba
mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu
sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị
và nhụy dính liền thành một cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối
phấn, có chuôi và gót nằm ở phía dưới. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới.
Bộ nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn (Hoàng Thị
Sản, 2003).
1.3.2.2. Quả
Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai
bên đường của gió noãn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, số lượng tùy vào từng loài.
Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại
nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào. https://bienphap.net/

9
1.3.2.3. Keiki
Keiki theo tiếng Indonesia có nghĩa là “bé con” là một cây con mọc ra từ một
mắt trên thân hay cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả đầu tiên vào
năm 1894. Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo
ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ.
Người ta có thể tách cây con này để nhân giống và cho tỷ lệ sống sót rất cao.
2. Một số yếu tố cần thiết trong nuôi cấy mô lan
2.1. Các chất hấp phụ phenol
Vấn đề thường gặp nhất khi nuôi cấy để nhân giống Phalaenopsis là hàm
lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol khuếch tán vào môi trường làm
oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là làm mẫu
cấy hóa nâu hoặc đen và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1997; Fast, 1979).
Hiện nay có rất nhiều phương pháp để loại trừ hoặc làm giảm nồng độ của các
chất tiết này, chẳng hạn như dùng các chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol,
polyvinylprolidone, than hoạt tính và nhiều loại chất khác. Hầu hết các phương
pháp này thường đi kèm với việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới sau một
thời gian nuôi cấy.
Ngày nay than hoạt tính (AC – Activated Charcoal) được sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung AC ở nồng độ thích hợp vào môi
trường nuôi cấy mô Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ bị loại
bỏ giúp mô sinh trưởng tốt (Arditi và Ernst, 1993, 2000).
AC được thêm vào môi trường dinh dưỡng ở các giai đoạn nuôi cấy khác
nhau. Chồi của nhiều loài cây hình thành rễ dễ dàng hơn khi trong môi trường có bổ
sung thêm AC. Không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng AC đặc biệt có thể
làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thụ nhiều cơ chất khác nhau, mà các
cơ chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường ở nhiệt độ cao, một số
chất có thể tiết ra từ các vết thương khi tách mẫu cấy cũng như các chất điều hòa
sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, các hợp chất có gốc phenol (Fridborg và https://bienphap.net/

10
cộng sự, 1978; Ammirato, 1983; Ebert và cộng sự, 2000; Geogre, 1993; Pan và
Staden, 1999; Wann và cộng sự, 1997).
Ngoài ra, AC khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ hấp thu những chất làm
kìm hãm, đặc biệt là do các hợp chất có bản chất phenol tiết ra làm môi trường hóa
nâu, gây độc cho mẫu cấy. Biện pháp bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đặc biệt
có hiệu quả trên các loài Phalaenopsis, Cattleya, Aerides. AC cũng ảnh hưởng đến
pH của môi trường nuôi cấy. Nhiều báo cáo thí nghiệm cho thấy AC còn tỏ ra thích
hợp cho sự hình thành rễ chồi nuôi cấy trong môi trường in vitro (Duma và cộng sự,
1995; Geogre và Sherriington, 1984; Nguyễn Văn Kết và cộng sự, 2004).
2.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng (Phytohormone)
Đây là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy. Chất điều hòa
sinh trưởng là hormone thực vật bao gồm các hợp chất hữu cơ có bản chất khác
nhau dùng để điều hòa các hoạt động sinh lý, quá trình sinh trưởng và phát triển,
được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong cây.
Bằng con đường tổng hợp nhân tạo người ta có thể tạo ra các hợp chất có công
thức hóa học tương tự với các chất trong tự nhiên, dùng để kích thích các hoạt động
sinh lý của cây.
Chất điều hòa sinh trưởng được chia làm hai nhóm chính là chất kích thích
sinh trưởng và chất ức chế sinh trưởng. Hai nhóm chất này tuy có tác dụng đối
kháng về mặt sinh lý nhưng chúng luôn tồn tại cùng nhau trong cơ thể thực vật.
Các chất kích thích sinh trưởng chỉ tác động lên mô cấy ở liều lượng thấp, khi
ở liều cao chúng có thể gây độc cho mô cấy, vì vậy mà một vài chất kích thích được
dùng làm thuốc diệt cỏ.
Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuôi cấy in-vitro
đó là: auxin và cytokinin.
2.2.1. Auxin
Bao gồm một số hợp chất chứa nhân indol trong phân tử như: IBA; NAA;
IAA; 2,4-D. Trong đó IAA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số loài cây; 2,4-
D sử dụng có hiệu quả cho việc tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật. https://bienphap.net/

11
Trong nuôi cấy mô in vitro, các auxin gây ra hàng loạt các biến đổi như: sinh
trưởng của mẫu qua hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá
trình trao đổi chất, tham gia sự điều chỉnh phân hóa của rễ, chồi… Các auxin đều có
hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích hoạt sự phân hóa rễ,
ngược lại ở nồng độ cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo (Dương Công Kiên,
2003).
Phôi lan có đáp ứng đáng kể đối với auxin. Theo Curtis và Nichol (1984), IAA
có khả năng ức chế sự tăng trưởng của phôi trong các giai đoạn đầu sau khi nảy
mầm. Nhiều tác giả sau này nhận thấy auxin có tác động lên sự tăng trưởng và nảy
mầm của phôi lan ở nhiều giống lan lai khác nhau (Withner, 1953, 1955; Mariat,
1952). Ở một số giống lan biểu sinh, auxin (α-naphthalene acetamide) không ảnh
hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng có tác động lên sự tăng trưởng của chồi và
rễ (Yates và Curtis, 1949). Một số báo cáo khác cho rằng auxin có hoạt tính khi
được sử dụng cùng với các dịch chiết có hoạt tính kích thích tăng trưởng như: nước
dừa (Hegarty, 1955), nước cà chua (Meyri, 1954) và rất khó có thể quan sát độ ảnh
hưởng riêng rẽ của auxin (Dương Công Kiên, 2000).
2.2.2. Cytokinin
Là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được khám phá do những cố gắng tìm
hiểu yếu tố kích thích sự phân chia tế bào thực vật. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin
khác nhau đã được cô lập. Ngày nay cytokinin là tên gọi dùng để chỉ một nhóm chất
thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính gần giống nước dừa hay kinetin.
Trong nuôi cấy mô thường sử dụng là kinetin, 2iP và BAP. Đối với nuôi cấy
mô lan người ta thường sử dụng BA cho vào môi trường để kích thích tạo sơ khởi
chồi, tạo cụm chồi hay tạo tiền củ lan vì BA có giá thành rẻ và hoạt tính cao.
Cơ quan tổng hợp cytokinin trong cây là hệ thống rễ. Từ rễ, cytokinin được
vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều với auxin nhưng
không có tính phân cực rõ ràng như auxin. Ngoài rễ, một số cơ quan non đang sinh
trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ cytokinin. https://bienphap.net/

12
Đặc tính của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng
đến sự tạo chồi bất định, ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan
của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi, kìm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây
nguyên vẹn, do đó nó được coi là hormone trẻ hóa, kích thích sự nảy mầm của hạt
và của chồi ngủ, giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein.
Trong thân và rễ, cytokinin có vai trò: cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự
tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ); kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá
trưởng thành; kích thích sự hình thành củ và sự phình to của củ. Trong mối tương
tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây. Cytokinin làm yếu
hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều.
Theo Skoog:
 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ thu được chức năng tạo rễ.
 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp mô sẽ phát sinh chức năng tạo thân.
 Nếu tỷ lệ này gần 1 đơn vị ta sẽ thu được mô sẹo (Dương Công Kiên, 2006).
Ngoài auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta còn sử
dụng các phytohormone khác như: GA (Gibberellic acid); ABA (Abscissic acid);
Etylen…
2.3. Nƣớc dừa và các dung dịch hữu cơ khác
Nước dừa được sử dụng rộng rãi như là chất kích thích tăng trưởng trong nuôi
cấy phôi.
Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi của “Datura” và năm
1949 nuôi mô của “Daucus”. Kết quả phân tích thành phần nước dừa từ non đến già
của Tulecke và cộng sự (1961) cho thấy trong nước dừa có:
● Amino acid dạng liên kết có trong protein và lipid.
● Acid hữu cơ.
● Một số loại đường như: glucose, sucrose, fructose…
● Các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside. https://bienphap.net/

13
Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của các chất có trong nước dừa
nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh
là có chứa zeatin (Letham, 1974).
Khi nuôi cấy phôi lan nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng
và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961).
Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như:
nước chiết cà chua (Meyerm, 1954; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957),
dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1974, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì,
lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái
khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1974; Mariat, 1952; Withner, 1953).
2.4. Carbohydrate
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên
các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình
quang hợp cung cấp mà chính là do nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới
dạng đường. Hai dạng đường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy in vitro là
glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Trong một
vài trường hợp fructose cũng được sử dụng. Glucose có hiệu quả tương tự như
sucrose còn fructose ít có hiệu quả hơn. Các nguồn carbohydrate khác cũng được
tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các
carbohydrate này kém hiệu quả hơn sucrose và glucose. Nồng độ sucrose trong nuôi
cấy thường từ 2 – 3%.
Sucrose trong môi trường sẽ dễ dàng bị phân cắt ra thành glucose và fructose.
Glucose được mô sử dụng trước, sau đó mới đến fructose. Sucrose cũng bị thủy giải
một phần trong quá trình hấp tiệt trùng môi trường. Một vài loài thực vật tăng
trưởng tốt trong môi trường có sucrose hấp tiệt trùng so với môi trường có sucrose
lọc vô trùng và người ta cho rằng khi tế bào được nuôi trong môi trường có sucrose
hấp tiệt trùng thì nó vừa được cung cấp glucose vừa sucrose (Nguyễn Đức Lượng,
Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
2.5. Ảnh hƣởng của pH https://bienphap.net/

14
Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng,
khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy, việc xác định chính xác
và điều chỉnh pH trong môi trường là rất cần thiết. Murashige và Skoog (1962) nhận
thấy rằng độ pH từ 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong
môi trường MS. Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh
pH = 5.
Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH (đôi khi cũng sử
dụng KOH) hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trường. Có thể chỉnh pH bằng pH kế
để bàn, pH kế cầm tay hoặc giấy đo pH. Thường thì pH môi trường được điều chỉnh
trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường. Mann và
cộng sự (1982) nhận thấy rằng nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7
thì sau khi hấp tiệt trùng pH sẽ giảm xuống còn 5. Nếu muốn pH từ 5,7 – 5,9 trước
khi cấy thì trước khi hấp tiệt trùng phải điều chỉnh pH = 7. pH của môi trường cũng
sẽ thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy, do đó có nhiều nhà nghiên cứu đã cho vào
một chất có màu sắc thay đổi theo pH để theo dõi sự thay đổi pH trong môi trường.
Chất chỉ thị thường được sử dụng là chlorophenol đỏ 1 – 5 mg/l (Reinert và White,
1956; Risser và White, 1964; Henson, 1979; Binns và Meins, 1980) và
bromocressol đỏ tía. Tuy nhiên, một vài chất chỉ thị có thể gây độc cho mẫu cấy
như BDH 4460 cản trở sự tăng trưởng của tế bào trần Petunia (Roscoe và Bell,
1981).
3. Tổng quan về phôi
3.1. Phôi hữu tính ở thực vật họ lan
Phôi của các loài thực vật họ lan có kích thước rất nhỏ và chưa phân hóa. Quá
trình phát triển ở phôi lan có thể phân biệt với phôi của các loài thực vật có hoa
khác như sau:
+ Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm.
+ Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu → dạng khiên → dạng diệp tiêu.
+ Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm. https://bienphap.net/

15
Giai đoạn đầu của phôi ở các loài thực vật họ lan tương tự với những loài thực
vật có hoa khác (Veyret, 1965, 1974). Sự khác biệt giữa phôi của các loài họ lan với
các họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi hình cầu. Ở các
thực vật có hoa khác tất cả tế bào của phôi cầu đều thuộc mô phân sinh. Riêng phôi
lan chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia để kéo dài, còn các
tế bào khác sẽ không phân chia hay tăng kích thước. Vì vậy, phôi lan có hai vùng
phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn.
Dựa vào đặc tính phát sinh tử diệp, phôi lan được phân chia làm hai nhóm:
+ Nhóm phôi không mang tử diệp: các phôi này thường có hình bầu dục,
chẳng hạn ở loài Dactylorhiza baltica.
+ Nhóm phôi mang tử diệp: các phôi này thường có hình thuôn dài, chẳng hạn
ở Polystachya microbambusa, Dendrochilum glumaceum.
Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên ở protocorm ở cả hai nhóm có thể xem là tử
diệp (Burgeff, 1936; Teryokhin, 1977) hoặc lá (Batygina và Vasilyeva, 1983), một
số nghiên cứu khác còn cho rằng tất cả cấu trúc dạng lá hình thành đầu tiên ở
protocorm đều là tử diệp (Teryokhin, Nikiticheva, 1968). Ở phần cực của protocorm
và phôi là một cực chồi, tại cực này các lá (hoặc tử diệp) phát triển bao quanh cực
chồi (ở Listera ovata) hoặc hình thành dạng lưỡi liềm (ở Dactylorhiza baltica).
Phôi lan bao gồm vỏ phân sinh ngọn, nhu mô và một cực chồi. Mô mạch
không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy phôi lan không chứa vùng mô phân
sinh rễ. Trong khi đó, phôi các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực chồi,
rễ. Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan với các loài thực vật có hoa khác.
3.2. Phát sinh phôi vô tính
3.2.1. Khái niệm về phôi vô tính
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng chỉ một
khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà
dưới những điều kiện thích hợp có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng
hoàn chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2006). https://bienphap.net/

16
Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào
không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng mang tính
toàn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa
hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự
lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi
hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gen cần thiết. Sau khi đã hoàn toàn thoát
khỏi chức năng trước đó của tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang tính
toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng
tương tự như tế bào trứng đã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995).
Williams và Maheswran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình
thành từ một tế bào đơn hoặc từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân
chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây
con. Cây có thể phát triển từ một hoặc từ một cụm tế bào phôi.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có quá
trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh
giữa giao tử đực và giao tử cái. Về nguyên tắc tất cả các cây con tái sinh bằng con
đường này thì đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng cha mẹ, nếu
tế bào này được chuyển gen thì các cây tái sinh là các cây chuyển gen (Nguyễn Văn
Uyển, 1992). Nhân giống thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số
nhân rất cao (Dương Tấn Nhựt, 2006).
3.2.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phôi vô tính
Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền
cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn thiện với đầy đủ các
chức năng cần thiết. Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gen ở thực vật
được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của
rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết
thúc sự biểu hiện của một gen trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó
bằng sự biểu hiện của gen sinh phôi. Giả thuyết này được đưa ra lần đầu tiên do
Evans và cộng sự (1981), Sharp và cộng sự (1982). Đây cũng là người đầu tiên đưa
ra một số các thuật ngữ như IEDC – inducec embryogenic determined cell nhằm mô https://bienphap.net/

17
tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh
phôi. Những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen
sinh phôi thì được gọi là thuật ngữ PEDC – pre-embryogenic determined cell. Cả
IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả
hai có thể được gọi chung bằng thuật ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay
gọi đơn giản là EC – embryogenic cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi
vì sự hình thành phôi vô tính không phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của
các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy các tế bào sinh phôi này có tính mềm dẻo
trong một số trường hợp (Carman, 1990).
Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô mẫu
có chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mô cấy chứa các PEDC thì chỉ cần một sự kích
thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình
thành phôi vô tính trực tiếp bởi vì phôi xuất phát trực tiếp từ mô cấy. Ngược lại, nếu
các mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng
cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin
trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang
Việt, 2002). Các tế bào được sinh ra do nhiều lần nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo,
và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua
giai đoạn tạo mô sẹo (Merkle và cộng sự, 1995). Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo
sang trạng thái sinh phôi đi kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống
từ định hướng ngẫu nhiên để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau
(Wochok, 1973).
Trong thực tế, một mô cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có
đặc tính sinh phôi và không sinh phôi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mô cấy đó.
Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính. Từ đó có thể giải
thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phôi của các loại mô cấy khác
nhau (Merkle và cộng sự, 1995).
3.2.3. Sự phát sinh phôi từ tế bào soma
Sự phát sinh phôi từ tế bào soma được định nghĩa là một quá trình mà trong đó
một hoặc vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm có thể tham gia vào sự https://bienphap.net/

18
phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hoặc gần
giống như phôi hợp tử.
Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phôi có
các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến
dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không bào
giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các
tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới
nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Thorpe, 1988). Các tế bào có khả
năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các tế bào không có khả năng sinh phôi
dựa trên những đặc tính trên.
Sự sinh phôi từ tế bào soma trải qua hai giai đoạn:
(1) Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào
trong môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất
tính hữu cực.
(2) Mô sẹo từ giai đoạn (1) sẽ được chuyển vào môi trường có ít hoặc không
có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với
trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối.
3.2.4. Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lƣợng phôi
Cho dù nguồn gốc của các tế bào sinh phôi là IEDC hay PEDC thì chức năng
của các tế bào này là như nhau. Tế bào từ cả hai nguồn gốc này đều có thể phát triển
thành phôi vô tính hoặc tham gia vào một chu kỳ mới nhằm sản sinh ra ngày càng
nhiều các tế bào sinh phôi (MeCoy, 1987).
Sự gia tăng các tế bào phôi có nhiều kiểu khác nhau và chịu ảnh hưởng bởi
nhiều nhân tố, một vài nhân tố có thể điều khiển được trong quá trình nuôi cấy và
một số khác thì không. Những nhân tố được nghiên cứu trong việc tăng sinh các tế
bào sinh phôi thì tương tự như những nhân tố tác động trong cảm ứng tạo phôi.
Chẳng hạn như các chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng nitơ, loài thực vật và kiểu
gen của mẫu cấy. Trong trường hợp tăng sinh các tế bào sinh phôi, các nhân tố này
không chỉ quyết định khả năng duy trì và tiếp tục trạng thái sinh phôi mà còn ảnh https://bienphap.net/

19
hưởng đến đặc điểm của chu trình sinh phôi lặp lại. Do đó, các nhân tố này chịu
trách nhiệm kiểm soát những biến đổi trong giai đoạn phát triển của phôi vô tính để
thúc đẩy việc gia tăng các tế bào sinh phôi hoặc kiểm soát những vị trí hay vùng
trên phôi sơ cấp có thể sinh ra các phôi mới (Mekle và cộng sự, 1995).
3.2.5. Một số vấn đề thƣờng gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính
Trước hết, đó là sự xuất hiện các phôi dị thường. Các lá mầm có thể bị xoắn
lại, mô phân sinh ngọn chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể
thiếu. Những trường hợp này cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất
hiện bình thường và sự phát triển của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến
vừa phải các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: acid abscissic hoặc
những cách xử lý thấm lọc cao, hay bằng những phương pháp vật lý khác như sấy
khô (Parrott, 1988).
Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị
biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Tuy nhiên, những trường hợp
đó ít xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những
cây được phát sinh từ tái sinh cơ quan (Ammirato, 1987). Nếu những cây được sử
dụng với mục đích nhân giống, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan trọng
bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho những đặc điểm
tiêu biểu. Nếu những cây được sử dụng cho mục đích sản xuất thì những kiểu biến
dị nên loại bỏ.
Một điều đáng lưu ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan là
không loại trừ nhau. Vì vậy, những phương pháp làm phát sinh phôi và tái sinh cơ
quan được kết hợp để tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Một điều thú vị là trên cùng
môi trường thuận lợi cho sự phát sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi
trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài.
3.3. Đặc điểm của nuôi cấy phôi vô tính
Phôi vô tính có thể xuất hiện trong điều kiện in vitro từ ba nguồn tế bào lưỡng
bội (2n) nuôi cấy đó là: tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành, các mô tái sinh https://bienphap.net/

20
không phải là hợp tử, các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con, không có
bất cứ sự phát triển nào của mô sẹo.
Bản chất các phôi ngẫu nhiên phát triển như thế nào vẫn cần phải nghiên cứu
nhiều hơn nữa. Phát sinh phôi vô tính có thể được khởi đầu theo hai con đường:
phát sinh phôi trực tiếp từ mô nuôi cấy không qua giai đoạn trung gian tạo mô sẹo,
phôi được hình thành từ những tế bào tiền phôi.
Mặc dù các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của
chúng có thể bị ngăn cản do sự mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi
cấy. Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu
môi trường có nồng độ auxin cao sau khi các tế bào phôi đã biệt hóa (Kolenbach,
1978). Hai loại môi trường khác nhau có thể được sử dụng: một môi trường dùng để
tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi và một môi trường khác để cho các tế bào
đó phát triển thành phôi. Môi trường thứ nhất thường phải có auxin, còn môi trường
thứ hai không có auxin hoặc ở nồng độ rất thấp. Đối với một số thực vật các giai
đoạn trên có thể xảy ra ở môi trường thứ nhất, môi trường thứ hai được dùng cho sự
phát triển của cây con (Ammiratom, 1983).
Những thành phần hóa học quan trọng nhất trong môi trường cảm ứng là auxin
và nitơ dạng khử. Lượng nitơ khử cần thiết trong cả môi trường thứ nhất và môi
trường thứ hai (Ammirato, 1983). Trong nuôi cấy Cà rốt dại, việc bổ sung 10mM
NH4Cl vào môi trường phát triển phôi có chứa 12 – 40mM HNO3 (Wetherell and
Dougall, 1976). Các nguồn nitơ khác không đặc hiệu cho cảm ứng phát sinh phôi
mặc dù ở nồng độ thấp, các dạng nitơ hữu cơ có hiệu quả hơn các dạng nitơ vô cơ.
Vai trò của cytokinin trong quá trình phát sinh phôi không rõ ràng do những
kết quả trái ngược. Ở huyền phù tế bào Cà rốt, khi cấy chuyền sang môi trường
không có auxin nhưng có zeatin ở nồng độ 0,1μM đã kích thích sự phát sinh phôi,
quá trình này bị ức chế khi bổ sung thêm kinetin hoặc BAP vào môi trường nuôi
cấy (Furimura and Komamine, 1975). Tác động ức chế của các cytokinin ngoại sinh
có thể là do làm tăng các cytokinin nội sinh trong quá trình phát triển của phôi (Al-
Abta and Collin, 1979). https://bienphap.net/

21
Môi trường nuôi cấy có chứa than hoạt tính tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình phát sinh phôi trong một số môi trường nuôi cấy. Cảm ứng phát sinh phôi đã
thành công trên môi trường có bổ sung than hoạt tính (Fridborg and Eriksson, 1975;
Drew, 1979). Các bằng chứng cũng cho thấy than hoạt tính hấp phụ nhiều chất ức
chế cũng như các chất kích thích sinh trưởng.
Phát sinh phôi xảy ra trong một thời gian ngắn và khả năng này giảm dần khi
tăng thời gian nuôi cấy (Reinert và cộng sự, 1977). Tuy nhiên, cũng có những ngoại
lệ, phát sinh phôi cũng có thể được duy trì vài năm trong nuôi cấy. Khi nuôi cấy Cà
rốt sau 4 – 6 tuần thì bắt đầu hình thành phôi và đạt tối ưu sau 15 tuần (Reinert và
cộng sự, 1971). Khả năng phát sinh phôi bị mất sau 36 tuần nuôi cấy in vitro, nhưng
khả năng này có thể cảm ứng lại một lần nữa khi chuyển các tế bào vào môi trường
thích hợp (Reinert, 1971). Việc mất tạm thời khả năng phát sinh phôi có lẽ là do
thiếu tạm thời sự sinh tổng hợp các chất phôi hóa. Ngoài ra, những thay đổi trong
mức đa bội của tế bào nuôi cấy có thể dẫn đến mất khả năng phát sinh hình thái
(Smith and Street, 1974).
3.4. Ảnh hƣởng của proline tới khả năng tăng sinh của phôi vô tính
Proline là một trong số 20 acid amin không thay thế được tạo thành từ
glutamate.
Proline riêng rẽ hoặc kết hợp với các amino acid
khác được biết là có tác dụng kích thích sự phát sinh
phôi vô tính ở thực vật. Proline kết hợp với serine, kích
thích sự phát sinh phôi vô tính ở những cây cỏ nón
(Trigiano và Conger, 1987). Proline riêng rẽ kích thích
sự phát sinh phôi vô tính in vitro ở cây ngô (Armstrong
và Green, 1985) và cà rốt (Nuti-Ronchi et al., 1984). Proline cũng gây cảm ứng phát
sinh phôi ở cây dâu tây (Nhựt và Sương, 2008).
3.5. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính
Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng trong thực tiễn
và có tính thương mại to lớn, đặc biệt trong vi nhân giống in vitro. Trên lý thuyết từ

Công thức cấu tạo của proline https://bienphap.net/

22
một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi. Tốc độ nhân giống
từ phôi cao hơn nhiều so với việc nhân giống từ mô phân sinh. Ngoài ra, số lượng
lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho những ứng dụng
thực tiễn khác như sản xuất hạt nhân tạo (Redenbaugh, 1993), phục tráng giống (là
nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gen, lai soma, lai tạo những cây đa bội),
bảo quản chất lượng mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến dưỡng in vitro và sự
thành lập khuẩn căn in vitro.
3.6. Đặc điểm của thực vật tái sinh từ con đƣờng hình thành phôi vô tính
Mặc dù kỹ thuật nuôi cấy tạo phôi vô tính có khả năng sản xuất một số lượng
đáng kể cây con ở vài loài thực vật có giá trị kinh tế nhưng việc khảo sát khả năng
sinh trưởng và phát triển của cây có nguồn gốc từ phôi trong điều kiện ex vitro thì
vẫn cần được nghiên cứu kỹ. Về nguyên tắc thì phôi vô tính không giống như phôi
hữu tính là nó không phải trải qua quá trình trao đổi chéo và tái tổ hợp của DNA, do
đó phôi vô tính tiêu biểu cho một hệ thống nhân giống vô tính mà trong đó cây con
được tạo thành vẫn duy trì các đặc tính của cây bố mẹ. Nếu nó sinh ra đột biến thì
đó là đột biến trong quá trình nuôi cấy in vitro. Điều này rất quan trọng trong nhân
giống cây trồng vì phải duy trì tính đồng nhất của các cây nhân giống.
4. Phƣơng pháp giải phẫu học
Các bước thực hiện giải phẫu học của lan Hồ điệp:
- Tạo các lớp cắt mỏng của mẫu cấy theo chiều ngang, dọc đi qua trục phôi,
PLB, rễ, thân.
- Ngâm các mẫu đã cắt trong nước Javel 10% trong thời gian 15 phút.
- Rửa sạch mẫu bằng nước cất, tiếp theo ngâm mẫu trong acid acetic 55%
trong thời gian 15 phút để cố định mẫu.
- Ngâm mẫu đã ráo trong phẩm nhuộm hai màu trong thời gian 2 phút.
- Rửa lại mẫu bằng bình phun nhỏ giọt cho đến khi nước trong đĩa petri ngâm
mẫu không còn phẩm nhuộm (khoảng 2 phút).
- Ngâm mẫu trong nước cất để bảo quản mẫu. https://bienphap.net/

23
- Đặt mẫu lên lame, nhỏ lên mẫu một giọt nước cất hoặc giọt glycerine, đặt
lamenle lên. Chú ý thao tác nhẹ nhàng đặt lamele tạo với lame kính một góc 45° rồi
thả lamele nhẹ nhàng xuống, tránh tạo bọt khí.
- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học, ban đầu ở vật kính xa, sau chuyển
lên ×10, ×40.
- Quan sát cấu trúc, chụp hình và nhận xét. https://bienphap.net/

24
Hình 2: Hình thái của phôi, PLB và cụm chồi thu được ở các giai đoạn khác nhau.
(a): hình thái phôi trên kính hiển vi soi nổi; (b): hình thái cụm PLB trên kính hiển vi
soi nổi; (c): 1 cụm mẫu thu được bao gồm cả phôi và PLB trên kính hiển vi soi nổi.
(a1), (a2), (a3): hình thái giải phẫu của phôi. (b1), (b2), (b3): hình thái giải phẫu của
PLB. (d1): phôi ở giai đoạn chuyển tiếp trên kính hiển vi soi nổi; (d2): PLB hình cầu
trên kính hiển vi soi nổi; (d3): PLB đang giai đoạn chuyển tiếp sang thể chồi quan sát
được trên kính hiển vi soi nổi. (e): Quy trình nhân giống lan Hồ điệp từ phôi vô tính.
https://bienphap.net/

25
PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử & Chọn tạo giống
cây trồng, Viện Sinh học Tây Nguyên.
Thời gian tiến hành đề tài: từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 5 năm 2009.
2.2. Mục đích
Chuẩn hóa một số yếu tố môi trường cho quá trình nhân nhanh phôi vô tính lan
Hồ điệp.
Sử dụng phương pháp phát sinh phôi vô tính trong nhân giống nhanh cây lan
Hồ điệp; tạo ra cây trồng với số lượng lớn và ổn định về mặt di truyền khi so sánh
với các phương pháp nhân giống khác.
2.3. Vật liệu
2.3.1. Nguồn mẫu ban đầu
Đối tượng nghiên cứu là cây P. amabilis. Nguồn mẫu phôi ban đầu có sẵn tại
viện Sinh học Tây Nguyên.
2.3.2. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường chứa trong các bình thủy tinh loại 250ml, 500ml và bình tam giác
thể tích 350ml. Thể tích môi trường đối với loại bình 250ml là 40ml/1bình, đối với
loại bình 500ml và bình tam giác là 70ml/1bình.
Đối với các môi trường ra cây con được điều chỉnh về pH = 5,3. Đối với các
loại môi trường sử dụng cho nhân nhanh phôi được điều chỉnh về pH trong khoảng
5,7 – 5,8.
Sau đó toàn bộ môi trường này được đem đi hấp khử trùng trong autoclave ở
nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút.
2.3.2.1. Môi trƣờng nhân nhanh phôi
Trong tất cả các môi trường thí nghiệm, môi trường sử dụng cho nhân nhanh
phôi là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), có bổ sung thêm các thành https://bienphap.net/

26
phần sau: 30 g/l đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; tùy vào điều kiện thí
nghiệm sẽ bổ sung nước dừa và nước gạo có nồng độ khác nhau. Chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm nhân nhanh phôi là BA (2 mg/l) và
NAA (0,5 mg/l).
2.3.2.2. Môi trƣờng ra cây
Khi các phôi phát triển thành dạng PLB sẽ được chuyển sang môi trường
không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Sau khi các cụm PLB phát triển thành
dạng cụm chồi thì tiến hành cấy chuyền sang môi trường ra cây.
Trong quá trình nuôi cấy phôi, một số phôi cũng phát triển trực tiếp thành
chồi. Những cụm chồi này sẽ được cấy chuyền trực tiếp sang môi trường ra cây.
Môi trường ra cây được dùng là: môi trường Vacin-Went có bổ sung 30 g/l
đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 0,5 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20%
nước dừa. Kí hiệu môi trường là VW.
2.3.3. Điều kiện nuôi cấy
2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày
Cường độ ánh sáng: 2.500 – 3.000 lux
Nhiệt độ: 25 ± 2°C
Độ ẩm trung bình: 75 – 80%
2.3.3.2. Điều kiện trong vƣờn ƣơm
Nhiệt độ: 18 – 25°C
Độ ẩm trung bình: 80 – 85%
Che bóng râm bằng lưới đen 70%
2.4. Phƣơng pháp thí nghiệm
2.4.1. Quy trình nuôi cấy in vitro
Nguồn mẫu phôi ban đầu được lấy từ nguồn mẫu có sẵn tại viện Sinh học Tây
Nguyên. Trong các bình mẫu ban đầu bao gồm cả các cụm PLB, phôi và một số đã https://bienphap.net/

27
phát triển thành chồi. Các cụm PLB, chồi được cấy riêng vào môi trường ra cây
(VW). Còn các phôi sẽ được nuôi cấy riêng vào môi trường nhân nhanh phôi (np)
để tạo nguồn mẫu cho các thí nghiệm sau. Các mẫu phôi ban đầu bao gồm dạng
phôi màu vàng xốp, một số khác màu xanh, một số phôi bị khô do chất dinh dưỡng
trong môi trường nuôi cấy đã sử dụng hết, một số khác màu trắng vàng và bị ướt,
rời rạc nhau do trong quá trình hấp vô trùng môi trường bị biến tính bởi nhiệt độ cao
dẫn tới hiện tượng không đông của agar. Các nguồn mẫu phôi khác nhau này sẽ
được cấy phân loại riêng để theo dõi.
Cấy 5 mẫu cho mỗi bình thủy tinh có thể tích 500ml và bình tam giác 350ml.
Đối với bình thủy tinh thể tích 250ml thì cấy 3 mẫu cho mỗi bình. Mỗi mẫu cấy có
trọng lượng tươi trung bình khoảng 0,07 – 0,08g và có số lượng khoảng 120 – 130
phôi.
Sau khi được nhân lên với số lượng lớn nếu không được cấy chuyền kịp thời,
phôi sẽ biệt hóa thành PLB, một số khác phát triển trực tiếp thành cụm chồi. Các
PLB này được cấy chuyền qua môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
để chúng phát triển thành cụm chồi. Sau đó, tất cả các cụm chồi thu được sẽ cấy
chuyền vào môi trường ra cây.
Những cụm chồi sau khi được cấy chuyền vào môi trường ra cây sẽ phát triển
để hoàn thiện bộ rễ, số lượng lá, kích thước lá và đường kính thân. Khi phát triển
hoàn chỉnh, chúng sẽ được chuyển ra vườm ươm.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần tiến hành trên 20 bình nuôi cấy.
2.4.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của các mẫu phôi khác nhau tới
khả năng nhân nhanh phôi
Thí nghiệm này được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng của các loại mẫu phôi
khác nhau từ các bình mẫu ban đầu có sẵn.
Do các bình mẫu ban đầu phát triển không đồng nhất nên một số phôi đã biệt
hóa về dạng PLB màu xanh nhưng đường kính PLB nhỏ và khô do môi trường dinh
dưỡng đã sử dụng hết, một số phát triển thành cụm chồi và còn lại một số phôi sẽ https://bienphap.net/

28
được cấy chuyền để nhân nhanh số lượng phôi. Tuy nhiên, các phôi này không đồng
nhất với nhau. Một số màu vàng xốp, một số màu vàng lẫn xanh và xốp, một số
phôi khác lại có màu xanh xốp hoặc khô, ngoài ra còn có một số phôi màu vàng
trắng rời rạc nhau do môi trường nuôi cấy bị không đông agar.
Thí nghiệm được chia làm 4 nghiệm thức tương ứng với các dạng phôi: màu
vàng xốp; màu xanh xốp; xanh khô; vàng trắng bị ướt rời rạc nhau.
Môi trường được sử dụng cho thí nghiệm này là môi trường nhân nhanh phôi
(np): môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% nước dừa non; 30
g/l đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; pH =5,8.
2.4.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian giữ và cấy truyền phôi
Thí nghiệm này được tiến hành để xác định thời gian cấy chuyền phôi tốt nhất
cho việc nhân giống cũng như để giữ phôi.
Từ thí nghiệm 1, chúng tôi xác định được nguồn mẫu phôi ban đầu nào cho
khả năng nhân nhanh tốt nhất, sau đó tiến hành khảo sát thời gian tốt nhất để cấy
chuyền các phôi này.
Thí nghiệm được chia thành các 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Sau 4 tuần, 6 tuần và sau 8 tuần nuôi cấy thì tiến hành đếm, cân
trọng lượng tươi của mẫu cấy thu được nhằm xác định giai đoạn nào thu được sinh
khối cao nhất.
Giai đoạn 2: Tiến hành cấy chuyền các mẫu cấy thu được sau 4 tuần, 6 tuần và
sau 8 tuần để theo dõi sự phát triển của phôi từ ba nguồn mẫu này. Sau 12 tuần nuôi
cấy tiến hành cân để xác định trọng lượng tươi của mẫu cấy.
Môi trường được sử dụng cho thí nghiệm này là môi trường nhân nhanh phôi
(np): môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30 g/l đường sucrose; 8
g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 20% nước dừa.
Nguồn nước dừa được sử dụng cho hai thí nghiệm này được lấy từ những trái
dừa non có cơm dày khoảng 0,3 - 0,4cm. https://bienphap.net/

29
2.4.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc dừa già tới khả năng
tăng sinh của phôi
Thí nghiệm này được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng của nước dừa già (lấy
từ những trái dừa đã già có cơm dày 0,5 – 1cm) nhằm mục đích tìm ra môi trường
phù hợp nhất cho nhân giống lan Hồ điệp vừa cho hệ số nhân cao vừa giảm được
chi phí sản xuất, vì nguồn nước dừa non sử dụng cho nuôi cấy mô lan có giá thành
đắt gấp 7 - 8 lần so với giá thành của nguồn nước dừa già. Tuy nhiên, nguồn nước
dừa lấy từ những trái đã già thì hàm lượng các chất dinh dưỡng cũng như hàm
lượng cytokinin giảm đi do chúng được dùng để nuôi cơm dừa, nên trong thí
nghiệm này nồng độ nước dừa được tăng lên 30% thay vì sử dụng 20% nước dừa
lấy từ những trái còn non hơn như ở hai thí nghiệm trên, môi trường nuôi cấy và
nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng giống với thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2. Kí
hiệu môi trường là np3.
Sau 8 tuần và sau 12 tuần nuôi cấy thì tiến hành cân trọng lượng tươi của mẫu
cấy thu được.
Sau 12 tuần nuôi cấy, tất cả các chồi thu được sẽ cấy chuyền qua môi trường ra
cây (VW) nhưng có bổ sung 30% nước dừa già. Còn các phôi thì được cấy chuyền
vào môi trường Hw (môi trường Vacin-Went có bổ sung 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA;
30 g/l đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 30% nước dừa già; pH = 5,3).
2.4.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc gạo kết hợp với nƣớc dừa
ở các nồng độ khác nhau
Từ xa xưa, nước vo gạo đã được sử dụng để tưới cho các cây lan trồng làm
cảnh trong gia đình. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm mục đích xác
định ảnh hưởng của nguồn nước vo gạo tới quá trình nhân giống in vitro cây lan Hồ
điệp có nguồn gốc từ phôi vô tính.
Môi trường sử dụng cho thí nghiệm này là môi trường nhân phôi (np) có nồng
độ nước dừa, nguồn nước dừa, nồng độ nước gạo và sự kết hợp giữa nước gạo và
nước dừa ở các nồng độ khác nhau. Nguồn nước dừa non được lấy từ các trái dừa
còn non có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm; nước dừa già được lấy từ các trái dừa già https://bienphap.net/

30
có cơm dày khoảng 0,5 - 1cm. Nguồn nước gạo được lấy như sau: trong quá trình
vo gạo, không sử dụng nước vo gạo lần đầu mà sử dụng nước vo gạo ở lần thứ hai
và thứ ba nhằm loại bỏ các tạp chất có trong gạo. Lưu ý trong lần vo đầu tiên không
trà sát mạnh tránh làm mất các chất vitamin, đường, tinh bột có trong gạo. Sau đó
không sử dụng trực tiếp nguồn nước vo gạo này mà để lắng một thời gian để tinh
bột và các chất cần thiết lắng xuống đáy. Khi đó, phần nước trong phía trên loại bỏ
chỉ lấy phần nước đục phía đáy.
Thí nghiệm được chia làm 12 nghiệm thức như bảng 2.1
Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nước gạo kết hợp với nước dừa ở các nồng độ
khác nhau lên khả năng tăng sinh của phôi
STT NT
Nguồn nước dừa
Nước vo
gạo (%)
Nước dừa già (%) Nước dừa non (%)
1 DG2 20 0 0
2 DG3 30 0 0
3 G12 10 0 20
4 G15 15 0 15
5 NG2 0 0 20
6 NG3 0 0 30
7 NG35 0 0 35
8 N11 0 10 10
9 N12 0 10 20
10 G11 10 0 10
11 G21 20 0 10
12 L0 0 0 0
Tiến hành cân trọng lượng tươi của mẫu cấy thu được ở các nghiệm thức sau
thời gian 4 tuần, 8 tuần và sau 12 tuần. https://bienphap.net/

31
2.4.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của proline tới khả năng tăng sinh
của phôi
Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của
proline tới khả năng tăng sinh của phôi Hồ điệp.
Môi trường sử dụng trong thí nghiệm này là môi trường MS có bổ sung 2 mg/l
BA; 0,5 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính, pH = 5,8; proline
được bổ sung vào môi trường ở ba nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75 mg/l . Môi
trường đối chứng có bổ sung 20% nước dừa non (được lấy từ các trái dừa có cơm
dày 0,1 – 0,2cm).
Thí nghiệm được chia làm 4 nghiệm thức theo bảng 2.2
Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của proline tới khả năng tăng sinh của phôi
STT NT Nồng độ nước dừa (%) Nồng độ proline (mg/l)
1 ĐC 20 0
2 H0,25 0 0,25
3 H0,5 0 0,5
4 H0,75 0 0,75
Sau 4 tuần nuôi cấy tiến hành lấy mẫu cấy ra cân trọng lượng tươi và so sánh
với đối chứng.
2.4.2.6. Thí nghiệm 6: So sánh ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng
½MS tới khả năng tăng sinh của các mẫu phôi đã qua nhiều lần cấy chuyền
Sau một số lần cấy chuyền trên môi trường nhân phôi, chúng tôi nhận thấy hệ
số nhân phôi giảm dần, thậm chí xuất hiện các phôi bị hóa nâu, điều này có thể là
do hàm lượng BA nội sinh trong mẫu cấy cao. Vì vậy, thí nghiệm này được tiến
hành nhằm mục đích so sánh ảnh hưởng của môi trường ban đầu với môi trường có
nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng khoáng đa lượng, vi lượng trong
môi trường khoáng MS giảm đi một nửa (môi trường ½MS). Trong nước dừa già
hàm lượng cytokinin thấp hơn so với nước dừa non, nên trong thí nghiệm này
nguồn nước dừa già và nước gạo cũng được chúng tôi tiến hành khảo sát. https://bienphap.net/

32
Thí nghiệm được chia làm 5 nghiệm thức như bảng 2.3.
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường ½MS tới khả năng tăng
sinh của các mẫu phôi đã qua nhiều lần cấy chuyền
STT NT
Môi
trường
BA
(mg/l)
NAA
(mg/l)
NDN
(%)
NDG
(%)
NG
(%)
1 H0 MS 2 0,5 0 0 0
2 H1 MS 2 0,5 20 0 0
3 H2 ½MS 1 0,25 0 20 0
4 H3 ½MS 1 0,25 0 30 0
5 H15 ½MS 1 0,25 0 15 15
Chú thích: NDN: Nước dừa non, NDG: Nước dừa già, NG: Nước gạo
Tất cả các môi trường đều bổ sung 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt
tính, pH = 5,8.
Theo dõi hình thái và xác định trọng lượng tươi của mẫu cấy thu được sau 4
tuần và sau 8 tuần nuôi cấy.
2.4.2.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng phát triển của cây con có nguồn gốc
từ phôi vô tính
Các cây con có nguồn gốc từ phôi được hình thành từ các thí nghiệm trên được
cấy chuyền sang môi trường VW có bổ sung: 0,5 mg/l NAA; 0,5 mg/l BA; 20%
nước dừa; 1 g/l than hoạt tính; 30 g/l đường sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,3. Thí
nghiệm này nhằm mục đích khảo sát sự phát triển của cây con in vitro có nguồn gốc
từ phôi.
Sau thời gian 12 tuần nuôi cấy chúng tôi tiến hành lấy số liệu bao gồm: số
lượng rễ, số lượng lá, chiều dài rễ, chiều dài lá và trọng lượng tươi trung bình của
cây.
Trong quá trình nuôi cấy trên môi trường nhân phôi cũng có sự biệt hóa hình
thành các cụm chồi, sau đó các cụm chồi này phát triển thành các cây con. Do đó thí https://bienphap.net/

33
nghiệm này còn nhằm mục đích so sánh chất lượng của cây con hình thành trong
quá trình nuôi cấy phôi với những cây con có cùng nguồn gốc nhưng được cấy
chuyền qua môi trường VW.
2.4.2.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên
khả năng sinh trƣởng của con trong điều kiện in vitro
Thí nghiệm này được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy
chuyền lên khả năng sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro nhằm xác định
số lượng cây con cấy chuyền thích hợp trong một bình nuôi cấy vừa tiết kiệm môi
trường nuôi cấy vừa đảm bảo sự sinh trưởng của cây con là tốt nhất.
Các cây con được cấy chuyền vào bình thủy tinh có thể tích 500ml (80 ml môi
trường trong một bình) trên môi trường VW.
Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức như bảng 2.4 sau:
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của mật độ cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con
trong điều kiện in vitro
Nghiệm thức Mật độ (số cây/bình nuôi cấy)
R1 1
R2 3
R3 5
2.5. Phƣơng pháp xác định sinh khối
- Lấy phôi, PLB khỏi bình nuôi cấy tiến hành cân trên cân phân tích (Sartorius,
Đức) để xác định trọng lượng tươi trung bình của mỗi mẫu cấy ban đầu thu được.
- Tiến hành đếm số lượng phôi và số lượng PLB thu được.
- Các cây trước khi chuyển ra vườm ươm thì tiến hành xác định số lượng lá, số
lượng rễ, chiều dài lá, chiều dài rễ và trọng lượng trung bình của cây con.
2.6. Thống kê và xử lý số liệu
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel, 2003. https://bienphap.net/

34
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát mức độ tăng sinh của các mẫu phôi có
hình thái khác nhau
Sau 4 tuần nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng tươi thu được
của các mẫu cấy. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.1. Số lượng phôi, PLB
được tính trung bình cho 1 cụm phôi cấy ban đầu.
Bảng 3.1 Mức độ tăng sinh của các mẫu phôi khác nhau sau 4 tuần nuôi
cấy
U K X V
SL Phôi 12 128 302 415
SL PLB 0 0 8 0
U: Phôi bị ướt, có màu trắng do bị ngập trong môi trường dinh dưỡng ,
các phôi rời rạc nhau.
K: Phôi bị khô, màu xanh do môi trường dinh dưỡng đã sử dụng hết.
X: Phôi có dạng màu xanh đậm, xốp, một số đã xuất hiện lông hút, gần
như dạng PLB.
V: Phôi dạng vàng, xốp.
Từ bảng số liệu trên ta thấy các nguồn mẫu phôi khác nhau sẽ ảnh
hưởng khác nhau tới khả năng tăng sinh của mẫu. Sinh khối thu được cao
nhất là nguồn mẫu phôi có dạng vàng xốp. Đạt thấp nhất là các mẫu phôi
màu trắng, bị ngập trong môi trường dinh dưỡng do hiện tượng không đông
của agar (gây ra bởi nhiệt độ cao khi hấp vô trùng môi trường), chúng
thường ở dạng rời rạc nhau, không liên kết thành từng khối, nguyên nhân là
do những mẫu bị ngập trong môi trường dinh dưỡng sẽ thiếu oxygen, dẫn
đến quá trình hô hấp bị ức chế, kết quả là khả năng tăng sinh kém, chính vì
vậy sau khi được cấy chuyền trên môi trường thạch phôi vẫn tăng sinh
chậm. https://bienphap.net/

35
Những phôi có màu xanh đậm, xốp đã chuyển sang giai đoạn chuyển
tiếp thu được sinh khối cao, tuy nhiên vẫn kém hơn các mẫu phôi màu vàng
xốp. Mặt khác, khi quan sát trên kính hiển vi quang học một số mẫu đã
xuất hiện lông hút, chính vì vậy mẫu cấy thu được đã có sự hình thành PLB
( Hình 2.b).
Những dạng phôi bị khô, màu xanh là do môi trường dinh dưỡng đã sử
dụng hết hoặc là do mẫu nằm ở phía trên không được tiếp xúc trực tiếp với
môi trường dinh dưỡng. Do đó khi được cấy chuyền sang môi trường dinh
dưỡng mới, chúng phát triển trở lại bình thường. Tuy nhiên, hệ số nhân vẫn
kém hơn so với các dạng phôi màu vàng xốp và xanh xốp.
Từ đó, chúng tôi kết luận rằng: Nguồn mẫu phôi ban đầu có ảnh hưởng
rất lớn tới khả năng tăng sinh khối của phôi. Điều này cũng được thể hiện
rõ khi chúng tôi tiến hành quan sát sự phát triển hình thái của mẫu cấy, mặc
dù trên cùng một loại môi trường nhưng nếu nguồn mẫu ban đầu khác nhau
thì mẫu thu được sẽ có hình thái khác nhau. Nguồn mẫu phôi cho hệ số
nhân cao nhất là các mẫu phôi vàng xốp. Những phôi xanh khi cấy chuyền
sẽ biệt hóa trở về dạng màu vàng ở giai đoạn đầu , về sau chúng cũng
chuyển sang dạng xanh và cuối cùng là phát triển thành PLB. Thời gian giữ
được mẫu ở dạng phôi lâu nhất là những phôi dạng màu vàng xốp vì những
phôi ban đầu có màu xanh thường hình thành trực tiếp PLB sau một thời
gian ngắn nuôi cấy.
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian giữ và cấy truyền phôi
Sau 4 tuần nuôi cấy, số lượng phôi đã được nhân lên rõ rệt. Hệ số nhân
thu được tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy . Sinh khối đạt cao nhất là từ 6 –
8 tuần nuôi cấy. Sau 8 tuần nuôi cấy mặc dù các phôi vẫn tiếp tục nhân lên
nhưng đã có hiện tượng hóa nâu và chết đi của một số mẫu phôi. Vì vậy sau
6 – 8 tuần nuôi cấy nên tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Nguồn
mẫu phôi được sử dụng cho thí nghiệm này là các phôi có dạng màu vàng
xốp. Kết quả thu được sau 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuôi cấy được ghi nhận
ở bảng 3.2.1 và hình 3.a https://bienphap.net/

36
Bảng 3.2.1 Tốc độ nhân nhanh của mẫu cấy sau các khoảng thời gian nuôi
cấy khác nhau
Ban đầu 4 tuần 6 tuần 8 tuần
TLT (g) 0,08 ± 0,01 0,78 ± 0,06 1,60 ± 0,05 1,82 ± 0,03
Số lượng 125 ± 5 202 ± 7 340 ± 4 378 ± 15 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Ban đầu4 tuần6 tuần8 tuần
Thời gian nuôi cấy
Trọng lƣợng tƣơi
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Số lƣợng phôi
m (g)
Số lượng

Biểu đồ 3.1 Tốc độ tăng sinh của phôi sau các khoảng thời gian khác nhau
Sinh khối thu được gấp 9,75 lần mẫu ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy, gấp
20 lần sau 6 tuần nuôi cấy và gấp 22,5 lần sau 8 tuần nuôi cấy. Từ đó có
thể thấy được hệ số nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy vô tính là rất
cao. Mặc dù tốc độ nhân của phôi vẫn tiếp tục tăng theo thời gian nuôi cấy,
tuy nhiên tốc độ nhân đã có sự giảm dần từ tuần thứ 6 - 7 trở đi. Từ tuần
thứ 6 - 8 hệ số nhân chỉ tăng thêm 2,5 lần (từ 20 lần → 22,5 lần), trong khi
đó từ tuần thứ 4 - 6 cho hệ số nhân tăng thêm 10,25 lần (từ 9,75 lần → 20
lần). Điều này cho thấy tốc độ nhân nhanh vượt trội hơn hẳn trong giai
đoạn từ 4 - 6 tuần nuôi cấy so với trong giai đoạn từ 6 - 8 tuần nuôi cấy.
Đồng thời sau khoảng 7,5 - 8 tuần nuôi cấy một số phôi đã hóa nâu (Hình
3.a1). Điều này là do trong quá trình nuôi cấy, mẫu tiết ra các hợp chất có
bản chất phenol, qua thời gian giữ phôi càng lâu thì hàm lượng của các hợp
chất này càng tăng lên, chính vì vậy làm cho các mẫu hóa nâu và chết đi.
Điều này được quan sát rất rõ khi nuôi cấy phôi Hồ điệp trên môi trường https://bienphap.net/

37
gelrite, sau 3 tuần nuôi cấy chúng tôi đã quan sát thấy ở một số bình nuôi
cấy có hiện tượng tiết phenol ra môi trường làm môi trường bị hóa vàng ở
vị trí xung quanh mẫu. Dó đó, sau 6 - 8 tuần nên tiến hành cấy chuyền phôi
sang môi trường mới.
Sau đó, các mẫu cấy ở giai đoạn được 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần sẽ tiếp
tục được cấy chuyền sang môi trường mới và theo dõi sự tăng sinh của
chúng nhằm xác định rõ hơn nữa ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới
khả năng tăng sinh của phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai thời gian giữ phôi
kéo dài hơn, do đó sau 12 tuần nuôi cấy chúng tôi mới tiến hành cân trọng
lượng tươi của các mẫu cấy để so sánh tốc độ nhân nhanh của các mẫu cấy
chuyền có nguồn gốc là 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuôi cấy. Kết quả thu được
ở bảng 3.2.2 và hình 3.b.
Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới khả năng tăng sinh
của phôi sau 12 tuần nuôi cấy
NT Nguồn mẫu ban đầu TLT (g) Số lượng phôi Số lượng PLB
1 4 tuần 2,02 ± 0,08 510 ± 5 70 ± 3
2 6 tuần 3,53 ± 0,16 730 ± 10 130 ± 5
3 8 tuần 1,16 ± 0,05 306 ± 7 18 ± 3
https://bienphap.net/

38

b
Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới khả năng tăng sinh của phôi
(a): phôi thu được tương ứng ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần. (a1): phôi sau
8 tuần nuôi cấy; (a2): phôi sau 6 tuần nuôi cấy; (a3): phôi sau 4 tuần nuôi cấy.
(b1), (b2), (b3): phôi ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần được cấy chuyền sau
12 tuần. (c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c7): phôi thu được ở các nghiệm thức P0,
P1, P2, P3, P4, P5, NG2 sau 21 tuần nuôi cấy. (d1), (d2), (d3), (d4): ảnh hưởng của
proline tới lên khả năng tăng sinh của phôi sau 4 tuần tương ứng ở các nồng độ 0
mg/l; 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75 mg/l. Trong đó (d1) là môi trường đối chứng có
bổ sung 20% nước dừa lấy từ các trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm.

https://bienphap.net/

39
Nguồn mẫu cấy ban đầu là 6 tuần đem nuôi cấy sẽ thu được trọng
lượng tươi, số lượng phôi, số lượng PLB trung bình cao nhất (trọng lượng
tươi trung bình thu được gấp 44,13 lần so với mẫu cấy ban đầu). Đạt thấp
nhất là các mẫu cấy 8 tuần (trọng lượng tươi trung bình thu được chỉ gấp
14,5 lần so với mẫu cấy ban đầu), ở dạng này cũng xuất hiện nhiều phôi
hóa nâu nhất (Hình 3.b1). Như vậy thời gian cấy chuyền phôi tốt nhất là
khoảng 6 tuần.
Tiếp tục theo dõi sự phát triển của các nghiệm thức này, chúng tôi
nhận thấy ở nghiệm thức 3 các phôi bị hóa nâu và chết đi rất nhiều, còn lại
thì chuyển sang dạng PLB và thể chồi sau đó phát triển trực tiếp thành cây
con. Ở nghiệm thức 2 cho hệ số nhân cao nhất sau 21 tuần nuôi cấy mỗi
mẫu cấy có trọng lượng tươi trung bình là 5,30g gấp 66,25 lần so với mẫu
cấy ban đầu. Ở nghiệm thức thứ 2 này hầu hết các phôi cũng chuyển sang
dạng chuyển tiếp màu xanh và dạng PLB, ngoài một số phôi đã phát triển
trực tiếp thành cây con (Hình 7.a2 và Hình 7.a3). Nghiệm thức 1 cho hệ số
nhân thấp hơn nghiệm thức 2 nhưng mẫu cấy duy trì được ở trạng thái phôi
cao nhất, một số vẫn ở dạng màu vàng xốp, một số chuyển sang dạng
chuyển tiếp màu xanh, một số ít cũng chuyển thành dạng PLB, tuy nhiên
các PLB thu được ở nghiệm thức 1 này có đường kính nhỏ hơn so với PLB
thu được ở nghiệm thức 2 và thường có hình cầu. Điều này được giải thích
là do tuổi của mẫu phôi ban đầu khi cấy chuyền có sự khác nhau, những
phôi càng được giữ lâu trước khi đem đi cấy chuyền thì độ tuổi càng già,
do đó khả năng chuyển thành dạng PLB cao hơn.
Từ tất cả các nghiệm thức trên chúng tôi kết luận rằng đối với các phôi
có màu vàng, xốp thì thời gian cấy chuyền tốt nhất là sau 6 tuần nuôi cấy.
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nguồn nƣớc dừa già tới khả năng
tăng sinh của phôi
Các thí nghiệm 1 và 2 đều sử dụng nước dừa lấy từ các trái dừa non có
cơm dày khoảng 0,3 – 0,4cm. Nước dừa từ lâu đã được biết đến như là một
chất không thể thiếu trong nuôi cấy mô lan. Trong nước dừa có chứa các https://bienphap.net/

40
acid amin, một số loại đường và đặc biệt có chứa cytokinin tự nhiên. Hàm
lượng cytokinin, acid amin, đường… trong nước dừa non thường cao hơn
so với nước dừa già (lấy từ những trái đã già) do trong những trái dừa già
các chất này đã được dùng để nuôi cơm của trái dừa. Chính vì vậy trong
nuôi cấy mô lan người ta thường sử dụng các loại nước dừa non để nuôi
cấy. Tuy nhiên, mục tiêu của nhân giống lan Hồ điệp ngoài tạo ra cây con
có chất lượng cao, đồng nhất, hệ số nhân cao thì giá thành cây giống cũng
là điều đáng quan tâm.
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nguồn nước dừa già được lấy
từ những trái có cơm dày khoảng 0,5 - 1cm. Vì trong nước dừa già hàm
lượng cytokinin, acid amin, đường… giảm đi do đó chúng tôi tăng nồng độ
nước dừa lên 30%. Kết quả thu được ở bảng 3.3 và hình 4.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nước dừa già tới khả năng tăng sinh của phôi
Phôi PLB Chồi
TLT (g) SL TLT (g) SL TLT (g) SL
Ban đầu 0,08 ± 0,01 125 ± 5 0 0 0 0
8 tuần 0,60 ± 0,05 225 ± 5 1,40 ± 0,12 220 ± 8 0,20 ± 0,03 7 ± 3
12 tuần 1,09 ± 0,03 1,68 ± 12 2,40 ± 0,05 50 ± 5 2,45 ± 0,03 47 ± 5

Ở giai đoạn đầu mẫu cấy thu được cho hệ số nhân thấp, các mẫu tăng
sinh chậm. Tuy nhiên, sau 6 tuần nuôi cấy đã có sự khác biệt rõ rệt cả về hệ
số nhân và hình thái. Hầu hết các phôi không bị hóa nâu sau 8 tuần nuôi
cấy như trong thí nghiệm 2 mà tốc độ tăng sinh tỷ lệ thuận với thời gian
nuôi cấy. Các mẫu cấy chỉ bị chết đi khi môi trường dinh dưỡng sử dụng
hết. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, các phôi hầu như đều chuyển thành
dạng PLB, rất ít còn ở trạng thái phôi như ban đầu.

https://bienphap.net/

41

Hình 4: Ảnh hưởng của nước dừa già tới sự phát triển của phôi, PLB và cây con.
(a), (b), (c): sự phát triển của phôi sau các khoảng thời gian 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30%
nước dừa già, pH = 5,8. (c1), (c2): sự phát triển của phôi, PLB trên môi trường Hw (môi trường
Vacin-Went + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước
dừa già, pH = 5,3) sau 12 tuần nuôi cấy. (c3): sự phát triển của cây con trên môi trường RC3 (môi
trường Vacin-Went + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC +
30% nước dừa già, pH = 5,3)
https://bienphap.net/

42
Sau 8 tuần nuôi cấy trọng lượng tươi của phôi thu được gấp 7,5 lần so
với mẫu cấy ban đầu, đồng thời phát sinh các PLB (trọng lượng tươi 1,4
g/mẫu) và các cụm chồi non (7 chồi/mẫu) (Hình 4.b). Sau 12 tuần nuôi cấy
sinh khối thu được đã tăng lên rất rõ rệt. Các mẫu cấy phát triển gần như
kín bề mặt môi trường. Trong giai đoạn này, hầu hết các phôi đã phát triển
hoàn toàn thành dạng PLB có đường kính lớn và xuất hiện nhiều dạng chồi
nhỏ (Hình 4.c).
Sau 12 tuần, một số bình mẫu được tách và cấy chuyền trên môi
trường Hw (môi trường Vacin-Went có bổ sung 30 g/l đường sucrose; 8 g/l
agar; 1 g/l than hoạt tính; 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH
= 5,3) đối với phôi và PLB; cấy trên môi trường RC3 (môi trường Vacin-
Went có bổ sung 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 0,5 mg/l
BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH = 5,3) đối với các cụm chồi. Sau
đó theo dõi thì thấy rằng: các phôi khi được cấy chuyền qua môi trường Hw
sẽ nhân lên với hệ số rất cao (gấp 80 lần sau 16 tuần nuôi cấy) đồng thời
vẫn giữ được ở trạng thái phôi màu vàng sau 16 tuần, phôi có đường kính
lớn và xốp (Hình 4.c1), một số ít phát triển thành dạng PLB tròn (Hình
1.d2). Các PLB phát triển rất đồng đều nhau với đường kính PLB lớn hơn
hẳn so với các dạng PLB thu được ở thí nghiệm 1 và 2. Các PLB phát triển
thành cụm chồi với hệ số nhân cao (Hình 4.c2). Các cụm chồi sau khi được
cấy trên môi trường RC3 cho sự hình thành rễ cũng phát triển rất đồng đều
nhau. Sau 16 tuần nuôi cấy trung bình mỗi cây con đã phát triển với số
lượng lá là 3 và số lượng rễ là 4. Chiều dài rễ và lá cân đối nhau. Tuy
nhiên, các lá có dạng thon, dài hơn so với các cây con nuôi cấy trên môi
trường ra rễ ở thí nghiệm 1 và 2 (Hình 4.c3).
Từ đó chúng tôi kết luận rằng nếu sử dụng môi trường có bổ sung 30%
nước dừa già thì các phôi sẽ trực tiếp phát triển thành dạng PLB sau đó
phát triển thành chồi non và các cây con. Ở môi trường này cho hệ số nhân
PLB cao đồng thời các PLB phát triển đồng đều có đường kính lớn. Mặt
khác, nước dừa non thường có giá thành cao gấp 7 – 8 lần so với giá thành
của nước dừa già, vì vậy mặc dù tăng nồng độ nước dừa già lên 30% nhưng https://bienphap.net/

43
giá thành khi sử dụng nước dừa già vẫn thấp hơn nhiều so với khi sử dụng
nguồn nước dừa non. Do đó nếu sử dụng nguồn nước dừa già cho nhân
giống cây con thì có thể rút ngắn thời gian nhân giống do thời gian chuyển
từ phôi sang dạng PLB ngắn, đồng thời cho hệ số nhân cao, chất lượng tốt
và đồng nhất, giảm giá thành cây con giống.
Từ thí nghiệm 2 và 3 chúng tôi rút ra kết luận rằng: Tùy thuộc vào
mục đích nuôi cấy mà chúng ta nên sử dụng nguồn nước dừa phù hợp. Nếu
sử dụng cho mục đích nhân nhanh và giữ phôi thì nên sử dụng nguồn nước
dừa non. Còn nếu sử dụng cho mục đích nhân nhanh tạo cây con giống thì
nên sử dụng nguồn nước dừa già.
3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc gạo kết hợp với nƣớc
dừa ở các nồng độ khác nhau
Trong thí nghiệm này, nguồn nước dừa già được lấy từ những trái dừa
có cơm dày 0,5 – 1cm; nguồn nước dừa non được lấy từ những trái có cơm
mới hình thành độ dày khoảng 0,1 – 0,2cm. Hai loại nước dừa này được kết
hợp bổ sung với nước gạo ở các nồng độ khác nhau.
Sau 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần nuôi cấy tiến hành cân trọng lượng tươi
của mẫu. Kết quả thu được ở bảng 3.4.1 và hình 5.
Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng của nước gạo và nước dừa ở các nồng độ kết hợp
khác nhau.
NT 4 tuần 8 tuần 12 tuần
DG2 1,64 ± 0,14 2,00 ± 0,15 2,21 ± 0,40
DG3 1,81 ± 0,25 2,16 ± 0,12 2,46 ± 0,38
G12 2,14 ± 0,21 2,45 ± 0,20 2,88 ± 0,10
G15 2,00 ± 0,53 2,81 ± 0,14 3,64 ± 0,12
NG2 1,09 ± 0,01 1,24 ± 0,02 1,88 ± 0,09
NG3 2,15 ± 0,08 2,53 ± 0,10 2,47 ± 0,06
NG35 2,58 ± 0,14 3,01 ± 0,12 3,16 ± 0,12 https://bienphap.net/

44
N11 0,87 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,48 ± 0,04
N12 0,82 ± 0,04 0,84 ± 0,02 1,41 ± 0,05
G11 0,93 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,53 ± 0,11
G21 0,85 ± 0,01 1,05 ± 0,01 1,05 ± 0,01
L0 1,65 ± 0,02 1,92 ± 0,04 1,55 ± 0,02
Sự kết hợp của nườc dừa non với nước gạo cho thấy không có sự gia
tăng đáng kể. Hệ số nhân thu được thấp hơn môi trường đối chứng L0
(không bổ sung nước dừa). Thậm chí một số mẫu hóa nâu và chết đi sau 3
tuần nuôi cấy. Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy
trên môi trường nhân phôi có bổ sung 20% nước dừa non, kết quả là gây
cảm ứng làm hóa nâu mẫu và chết đi. Như vậy, nếu sử dụng nguồn nước
dừa non từ những trái có cơm dày khoảng 0,3 - 0,4cm (ở thí nghiệm 1 và
thí nghiệm 2) sẽ gây cảm ứng tăng sinh phôi, nhưng nếu sử dụng nguồn
nước dừa non lấy từ những trái có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm lại gây cảm
ứng ngược lại. Có thể nguồn nước dừa lấy từ những trái mới hình thành
cơm sẽ có hàm lượng cytokinin cao, thêm vào đó các mẫu cấy sử dụng cho
thí nghiệm này lấy từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (tức đã qua 1 - 2 lần cấy
chuyền nên có hàm lượng cytokinin nội sinh cao) dẫn tới gây chết mẫu.
Nước dừa già khi kết hợp bổ sung với nước gạo gây cảm ứng tăng sinh
rõ rệt. Ở giai đoạn đầu, nghiệm thức NG35 cho hệ số nhân cao nhất, sau đó
tới nghiệm thức NG3. Tuy nhiên, ở 2 nghiệm thức này các phôi hoàn toàn
phát triển thành dạng PLB. Hình thái PLB được quan sát rõ sau 12 tuần
nuôi cấy. PLB đã xuất hiện nhiều lông hút, có đường kính lớn, màu xanh
đậm và đồng đều nhau (Hình 5).

https://bienphap.net/

45

Ở nghiệm thức G12 và G15 gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số nhân
cao nhất. Các phôi phát triển đồng đều, xốp, màu vàng xanh. Ở giai đoạn
đầu không có sự khác biệt nhiều cả về hình thái và trọng lượng tươi thu
được ở 2 nghiệm thức này (Hình 5a1). Sau 4 tuần trọng lượng tươi của mẫu
thu được ở nghiệm thức G12 (2,14g) cao hơn so với nghiệm thức G15
(2,00g). Nhưng qua tới tuần thứ 8 thì hệ số nhân ở nghiệm thức G15 (2,81g)
lại cao hơn nghiệm thức G12 (2,45g). Qua tuần thứ 12 thì tốc độ tăng sinh
của mẫu ở nghiệm thức G15 đã cao hơn rõ rệt so với nghiệm thức G12. Tuy
nhiên, qua tới tuần thứ 12, ở nghiệm thức G15 hầu hết các phôi đã chuyển
Hình 5: Ảnh hưởng của nước gạo kết hợp với nước dừa.
(a1), (a2), (a3): phôi thu được sau 4 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG 2, DG3, G12, G15), (NG2,
NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (b1), (b2), (b3): phôi thu được sau 8 tuần nuôi cấy tương ứng trên các
môi trường (DG2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (c1), (c2), (c3): phôi thu được
sau 12 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG 2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11,
G21, L0).
(d): phôi thu được sau 6 tuần trên các môi trường H0, H1, H2, H3, H15 (Theo thứ tự từ trái sang phải).

https://bienphap.net/

46
qua dạng chuyển tiếp có màu xanh, còn ở nghiệm thức G12 vẫn giữ được
trạng thái phôi ở dạng màu vàng xanh. Dó đó nghiệm thức G15 thích hợp
cho công tác nhân giống với hệ số nhân cao. Còn nghiệm thức G12 thích
hợp cho nhân phôi và giữ phôi.
Ở nghiệm thức DG3 mặc dù hệ số nhân không cao bằng bốn nghiệm
thức trên, nhưng cũng xuất hiện nhiều dạng PLB. Điều này hoàn toàn phù
hợp với kết quả thu được ở thí nghiệm 3. Ở nghiệm thức DG2 các phôi có
hệ số nhân không cao nhưng giữ được phôi ở dạng màu vàng.
Như vậy khi sử dụng nước dừa già (30%) và sử dụng nước gạo ở nồng
độ cao (30 - 35%) sẽ gây cảm ứng tạo PLB. Nhưng khi nước dừa già được
kết hợp bổ sung với nước gạo lại gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số
nhân cao. Trong nước dừa già có hàm lượng cytokinin thấp do chúng đã
được dùng để nuôi cơm dừa, vì thế khi sử dụng để nuôi cấy phôi lan thì các
phôi chuyển sang PLB. Điều này là hoàn toàn phù hợp vì nồng độ cytokinin
thấp không gây cảm ứng tạo và tăng sinh phôi. Thành phần chính trong
nước gạo là tinh bột và vitamin đặc biệt là vitamin B1. Từ đó, chúng tôi
đưa ra giả thiết rằng hàm lượng tinh bột và vitamin có ảnh hưởng tới khả
năng tăng sinh của phôi.
Nghiệm thức NG2 cũng giữ được phôi ở trạng thái màu vàng và cho hệ
số nhân không cao trong giai đoạn đầu. Trong một thí nghiệm riêng biệt
khác khi so sánh môi trường này (NG2) với các môi trường P0, P1, P2, P3,
P4, P5 (môi trường nhân nhanh phôi có bổ sung 20% nước dừa non lấy từ
những trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm, nồng độ đường tương ứng là 0, 10, 20,
30, 40, 50 (g/l) các thành phần khác không thay đổi). Thí nghiệm này được
đặt trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết quả chúng tôi thu được:
ở giai đoạn đầu không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức; hệ số nhân thu
được cũng không cao ở tất cả các nghiệm thức. Điều này hoàn toàn phù hợp
với các thí nghiệm ở trên, khi sử dụng nguồn nước dừa từ những trái mới
hình thành cơm. Đồng thời có thể nguồn ánh áng nhân tạo cũng có ảnh
hưởng tới sự tăng sinh của phôi. Về sau các nghiệm thức P0 , P1, P2, P3, P4, https://bienphap.net/

47
P5 đều gây cảm ứng hóa nâu mẫu do thời gian lâu. Trong các nghiệm thức
này ở nồng độ đường 30 g/l phù hợp nhất cho sự phát triển của phôi. Ở
nồng độ đường 0 g/l có sự hình thành PLB hình cầu. Điều này phù hợp với
kết quả của các nghiên cứu trước đó (Nhựt và My, 2008; Nhựt và Thanh,
2007).
Sau 21 tuần, kết quả chúng tôi thu được các phôi đã hóa nâu và chết ở
hầu hết các nghiệm thức. Chỉ có nghiệm thức P0 vẫn còn tồn tại một số PLB
hình cầu ở dạng màu xanh. Riêng ở nghiệm thức NG2 thì tốc độ nhân vẫn
tiếp tục tăng lên theo thời gian, tuy nhiên hệ số nhân không cao bằng các
nghiệm thức G12 và G15 như ở thí nghiệm trên. Chứng tỏ nếu bổ sung nước
gạo (20%) tuy hệ số nhân nhanh không cao nhưng lại cho khả năng giữ
phôi cao. Sau 24 tuần nuôi cấy mặc dù các phôi đã chuyển qua dạng chuyển
tiếp màu xanh, tuy nhiên không thấy có hiện tượng hóa nâu của mẫu và hệ
số nhân vẫn tiếp tục tăng lên. Điều này chứng tỏ nước gạo có khả năng hấp
thụ các hợp chất phenol rất tốt. Đồng thời có thể giúp phôi duy trì mức độ
tăng sinh tốt ngay cả khi trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết
quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 5.d.
Bảng 3.4.2 So sánh môi trường có bổ sung 20% nước gạo với các môi
trường có bổ sung 20% nước dừa non kết hợp với sự thay đổi của nồng độ
đường trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo sau 21 tuần nuôi cấy
STT NT 12 tuần 20 tuần
1 P0 1,67 ± 0,09 1,21 ± 0,14
2 P1 0,69 ± 0,01 0,48 ± 0,04
3 P2 0,73 ± 0,05 0,40 ± 0,05
4 P3 1,67 ± 0,07 0,80 ± 0,08
5 P4 0,86 ± 0,02 0,52 ± 0,03
6 P5 0,88 ± 0,04 0,56 ± 0,02
7 NG2 1,4 ± 0,15 3,65 ± 0,14
https://bienphap.net/

48
Để xác định rõ hơn nữa về ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ
phôi, chúng tôi tiến hành khảo sát tiếp tục trên 3 loại môi trường np2, np15
và np12. Kết quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 6a.
Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ phôi
np2 np15 np12
4 tuần 0,72 ± 0,07 0,80 ± 0,03 0,75 ± 0,05
8 tuần 1,02 ± 0,03 2,02 ± 0,09 1,75 ± 0,03
12 tuần 1,66 ± 0,06 3,81 ± 0,08 3,28 ± 0,22
20 tuần 3,25 ± 0,15 3,56 ± 0,11 3,28 ± 0,20 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
4 tuần8 tuần12 tuần20 tuần
Thời gian nuôi cấy
Trọng lƣợng tƣơi
np2
np15
np12

Biểu đồ 3.2 Tốc độ tăng sinh của phôi trên ba môi trường np2, np12, np15
qua các khoảng thời gian khác nhau
Sau 4 tuần nuôi cấy không thấy có sự khác biệt về sinh khối thu được
cũng như hình thái của phôi trên cả ba loại môi trường, các phôi đều có
màu vàng (Hình 6.a1). Sự khác biệt được quan sát rõ từ sau tuần thứ 8 trở
đi.

https://bienphap.net/

49

Hình 6: Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng tăng sinh của phôi.
(a1), (a2), (a3), (a4): sự phát triển của phôi trên các môi trường np2, np15, np12 (theo
thứ tự từ trái qua phải) sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần, 20 tuần nuôi cấy. (b1), (b2), (b3),
(b4): hình thái phôi thu được tương ứng trên các môi trường np12, np3, NG2, np.

https://bienphap.net/

50
Ở tuần thứ 8, môi trường np2 cho hệ số nhân thấp hơn hẳn so với hai
môi trường còn lại. Hệ số nhân của môi trường np15 cao hơn so với môi
trường np12, tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều giữa hai môi trường
này (Hình 6.a2).
Tới tuần thứ 12 thì đã có sự khác biệt rõ ràng giữa ba loại môi trường
cả về hình thái và trọng lượng tươi thu được. Trọng lượng tươi đạt cao nhất
là ở môi trường np15, tuy nhiên các phôi có hình thái màu xanh và dạng
chuyển tiếp. Trên môi trường np12 mặc dù hệ số nhân thấp hơn môi trường
np15 nhưng vẫn giữ được phôi ở dạng vàng xanh. Môi trường np2 vẫn cho
hệ số nhân thấp nhất và các phôi đã chuyển sang màu xanh.
Qua tới tuần thứ 20, trọng lượng tươi của hai môi trường np12 và np15
giảm dần do có hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả hai môi trường. Tại thời
điểm này, mặc dù trọng lượng tươi thu được ở môi trường np15 vẫn cao hơn
ở môi trường np12, nhưng mức độ giảm trọng lượng tươi ở môi trường np15
cao hơn nhiều so với môi trường np12 do ở môi trường np15 hiện tượng hóa
nâu mẫu nhiều hơn. Trong khi đó, trên môi trường np2 chúng tôi nhận thấy
có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng tươi thu được, sinh khối vẫn tiếp tục
tăng theo thời gian nuôi cấy, đồng thời không có hiện tượng hóa nâu của
mẫu, tuy nhiên các phôi đã chuyển sang màu xanh. Điều này chứng tỏ nước
gạo có khả năng hấp thu tốt các hợp chất có bản chất phenol, giúp mẫu
được duy trì lâu hơn.
Như vậy môi trường np15 cho hệ số nhân phôi cao nhất nhưng thời gian
giữ được phôi lại thấp hơn so với môi trường np12 và môi trường np2. Do
đó qua tuần thứ 12 nên tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Môi
trường này thích hợp cho việc nhân giống. Môi trường np12 vừa có khả
năng giữ phôi ở trạng thái màu vàng xanh, vừa cho hệ số nhân cao không
kém nhiều so với môi trường np15, do đó thích hợp việc giữ phôi và nhân
nhanh phôi làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm và các mục đích
khác như: tạo hạt nhân tạo, nuôi cấy tế bào đơn, dung hợp tế bào trần,
chuyển gen… Còn môi trường np2 tuy giai đoạn đầu cho hệ số nhân nhanh https://bienphap.net/

51
thấp, tuy nhiên về sau hệ số nhân tăng lên rõ rệt theo thời gian nuôi cấy,
đồng thời không gây hiện tượng hóa nâu mẫu do đó giữ mẫu được lâu,
không phải cấy chuyền nhiều lần. Vì vậy môi trường này phù hợp cho việc
giữ mẫu làm nguồn nguyên liệu khi cần thiết.
3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của proline tới khả năng tăng
sinh của phôi
Proline đã được chứng minh là gây cảm ứng phát sinh phôi ở nhiều
loài. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo nào về cảm ứng của proline tới khả
năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Vì vậy thí nghiệm này nhằm xác định ảnh
hưởng của proline tới cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Kết quả thu
được ở bảng 3.5 và hình 3.d.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của proline tới khả năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp
TLT (g)
Ban đầu 4 tuần 6 tuần
ĐC
0,08 ± 0,01
0,48 ± 0,12 0,82 ± 0,04
H0,25 0,26 ± 0,08 0,16 ± 0,03
H0,5 0,16 ± 0,07 0,15 ± 0,01
H0,75 0,04 ± 0,02 0,01 ± 0,01
SL
ĐC
125 ± 5
370 ± 7 720 ± 10
H,25 250 ± 5 160 ± 5
H0,5 170 ± 5 130 ± 4
H0,75 70 ± 5 5 ± 3

Trọng lượng tươi thu được sau 4 tuần trên môi trường có bổ sung
proline ở các nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 g/l và 0,75 g/l đều thấp hơn so với đối
chứng. Không có sự tăng sinh đáng kể về sinh khối thu được, đồng thời có
hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả ba môi trường. Trong đó, ở nồng độ
proline càng cao thì càng gây cảm ứng hóa nâu mẫu. Qua tuần thứ 6 trên https://bienphap.net/

52
môi trường có bổ sung proline, các mẫu bị chết rất nhiều. Chứng tỏ proline
không phù hợp cho cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp.
Trong thí nghiệm này, ở môi trường đối chứng thu được cũng không
cho hệ số nhân cao như ở thí nghiệm 2. Nguyên nhân là do nguồn nước dừa
sử dụng cho thí nghiệm này lấy từ những trái còn quá non có cơm dày
khoảng 0,1 - 0,2cm. Đồng thời mẫu cấy lấy từ các thí nghiệm trên (tức đã
qua 2 - 3 lần cấy chuyền). Điều này lại một lần nữa khẳng định nguồn nước
dừa lấy từ những trái còn quá non để nuôi cấy các mẫu cấy đã qua một số
lần cấy chuyền là không phù hợp do hàm lượng cytokinin nội sinh và hàm
lượng cytokinin trong môi trường cao.
3.6. Thí nghiệm 6: So sánh ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi
trƣờng ½MS tới khả năng tăng sinh của phôi
Nguồn mẫu phôi qua 2 - 3 lần cấy chuyền liên tiếp trên môi trường
nhân phôi có bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA sẽ có hàm lượng
cytokinin nội sinh cao. Do dó nếu tiếp tục cấy chuyền phôi trên môi trường
cũ, đồng thời nguồn nước dừa sử dụng trong trường hợp này lấy từ những
trái còn rất non mới hình thành cơm chứa hàm lượng cytokinin cao sẽ dẫn
tới khả năng tăng sinh của mẫu giảm đồng thời có hiện tượng hóa nâu.
Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy các phôi đã trải qua 2 - 3 lần cấy
chuyền trên môi trường có hàm lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng
và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng giảm đi một nửa, đồng thời kết hợp
với việc thay thế nước dừa non bằng nước dừa già và nước gạo. Kết quả
chúng tôi thu được ở bảng 3.6 và hình 5.d.

https://bienphap.net/

53
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường MS và ½MS tới khả năng tăng
sinh của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền
H0 H1 H2 H3 H15
4 tuần 0,29 ± 0,05 0,41 ± 0,05 0,70 ± 0,03 0,59 ± 0,15 0,51 ± 0,04
6 tuần 0,60 ± 0,03 0,75 ± 0,04 0,84 ± 0,01 1,20 ± 0,05 0,95 ± 0,12
8 tuần 0,70 ± 0,05 0,95 ± 0,02 1,20 ± 0,03 1,82 ± 0,06 1,60 ± 0,83
0
0.5
1
1.5
2
H0H1H2H3H15
Nghiệm thức
Trọng lƣợng tƣơi
4 tuần
6 tuần
8 tuần

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường ½MS tới khả
năng tăng sinh khối của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền
Trọng lượng tươi thu được ở nghiệm thức H1 (môi trường MS có bổ
sung 20% nước dừa non) không khác biệt nhiều so với nghiệm thức H0
(môi trường MS không bổ sung nước dừa), đồng thời hệ số nhân thu được ở
nghiệm thức H1 thấp hơn so với môi trường tương tự được sử dụng trong
thí nghiệm 1 và 2.
Trong khi đó ở các môi trường còn lại có sự giảm đi một nửa về hàm
lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng (môi
trường ½MS), đồng thời sử dụng kết hợp nước dừa già và nước gạo thay
cho nước dừa non lại thu được trọng lượng tươi cao hơn nhiều. Trong đó,
trọng lượng tươi thu được cao nhất là nghiệm thức H3. https://bienphap.net/

54
Tuy nhiên, nếu so sánh với trọng lượng tươi thu được ở thí nghiệm 2
thì ở thí nghiệm này trọng lượng tươi của mẫu thu được ở tất cả nghiệm
thức đều thấp hơn. Điều này chứng tỏ số lần cấy chuyền mẫu cũng có ảnh
hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi.
3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng phát triển của cây con có nguồn gốc
từ phôi vô tính
Các cây con được nuôi cấy trên môi trường VW cho sự phát triển
hoàn thiện sau 12 tuần nuôi cấy sẽ được chuyển ra ngoài vườm ươm. Tổng
số lượng cây con chúng tôi thu được là 500 cây (Hình 7.d)
Trong quá trình nuôi cấy phôi, một số mẫu phôi phát triển trực tiếp
thành chồi sau đó hình thành rễ và phát triển thành cây con hoàn chỉnh.
Tuy nhiên, các cây con hình thành trên môi trường này có số lượng rễ,
chiều dài rễ thấp hơn so với các cây con thu được khi đã được cấy chuyền
qua môi trường VW, đồng thời các cây con hình thành trong quá trình nuôi
cấy phôi có lá dạng thon dài và đường kính bé hơn so với các cây con có
nguồn gốc từ phôi nhưng được cấy chuyền sang môi trường VW. Thí
nghiệm này nhằm khảo sát về số lượng lá, số lượng rễ, chiều dài lá, chiều
dài rễ và trọng lượng tươi của cây con. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và
hình 7.

https://bienphap.net/

55
Bảng 3.7 Kích thước các cây thu được trước khi chuyển ra vườm ươm
Cây con thu được
sau 12 tuần trên
môi trường VW
Cây con thu được
trong quá trình
nuôi cấy phôi
Chiều dài lá (cm) 4,87 ± 1,15 4,06 ± 1,44
Số lượng lá (lá/cây) 3,80 ± 0,50 3,40 ± 0,75
Chiều dài rễ (cm) 4,18 ± 1,25 2,20 ± 0,85
Số lượng rễ (rễ/cây) 5,80 ± 1,00 3,60 ± 0,70
Trọng lượng tươi của
cây (g/cây)
4,39 ± 1,79 2,83 ± 0,18
Đặc điểm hình thái
Cây to khỏe có sức
sống cao; lá màu xanh
đậm, hình e lip hoặc
thon dài; hình thành
nhiều rễ, rễ dài (Hình
7.b3).
Cây mảnh hơn; lá thon
dài, mọng nước, đường
kính lá nhỏ hơn; số
lượng rễ hình thành ít,
rễ ngắn (Hình 7.c3). https://bienphap.net/

56

Hình 7: Khảo sát chất lượng cây con thu được.
(a1), (a2), (a3): sinh khối thu được từ phôi trên môi trường np ở lần cấy chuyền thứ 2 sau
21 tuần nuôi cấy. Trong đó (a1): phôi đang trong giai đoạn chuyển sang PLB; (a2): PLB;
(a3): cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi. (b1), (b2), (b3): cây con sinh
trưởng trên môi trường VW. (c1): cây con được cấy chuyền qua môi trường VW sau 6
tuần. (c2): cây con sinh trưởng trên môi trường RC3. (c3): cây con thu được trong quá
trình nuôi cấy phôi. (d): cây con có nguồn gốc phôi vô tính trước khi đem ra vườm ươm.

https://bienphap.net/

57
Mặc dù những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi (Hình
7.c3) có bộ lá phát triển, tuy nhiên lá mọng nước và thường có hình thon
dài, đường kính lá và số lượng rễ hình thành thấp hơn so với các cây con đã
được cấy chuyền qua môi trường VW (Hình 7.b3). Do đó sức sống của
những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi sẽ kém hơn so với
các cây con có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền qua môi trường
VW khi chuyển ra ngoài vườm ươm.
3.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên
khả năng sinh trƣởng của con trong điều kiện in vitro
Sau 2 tuần cấy chuyền trên môi trường VW các cây con P.amabilis cảm
ứng với môi trường nuôi cấy và bén rễ. Sang tuần thứ tư chúng kéo dài lá
và rễ, gia tăng đường kính lá, các cây con ở tất cả các nghiệm thức đều rất
khỏe, có bộ lá xanh tốt, bộ rễ khỏe. Tuy nhiên sự gia tăng kích thước ở các
nghiệm thức có sự khác nhau. Sau 12 tuần nuôi cấy tiến hành thu kết quả
trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh
trưởng của cây con trong điều kiện in vitro
NT
Số lá
(lá/cây)
Số rễ
(rễ/cây)
Chiều dài
lá (cm)
Chiều dài
rễ (cm)
TLT
(g/cây)
Đặc điểm
R1 4,00 ± 0,75 7,80 ± 1,25
4,88 ±
1,53
5,29 ±
2,05
5,27 ±
0,90
Cây rất mập,
lá xanh đậm,
phiến lá dày,
nhiều sắc tố
tím ở mặt
dưới, cây và
rễ khỏe.
R2 3,50 ± 0,25 6,00 ± 0,50
3,81 ±
1,15
4,25 ±
1,73
3,13 ±
0,98
Cây khỏe,
mập, mặt
dƣới lá có
nhiều sắc tố https://bienphap.net/

58
tím.
R3 3,14 ± 0,15 4,60 ± 1,00
2,08 ±
0,60
4,06 ±
1,20
2,12 ±
0,70
Cây chắc, rễ
hơi khô,
nhiều sắc tố
tím.

Từ kết quả thí nghiệm cho thấy ở cùng thể tích bình nuôi cấy (bình
thủy tinh 500ml) và ở cùng thể tích môi trường (80ml) thì mật độ càng thấp
khả năng sinh trưởng của cây con càng cao, khả năng sinh trưởng của cây
con giảm dần khi mật độ cây tăng lên. Khả năng sinh trưởng của cây tỷ lệ
nghịch với mật độ nuôi cấy.
Ở nghiệm thức R1 các chỉ tiêu sinh trưởng đều đạt cao nhất khi so
sánh với các nghiệm thức còn lại. Ở mật độ này các cây con sinh trưởng rất
mạnh, cây to khỏe, mập, phiến lá dày có nhiều sắc tố tím ở mặt dưới của lá,
rễ khỏe, lá dài và bóng mượt, phiến lá bóng. Sở dĩ các cây con thu được ở
nghiệm thức này sinh trưởng và phát triển đạt cao nhất là do cây con trong
nghiệm thức này được cung cấp đủ chất dinh dưỡng, khoảng không gian,
cây có điều kiện tiếp nhận nguồn ánh sáng chiếu đến lá nhiều nhất, vì vậy
khả năng quang hợp của cây tốt hơn, không xảy ra hiện tượng cạnh tranh về
mặt dinh dưỡng cũng như không có hiện tượng các cây che bóng lẫn nhau
dẫn đến thiếu nhu cầu ánh sáng cho quang hợp, không có hiện tượng cạnh
tranh về không gian khiến các cây phải mọc chen chúc.
Khi tăng mật độ nuôi cấy lên 3 cây trong 1 bình kết quả cho thấy các
chỉ tiêu thu được có sự giảm dần. Tuy nhiên, sự chênh lệch không đáng kể.
Các cây thu được vẫn to khỏe, mập, lá xanh bóng, dày, rễ khỏe. Sự chênh
lệch không nhiều về các chỉ tiêu giữa hai nghiệm thức R1 và R2 cho thấy
mặc dù mật độ nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tuy nhiên
trong một giới hạn nhất định nào đó, sự thay đổi mật độ nuôi cấy vẫn chưa
ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng của cây con, vì vậy kích thước https://bienphap.net/

59
của các cây con thu được ở 2 nghiệm thức R1 và R2 chưa có sự khác nhau
nhiều.
Ở nghiệm thức R3 các chỉ tiêu thu được thấp nhất. Cây vẫn chắc,
nhưng rễ hơi héo, có nhiều sắc tố màu tím ở mép lá và mặt dưới lá. Ở
nghiệm thức này cây con sinh trưởng kém nhất, do mật độ cây cao nên xảy
ra hiện tượng cạnh tranh về dinh dưỡng, ánh sáng, khoảng không gian trong
bình nuôi cấy, các cây mọc chen chúc nên có sự ức chế sinh trưởng lẫn
nhau, thường thì các cây ở gần thành bình phát triển mạnh hơn do chúng
nhận được nhiều ánh sáng chiếu tới hơn, còn các cây phía trong bị che
bóng nhiều nên sinh trưởng kém hơn, dẫn đến kích thước cây không đồng
đều.
Như vậy, ở mật độ cấy chuyền quá cao hoặc quá thấp đều không mang
lại hiêu quả kinh tế. Ở nghiệm thức R1 cho cây con thu được tốt nhất ở tất
cả các chỉ tiêu, nhưng lại tốn kém chi phí về nhân công cấy chuyền, chi phí
bình, môi trường nuôi cấy và diện tích phòng, dàn nuôi cây. Còn ở nghiệm
thức R3 mặc dù tiết kiệm được về mặt chi phí nhân công, môi trường nuôi
cấy, diện tích… nhưng cây con sinh trưởng kém và không đồng đều nhau.
Trong khi đó, ở nghiệm thức R2 vừa đảm bảo cho chất lượng cây con thu
được sinh trưởng tốt không sai lệch nhiều so với ở nghiệm thức R1 mà lại
tiết kiệm được về mặt chi phí sản xuất, mang lại hiệu quả kinh tế. Từ đó,
chúng tôi kết luận rằng mật độ cấy chuyền tốt nhất là 3 cây cho một bình
nuôi cấy có thể tích 500ml.
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.2. Kết luận
Từ những kết quả thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi có một số kết luận
như sau:
Nguồn mẫu ban đầu có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng sinh và
hình thái của phôi. Nguồn mẫu phôi ban đầu tốt nhất dùng cho nhân giống https://bienphap.net/

60
và giữ phôi là các phôi có dạng màu vàng và xốp , dính liền thành từng
khối.
Thời gian cấy chuyền phôi có ảnh hưởng khá rõ rệt tới khả năng tăng
sinh cũng như hình thái của phôi. Đối với các phôi màu vàng, xốp thì thời
gian cấy chuyền tốt nhất là sau khoảng 6 tuần nuôi cấy. Khi phôi được cấy
chuyền ở khoảng thời gian này cho hệ số nhân cao (gấp 66,25 lần mẫu cấy
ban đầu chỉ sau 21 tuần nuôi cấy) và giữ cho mẫu không bị hóa nâu.
Môi trường tối ưu nhất cho nhân nhanh phôi là: môi trường MS có bổ
sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than hoạt
tính + 20% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,3 – 0,4cm).
Môi trường nhân và giữ phôi ở dạng vàng, xốp là: môi trường MS có
bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than
hoạt tính + 10% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,5 – 1cm) + 20%
nước gạo.
Trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l
đường sucrose + 1 g/l than hoạt tính + 20% nước gạo, mặc dù phôi phát
triển chậm nhưng lại giữ được mẫu lâu, không phải cấy chuyền.
Các phôi được cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA +
30% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,5 – 1cm) + 1 g/l than hoạt tính + 30
g/l succrose + 8 g/l agar, pH = 5,8. Sau 12 tuần thì tiến hành cấy chuyền sang môi
trường mới. Các phôi được cấy chuyền qua môi trường Hw, còn PLB và chồi được
cấy sang môi trường RC3. Đây là quy trình nhân giống cây con có nguồn gốc từ
phôi vô tính tối ưu nhất mà chúng tôi thu được ở đề tài này.
Nguồn nước dừa non lấy từ những trái mới hình thành cơm (dày khoảng 0,1 –
0,2cm) không phù hợp cho những mẫu cấy đã qua nhiều lần cấy chuyền. Điều này
có thể được giải thích là do hàm lượng cytokinin nội sinh trong mẫu cấy và trong
nước dừa quá cao.
Khi bổ sung proline vào môi trường nuôi cấy xảy ra hiện tượng hóa nâu mẫu
do đó việc bổ sung proline không phù hợp cho sự tăng sinh phôi Hồ điệp. https://bienphap.net/

61
Số lần cấy chuyền cũng có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. Các
phôi càng qua nhiều lần cấy chuyền thì hệ số nhân sẽ càng giảm vì các mẫu đã qua
nhiều lần cấy chuyền có hàm lượng cytokinin nội sinh cao, do đó nếu tiếp tục cấy
chuyền, thì nên sử dụng môi trường ½MS, đồng thời giảm nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng.
Các cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi mặc dù đã phát triển
hoàn thiện về các chỉ tiêu sinh trưởng, tuy nhiên các chỉ tiêu thu được vẫn thấp hơn
so với các cây có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền sang môi trường VW. Do
đó các cụm chồi và cây con được hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi nên được
cấy chuyền qua môi trường VW cho sự phát triển hoàn thiện của cây con trước khi
đem ra vườm ươm.
Mật độ cấy chuyền có ảnh hưởng tới sự phát triển của cây con. Ở mật độ cây
quá cao hoặc quá thấp đều không mang lại hiệu quả kinh tế. Mật độ cấy chuyền
thích hợp nhất là 3 cây cho 1 bình có thể tích 500ml (thể tích môi trường là 80ml
cho mỗi bình).
4.2. Đề nghị
Từ kết quả thu được chúng tôi xin đưa ra các đề nghị sau:
- Cần khảo sát rõ hơn nữa về sự phát triển của các dạng phôi khác nhau.
- Khảo sát ảnh hưởng của các hàm lượng nước dừa già khác nhau tới quá
trình tăng sinh của phôi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn ánh sáng nhân tạo tới khả năng tăng
sinh của phôi.
- Khảo sát hàm lượng đường thích hợp khi trong môi trường có bổ sung
nước dừa già, nước gạo và kết hợp giữa nước dừa già với nước gạo.
- Xác định được thành phần nào có trong nước gạo gây cảm ứng tăng sinh
và giữ được phôi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng vitamin, tinh bột lên khả năng
tăng sinh của phôi. https://bienphap.net/

62
- Khi tiến hành lấy nước gạo , do chúng tôi tiến hành lấy theo phương
pháp thủ công nên hàm lượng các chất có trong nước gạo ở mỗi thí
nghiệm sẽ có sự sai lệch. Vì vậy cần có phương pháp thu nguồn nước
gạo để đảm bảo sự đồng nhất về hàm lượng và nồ ng độ các chất có trong
nước gạo dùng cho các thí nghiệm . Mặt khác, trong gạo vẫn còn chứa
một dư lượng nhỏ độc tố của thuốc trừ sâu , trừ cỏ còn sót lại. Minh
chứng là gạo xuất khẩu của Việt Nam khi nhập khẩu trong mộ t số trường
hợp vẫn chưa đạt tiêu chuẩn . Nguồn mẫu phôi dùng cho nuôi cấy in
vitro lại nhạy cảm khá cao với những độc tố này . Do đó kết quả thu
được cũng một phần có sự sai lệch. Vì vậy cần tiến hành xác định chính
xác thành phần và nồng độ các chất có trong nước gạo , từ đó tìm cách
loại trừ lượng độc tố còn trong nước gạo.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết bổ sung khác như: dịch chiết
khoai tây, cà chua, chuối, nhựa cây bulô, dịch chiết nấm men, malt…
- Khảo sát ảnh hưởng của việc cấy chuyền nhiều lần tới sự phát triển của
phôi và cây con được hình thành.
- Khảo sát rõ hơn nữa ảnh hưởng của môi trường ½MS khi không só sự
giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng để so sánh với môi trường
MS.
- Khảo sát khả năng tăng sinh của phôi trên môi trường ½MS có bổ sung
nước dừa già và nước gạo.
- Khảo sát thể tích của môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng sinh của
phôi.
- Sử dụng các chất làm đặc môi trường khác (gelrite) để nghiên cứu ảnh
hưởng của chúng tới khả năng tăng sinh của phôi.
- Khảo sát ảnh hưởng của nước gạo riêng rẽ và nước gạo kết hợp với nước
dừa tới sự phát triển của cây con in vitro.
- Xác định số cây con được hình thành từ một cụm mẫu cấy ban đầu, so
sánh với khả năng phát sinh cây con từ PLB. https://bienphap.net/

63
- Khảo sát khả năng sống sót và phát triển của các cây được hình thành
trong quá trình nuôi cấy phôi so sánh với các cây có cùng nguồn gốc
nhưng được cấy chuyền qua môi trường VW ngoài vườm ươm.
- Khảo sát khả năng sống sót và phát triển của các cây con ở các nghiệm
thức R1, R2, R3 ngoài vườm ươm.
- Xác định tỷ lệ sống sót và sự phát triển của cây con có nguồn gốc phôi
vô tính ngoài vườm ươm để so sánh với các cây con có nguồn gốc khác.
- Khảo sát các loại giá thể phù hợp cho sự phát triển của cây lan Hồ điệp
có nguồn gốc từ phôi vô tính.
- So sánh chất lượng của hoa thu được từ những cây có nguồn gốc phôi vô
tính so với hoa của những cây có nguồn gốc khác.
PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu tiếng việt
1. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại cương. NXB. ĐHQG TP.HCM.
2. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện (2007). Bước
đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ
điệp lai Phalaenopsis Hybrid. Dương Tấn Nhựt (chủ biên). Hội nghị khoa học:
công nghệ sinh học thực vật trong công tác tạo giống hoa. NXB. Nông Nghiệp
TP.HCM.
3. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật. NXB. ĐHQG TP.HCM.
4. Dương Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật, tập 2. NXB. ĐHQG TP.HCM.
5. Dương Công Kiên (2006). Nuôi cấy mô, tập 3. Kỹ thuật nhân giống – lai tạo
trồng một số giống lan (Orchid) thông dụng và có giá trị kinh tế ở Việt Nam.
NXB. ĐHQG TP.HCM.
6. Dương Phương Thanh (2007). Ảnh hưởng của một số loại đường khác nhau lên
sự phát sinh phôi và tăng sinh PLB lan Hồ điệp. Khóa luận tốt nghiệp cử nhân
khoa học đại học. Trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM.
7. Dương Tấn Nhựt (2006). Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào. NXB. Nông
Nghiệp TP.HCM.
8. Dương Tấn Nhựt (2007). Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB. Nông Nghiệp
TP.HCM.
9. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Đức Huy, Lương Ngọc Thuận
(2007). Sự phát sinh phôi của các tế bào sinh dưỡng thực vật. Tạp chí công
nghệ sinh học. 5(2): 133-149. https://bienphap.net/

64
10. Hoàng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Kim Thanh (2004). Giáo trình sinh
lí thực vật. NXB. ĐH Sư Phạm.
11. Hoàng Thị Sản (1999). Phân loại học thực vật. NXB. Giáo Dục.
12. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga (2006). Hình thái giải phẫu học thực vật.
NXB. ĐH Sư Phạm.
13. Lý Thị Phương Loan (2006). Ảnh hưởng của một số nguồn chiếu sáng nhân tạo
lên sự phát sinh hình thái của phôi, tái sinh cây con lan Hồ điệp (Phalaenopsis
amabilis) và ứng dụng của nó trong nhân giống vô tính. Khóa luận cử nhân
sinh học. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.
14. Nguyễn Cửu Thành Nhân (2006). Tối ưu hóa môi trường phát sinh phôi,
protocorm-like body (PLB) và ứng dụng công nghệ bioreactor để nhân nhanh
phôi, PLB phục vụ công tác nhân giống cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.).
Đồ án tốt nghiệp đại học. Trường đại học Đà Nẵng.
15. Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thành Hải, Dương Tấn Nhựt (2006). Nhân
nhanh phôi và protocorm-like body cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis. amabilis)
bằng hệ thống bioreactor. Dương Tấn Nhựt (chủ biên). Hội nghị khoa học:
công nghệ sinh học thực vật trong công tác chọn tạo giống hoa. NXB. Nông
Nghiệp TP.HCM, trang:17-27.
16. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006). Công nghệ tế bào. NXB. ĐHQG
TP.HCM.
17. Nguyễn Phúc Huy (2007). Hệ thống nuôi cấy film (túi nylon) trong nhân giống
nhanh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.). Luận văn tốt nghiệp đại học.
Trường Đại học Đà Lạt.
18. Nguyễn Thị Kim Tuyền (2005). Bước đầu nghiên cứu khả năng tạo hạt nhân tạo
cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) phục vụ công tác nhân giống và bảo quản.
Luận văn tốt nghiệp cử nhân khoa học đại học. Trường Đại học Mở Bán Công
TP.HCM.
19. Nguyễn Thị Thu Sương (2008). Khả năng phát sinh phôi vô tính của dâu tây
(Fragaria sp.). Luận văn thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Đà Lạt.
20. Trần Lê Lưu Ly, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh, Nguyên Vũ, Bùi Văn Lê
(2007). Thử nghiệm chuyển gen trên lan Hồ điệp (Phalaenopsis. amabilis)
bằng phương pháp bắn gen và Agrobacterium tumefaciens. Dương Tấn Nhựt
(chủ biên). Hội nghị khoa học: công nghệ sinh học thực vật trong công tác
chọn tạo giống hoa. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM, trang: 189-194.
21. Trịnh Thị Lan Anh (2007). Nghiên cứu khả năng hình thành protocorm-like
body (PLB), phôi vô tính và bước đầu nghiên cứu khả năng hình thành tế bào
đơn cây lan hồ điệp (Phalaenopsis.sp) phục vụ công tác nhân giống. Luận văn
thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Đà Lạt.
22. Vũ Văn Vụ (1999). Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo Dục.
2. Tài liệu tiếng anh https://bienphap.net/

65
1. Aleith F., Richter G. (1990). Gene expression during induction of somatic
embryogenesis in carror cell suspension. Plant. 83: 17-24.
2. Ammirato P.V. (1983). Handbook of Pant Cell Culture, Vol. I. MacMillan, New
York, pp. 82-123.
3. Ammirato P.V. (1983). The regulation of somatic embryo development in plant
cell culture: Suspension culture techniques and hormone requirements. Bio-
Technology. 1: 68-74.
4. Arditti J., Ernst R. (1993). Micropropagation of orchids. Jonh Wiley & Sons,
New York, USA.
5. Chen J.T., Chang W.C. (2004). Induction of repetitive embryogenesis from seed-
derived protocorms of Phalaenopsis amabilis var. Formosa shimadzu. In vitro
Cell. & Dev. Biol. Plant. 40: 290-293.
6. Chen J.T., Chang W.C. (2006). Direct somatic embryogenesis and plant
regeneration from leaf explants of Phalaenopsis amabilis. Biol. Plant. 50(2):
169-173.
7. Duong T.N., Bui V.L., Nguyen T.M., da Silva J.A.T., Fukai S., Tanaka M., Tran
Thanh Van K. (2002). Somatic embryogenetic through pseudo-bulblet
tranverse thin cell layer of Lilium longiflorum. Plant Grow. Reg. 37: 193-198.
8. Ernst R. (1967). Effect of carbohydrate selection on the growth rate of
Phalaenopsis and Dendrobium seeds. Arm. Orch. Soc. Bull. 36: 386-384.
9. Ernst R. (1967). Effect of organic nutrient additives on growth in vitro of
Phalaenopsis seedings. Arm. Orch. Soc. Bull. 36: 694-704.
10. Evans D.A., Sharp W., Flick C. (1981). Growth and behaviour of cell cultures.
In: Thorpe T.A. (Ed), Plant Tissure Culture – Methods and Application in
Agriculture. Orlando, Florida, USA. Academic Press, pp. 45-113.
11. Fridborg F., Erisksson T. (1975). Effects of activated charcoal on growth and
morphogenesis in a cell culture. Physio. Plant. 34: 306-308.
12. Fujimura T., Komamine A. (1975). Effect of various growth regulators on the
embryogenesis in a carrot cell suspension culture. Plant. Sci. Lett. 5: 359-362.
13. Hegarty C.P. (1955). Observation on the germination of the orchid seed. Am.
Orchid Soc. Bull. 24: 457-464.
14. Ishii Y., Takamura T., Goi M., Tanaka M. (1998). Callus induction and somatic
embryogenesis of Phalaenopsis. Plant cell Rep. 17: 446-450.
15. Kims. Y. (1994). Somatic embryogenesis of Phalaenopsis. Ph. D. Thesis. Uni.
Of Hawaii, USA.
16. Knudson L. (1951). Nutrient solutions for orchid. Botanical Gazette. 122: 528-
532.
17. Letham D.S. (1974). Regulation of cell division in plant tissure. XX. The
cytokinin of cocounut-milk. Physio. Plant. 27: 66-70. https://bienphap.net/

66
18. Morel G. (1974). Clonal mutiplication of orchids. In Withner C.L. (Ed) The
orchids: Scientific studies. Weiley-Interscience, New York. 169-222.
19. Murashige T., Skoog F. (1962). Arevised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue culture. Plant. Physio. 15: 473-479.
20. Niimoto D.H., Sagawa Y. (1961). Ovule development in Dendrobium. Arm.
Orch. Soc. Bull. 49: 372-373.
21. Polonca., Suzana., Zlata. (2004). Direct shoot regeneration from nodes of
Phalaenopsis orchids. Acta Agr. Slo. 83: 283-242.
22. Sagawa Y. (1961). Vegetative propagation of Phalaenopsis by stem cutting.
Arm. Orch. Soc. 30: 808-809.
23. Tran Thanh Van K. (2003). Thin cell layer concept. In: Duong T.N., Bui V.L.,
Tran Thanh Van K., Thorpe T. (Eds.). Thin cell layer culture system –
Regeneration and transformation applications. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, the Netherlands, pp. 1-16.
24. Wee-Peng Gow., Chen J.T., Chang J.T. (2008). Influence of growth regulators
on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids. Acta
Physio. Plant. 30: 507-512.

https://bienphap.net/

Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính Lan Hồ Điệp (phalaenopsis sp.)

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính Lan Hồ Điệp (phalaenopsis sp.)

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 4

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

8-top-ai-courses-for-customer-support-representatives-in-2025.pptx

7-essential-ai-courses-for-call-center-supervisors-in-2025.pptx

25-essential-ai-courses-for-user-support-specialists-in-2025.pptx

8-essential-ai-courses-for-insurance-customer-service-representatives-in-2025.pptx

Know for Certain