Otros tipos de separación cromatográfica: electroforesis capilar

Otros tipos de separación cromatográfica: Eletroforesis capilar

1. OTROS TIPOS DE SEPARACIÓN
CROMATOGRÁFICA
ELECTROFORESIS CAPILAR

















RÉKA CANE
GEMA LORENZO
TANIA AMILBURU

2. 2

ÍNDICE

1.Otros tipos de separación cromatográfica ................................................................................. 3
2. Electroforesis capilar ............................................................................................................... 10
3. Bibliografía .............................................................................................................................. 24

3. 3

OTROS TIPOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
1. Cromatografía.
La cromatografía es una técnica utilizada para analizar, identificar o separar
los componentes de una mezcla.
En cromatografía, los componentes de una mezcla se separan a partir de las
diferencias de velocidad a la que son transportados a través de una fase fija o
estacionaria por una fase móvil gaseosa o líquida.
La fase estacionaria está fija en un lugar, ya sea en una columna o en una
superficie plana. Mientras que, la fase móvil se mueve sobre la fase estacionaria o a
través de ella, arrastrando consigo la mezcla de analitos. La fase móvil puede ser un
gas, un líquido o un fluido supercrítico.
Los métodos cromatográficos se dividen en tres categorías, según la
naturaleza de la fase móvil: líquido, gas y fluido supercrítico.
La cromatografía de gases y la cromatografía de fluidos supercríticos requieren
el uso de una columna. Se puede usar fases móviles líquidas en superficies planas y
en columna.

1.1. Cromatografía plana.
En cromatografía plana, la fase estacionaria está extendida sobre la superficie
de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. El flujo de la fase móvil (siempre
líquida) se consigue por capilaridad (horizontal o ascendente) o por capilaridad y
gravedad (descendente).
Existen dos tipos de cromatografía plana:
- la cromatografía en papel (PC): el papel actúa como soporte de la fase
estacionaria (cromatografía de partición).
- la cromatografía en capa fina (TLC): un sólido adsorbente actúa como fase
estacionaria (cromatografía de adsorción, cambio iónico o exclusión) o como
soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición) extendido en una
capa fina sobre una placa, generalmente de vidrio.


1.1.1. Cromatografía en capa fina (TLC).
Las separaciones en capa fina se realizan en una placa de vidrio recubierta con
una capa delgada de partículas finamente divididas: esta capa constituye la fase
estacionaria. La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes.

4. 4

A) Preparación de placas de capa fina.

Una placa de capa fina se prepara esparciendo una suspensión acuosa del
sólido finamente molido, sobre la superficie limpia de una placa de vidrio o plástico, o
de un portaobjetos de microscopio. Se deja que la placa repose hasta que la capa se
asiente y se adhiera firmemente a la superficie.

B) Siembra.

La muestra se aplica en la placa antes de que se haga correr el eluyente por
ella, en forma de gota por medio de un capilar de vidrio.


Fig.4. Aplicación de la muestra en una placa.

C) Inicio del recorrido.

La fase líquida móvil asciende por la placa cubierta con una capa fina de fase
estacionaria por capilaridad.

D) Desarrollo de la placa.

Posteriormente la placa se deja secar y debe ser revelada por diversos
métodos.





Fig.5. Desarrollo de la placa.


► Resumen de todo el proceso.

El desarrollo de la placa es el proceso en el cual una muestra es transportada a
través de la fase estacionaria mediante una fase móvil. La forma más común de
desarrollar una placa consiste en verter una gota de la muestra cerca de uno de los

5. 5

bordes de la placa (las dimensiones de la mayoría de las placas son 5x20 o 20x20cm)
y marcar su posición con un lápiz. Una vez que el disolvente de la muestra se ha
evaporado, la placa se coloca en un recipiente cerrado, saturado con los vapores del
disolvente de desarrollo, el eluyente. Un extremo de la placa se sumerge en el
eluyente, teniendo cuidado de evitar el contacto directo entre la muestra y el
disolvente. Cuando el eluyente ya ha recorrido la mitad o 2/3 de la longitud de la placa,
se retira ésta del recipiente y se la deja secar. En seguida se determinan las
posiciones de los componentes por distintas formas.

E) Localización de los analitos en la placa.

Los dos métodos más comunes para la localización de los componentes de la
muestra después de la separación son:
- el rociamiento de la muestra con una disolución de yodo o H2SO4: estas
sustancias van a reaccionar con los compuestos orgánicos y dan lugar a
productos de color oscuro.
- la incorporación de un material fluorescente a la fase estacionaria. Al final del
desarrollo, se examina la placo bajo luz ultravioleta. Toda la placa brilla,
excepto en los lugares donde se localizan los componentes de la muestra (no
fluorescentes).


1.1.1.1. Aplicaciones de la cromatografía en capa fina.
Es una técnica de gran valor para separar compuestos de todo tipo (orgánicos,
inorgánicos, polares y no polares) dada su versatilidad según el sorbente empleado.
1.1.2. Cromatografía en papel (PC).
Las separaciones por cromatografía en papel se realizan de la misma forma
que las de placas de capa fina. En esta técnica, la celulosa actúa normalmente como
soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografía de partición). No
obstante, también se pueden emplear papeles impregnados (con adsorbentes como
gel de sílice, entre otros) o tratados químicamente, que amplían la aplicabilidad de
esta técnica.
Las únicas ventajas que supone utilizar la cromatografía en papel en lugar de la
cromatografía en capa fina se encuentra en que el papel es más barato y los
cromatogramas son más fáciles de manipular, cortar y archivar.
Su principal campo de aplicación se encuentra en la separación de solutos
hidrofílicos (compuestos o iones muy polares).

6. 6

1.1.3. Diferencias entre cromatografía plana y en columna.
La cromatografía plana es considerada la más simple de todas las técnicas
cromatográficas. La principal diferencia con la cromatografía en columna es de tipo
técnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. En lo que refiere
al fenómeno en que se basa la separación, es el mismo para ambas técnicas.
La cromatografía plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que,
la cromatografía en columna es un sistema de lecho cerrado.
En cromatografía plana, la separación se realiza por distancias, mientras que,
en columna se hace por volúmenes (o tiempos).
En cromatografía plana, la velocidad de la fase móvil sólo puede controlarse de
forma indirecta ya que está gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten
el paso de dicha fase a través del lecho cromatográficos. Sin embargo, en
cromatografía en columna, la velocidad de la fase móvil puede controlarse fácilmente,
dependiendo del gradiente de presión mantenido a través de la columna.
En general, los solutos más retenidos en cromatografía plana forman manchas
compactas, por lo que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos
más retenidos en la columna son los que dan picos más anchos y menos resueltos y
sensibles.

1.2. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)
Es una técnica híbrida de la cromatografía de líquidos y de gases que combina
algunas de las mejores características de cada una. En ella, la fase móvil es un fluido
supercrítico.
 Fluido supercrítico (SFC) – es cualquier sustancia sometida a una
temperatura y presión más altas que las de su punto crítico.





Fig.1. Diagrama de fases de un componente puro.

7. 7

Un fluido supercrítico se forma siempre que una sustancia se calienta por
encima de su temperatura crítica
1
. Por encima de la temperatura crítica, una sustancia
ya no puede ser condensada en forma líquida por la simple aplicación de presión.
1.2.1. Propiedades de fluidos supercríticos.



Fig.2. Comparación de propiedades de fluidos supercríticos, líquidos y gases.
La densidad de un fluido supercrítico (0,2 -0,5g/cm3) es entre 200 a 400 veces
la de su estado gaseoso y es casi tan densa como la de su estado líquido. Esta
densidad elevada, permite la disolución de grandes moléculas no volátiles.
Los fluidos supercríticos fluyen y son capaces de penetrar en matrices sólidas
como los gases.
Los solutos disueltos en fluidos supercríticos pueden ser recuperados
fácilmente (equilibrando las disoluciones a presión atmosférica, a temperaturas
relativamente bajas).

1.2.2. Variables instrumentales y operativas de la cromatografía de fluidos
supercríticos.
Los instrumentos para la cromatografía de fluidos supercríticos son similares en
diseño a los empleados en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), puesto
que, las temperaturas y las presiones necesarias para crear los fluidos supercríticos a
partir de diversos gases y líquidos se ajustan bien dentro de los límites de trabajo de
un equipo de HPLC corriente. Pero hay dos diferencias importantes entre ellos:
- es necesario un horno de columna con termostato, similar al que se emplea en
cromatografía de gases, para proporcionar un control preciso de la temperatura
de la fase móvil.


1
Temperatura crítica de una sustancia – es aquella por encima de la cual una sustancia no puede ser
licuada.
Presión crítica – presión de vapor de una sustancia en su temperatura crítica. Es la mínima presión que
tiene que ser aplicada para causar la licuación a una temperatura crítica.

Gas (STP) SFC Líquido
Densidad (g/cm3) (0,6-2).10
-3
0.2-0,5 0,6- 2
Viscosidad (g/cm-1 s-1) (1-3).10
-4
(1-3).10
-4
(0,2-0,3).10
-5

Difusividad (cm2/s) (1-4).10
-1
(10
-3
-10
-4
) (0,2-2).10
-3

8. 8

- se utiliza un restrictor, o un dispositivo de contrapresión, para mantener la
presión de la columna en el nivel deseado y para convertir el eluyente de un
fluido supercrítico en un gas y arrastrarlo al detector.



Fig.3. Diagrama de bloques de un instrumento para cromatografía de fluidos supercríticos.
Los parámetros de un instrumento comercial para cromatografía de fluidos
supercríticos, como presión de bombeo, temperatura del horno y funcionamiento del
detector, se controlan mediante un ordenador.
A) Efecto de la presión.
Las variaciones de presión en SFC tienen un efecto muy marcado sobre el
factor de retención k
2.
Al aumentar la presión aumenta la densidad de la fase móvil,
incrementando así el poder de resolución (disminuyendo así el tiempo de elución
3
).
B) Fase estacionaria.
En cromatografía de fluidos supercríticos se emplean tanto las columnas
rellenas como las columnas tubulares abiertas. Las columnas rellenas proporcionan
más platos teóricos y permiten manejar volúmenes de muestras más grandes que las
columnas tubulares abiertas. Debido a la baja viscosidad de los medios supercríticos,
las columnas pueden ser mucho más largas que las utilizadas en cromatografía de
líquidos, siendo comunes longitudes de columna de 10 a 20m con diámetros interiores
de 50 a 100μm. En el caso de separaciones difíciles, se usan columnas de 60m o más.
Las columnas tubulares abiertas son simplemente columnas capilares (de sílice
fundida) recubiertas con una capa fina de fase estacionaria. Las columnas rellenas

2
Factor de retención k (de un determinado soluto) – se relaciona con la velocidad con la que el soluto
migra a través de una columna. Es la cantidad de tiempo que pasa de un soluto en la fase estacionaria
en relación con el tiempo que pasa en la fase móvil.
3
Elución – es un proceso en el cual los solutos son arrastrados a través de una fase estacionaria por el
movimiento de una fase móvil.

9. 9

están hechas de acero inoxidable de 10 a 25cm de largo. Los revestimientos de
columna más comunes en SFC son los polisiloxanos, que están químicamente unidos
a la superficie de las partículas de sílice o a las paredes internas de sílice de los
capilares. Los espesores de las películas son de 0,05 a 0,4μm.
C) Fases móviles.
La fase móvil más usada en SFC es el CO2. Es un excelente solvente para un
conjunto de moléculas orgánicas no polares. Transmite en la región ultravioleta y es
inodoro, no tóxico. Es muy fácil obtenerlo y es menos caro en comparación con otros
solventes cromatográficos.
La temperatura crítica del CO2 es de 31ºC y su presión crítica es igual a
72,9atm, permitiendo trabajar en una serie de temperaturas y presiones que se
encuentran dentro del límite de operación del HPLC.
D) Detector.
La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se puede utilizar
detectores de ionización por llama. Los espectrófotometros de masa también pueden
ser más fácilmente adaptados como detectores para SFC que para HPLC. Diversos
detectores empleados en la cromatografía líquida se emplean también en SFC:
ultravioleta, infrarrojo, fluorescencia y detectores fotométricos de llama.

1.2.3. Comparación de la SFC con otros tipos de cromatografía.
Las ventajas de la SFC vienen dadas por el hecho de que los fluidos
supercríticos poseen propiedades físicas entre los gases y los líquidos.
Los fluidos supercríticos, tal como los gases, tienen baja viscosidad,
permitiendo así, tasas de flujo más elevadas.
Las velocidades de difusión en los fluidos supercríticos son intermedias entre
las de los gases y las de los líquidos. Por consiguiente, el ensanchamiento de banda
es mayor en los fluidos supercríticos que en los líquidos, pero menor que en los gases.
En cromatografía gaseosa, la fase móvil funciona apenas como medio de
transporte. Mientras que, en la cromatografía líquida, la fase móvil funciona no sólo
como medio de transporte, interactuando además con el soluto (influyendo así en los
factores de selectividad).
En SFC, los solutos al estar disueltos en la fase móvil, se vaporizan a una
temperatura más baja que en la cromatografía gaseosa. Esto, posibilita el análisis por
SFC de compuestos de elevada masa molecular, especies térmicamente inestables,
polímeros y otras moléculas.

10. 10

1.2.4. Aplicaciones de la cromatografía de fluidos supercríticos.
La SFC se suele utilizar en el análisis de muestras de alimentos, biomédicas,
industriales y ambientales. Además de los usos analíticos de la extracción de fluidos
supercríticos también se emplea en la preparación y el aislamiento en industrias
farmacéutica y de polímeros.

11. 11

ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis es un método de separación en la que los analitos se separan
según su capacidad para desplazarse a través de un medio de conducción,
habitualmente un tampón acuoso, en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico.
Fue introducida por el químico sueco Arne Tiselius en 1937 con la finalidad de
separar proteínas séricas. Observó que, situando una mezcla de proteínas en el
interior de un tubo vertical en forma de ‘U' lleno de una solución tampón libre y
aplicando un campo eléctrico (Fig.1), cada proteína migraba de forma distinta (Fig.2).
En 1948 fue galardonado con el Premio Nobel de Química por estos trabajos.
Figura1 Figura2
En ausencia de otros efectos, los cationes migran hacia el cátodo de carga
negativa del campo eléctrico, y los aniones lo hacen hacia el ánodo con carga positiva.
La velocidad de migración de una especie depende de su carga y también de su
tamaño. Por consiguiente, las separaciones se basan en las diferencias de la relación
carga/tamaño entre los diferentes analitos presentes en la muestra. Cuanto mayor es
esta relación, más rápido migra un ion en el campo eléctrico.
Existen varios tipos de electroforesis. En la electroforesis de gel en placa el
tampón conductor se mantiene en un gel poroso de agarosa o poliacrilamida, son
medios anticonvectivos que mejoran la eficiencia de la separación. Las placas se
fabrican vertiendo el gel entre dos láminas de vidrio separadas por espaciadores. El
espesor típico es de 0,25-1mm. A pesar de ser una de las técnicas de separación más
ampliamente utilizadas (sobre todo en bioquímica para secuenciar ADN), presenta
como problemas la dificultad en la detección y la automatización, tiempos largos de
análisis y bajas eficiencias. Estos últimos problemas son causados por la limitación
que supone la aplicación de altos voltajes. Aunque es una herramienta magnífica para
el análisis cualitativo de las mezclas complejas, su utilidad en trabajos cuantitativos es
menor. La técnica ha ido evolucionando a lo largo de los años hasta que a partir de los
años 60 se comienza a desarrollar la técnica de electroforesis en columnas capilares
de sílice fundida naciendo así la electroforesis capilar (CE,Capillary Electrophoresis)
en 1988. El tampón conductor se mantiene en un tubo capilar que mide 25-75µm de
diámetro interno. Las muestras se inyectan por uno de los extremos del tubo capilar. A
medida que la muestra migra a lo largo del capilar, sus componentes se separan y
eluyen de la columna tras intervalos diferentes. El uso de éstos capilares conlleva
múltiples ventajas respecto a la electroforesis clásica:

12. 12

- Los capilares son anticonectivos en sí mismos y, por tanto, no es necesaria la
utilización de un gel soporte como medio.
- El calor generado al pasar la corriente eléctrica (efecto Joule), que daría lugar a
problemas de gradientes de temperatura no uniformes, cambios locales de
viscosidad o deformación del pico (señal) del analito, es reducido de forma muy
eficaz, ya que la disipación de calor en los capilares es muy efectiva.
- En consecuencia, pueden aplicarse altos voltajes y, por tanto, se consigue una
reducción del tiempo de análisis y altas eficiencias.
- Se tiene la posibilidad de realizar la detección en columna, lo que permite la
automatización de la técnica.
Por ahora, la electroforesis ordinaria es la técnica de separación más
ampliamente utilizada en biología y bioquímica. Aunque en muchos casos, la
electroforesis capilar es un sustituto satisfactorio con diversas e importantes ventajas
(gran versatilidad, rapidez, alta capacidad de resolución y eficiencia). Algunas de las
aplicaciones y tendencias de los trabajos actuales de CE son:
 Farmacéutico Determinaciones de principios activos, métodos de CE
validados para control de calidad, separaciones quirales.
 Clínico Análisis de metabolitos en fluidos biológicos, sustancias prohibidas en
fluidos biológicos, análisis forense.
 Bioquímico Separaciones de proteínas, separación de ácidos nucleicos,
secuenciación de ADN.
 Alimentario Análisis de conservantes, análisis de edulcorantes, análisis de
colorantes.
 Ambiental Control de calidad de aguas depuradas, determinación de ácidos
húmicos y flúvicos en extractos de suelos, separaciones quirales de PBCs y
fenoxiácidos en herbicidas, separación de iones metálicos.

2. Fundamentos teóricos.

En electroforesis capilar, la muestra se introduce, con una disolución
tamponada, en el interior de un tubo capilar. Cuando se aplica un campo eléctrico a
este tubo, los componentes de la muestra migran gracias a dos tipos de movilidad:
movilidad electroforética y movilidad eslectroosmótica.
La movilidad electroforética es la respuesta del soluto al campo eléctrico
aplicado. Gracias a ella, el soluto se desplaza a través del medio conductor a una
cierta velocidad que viene dada por la expresión:
V = µefE

13. 13

Donde µef es la movilidad electroforética del soluto y E, la magnitud del campo
eléctrico aplicado. µef depende a su vez de la carga del soluto (q), de su radio (r), y de
la viscosidad del disolvente tampón (ŋ), según la expresión:
µef = q / 6πŋr
Estás dos ecuaciones descritas, permiten extraer varias conclusiones
importantes en relación con la velocidad electroforética el soluto. La movilidad
electroforética y, por tanto, la velocidad electroforética, son máximas en los solutos de
mayor carga y menor tamaño. Como q es positiva para los cationes y negativa para los
aniones, estas especies migran en direcciones opuestas. En las especies neutras, q
es igual a 0 y, por tanto, su velocidad electroforética también es 0.
Movilidad electroosmótica. Cuando se aplica un campo eléctrico a un capilar
lleno de un tampón acuoso, sería de esperar que los iones del tampón migraran en
respuesta a su movilidad electroforética. Como el disolvente, H2O, es neutro, lo
razonable sería que permaneciera estacionario. Sin embargo, lo que en condiciones
normales se observa es que la disolución tampón se desplaza hacia el cátodo. A este
fenómeno se le denomina flujo electroosmótico (EOF, Electro-Osmotic Flow).
La electroósmosis se produce porque las paredes del tubo capilar poseen
carga eléctrica. La superficie del capilar de sílice contiene un gran número de grupos
silanol (Si-OH). Con un pH superior a 2 o 3, los grupos silanol se ionizan: SiOH SiO
-
+ H
+
, por lo que se forma entonces una capa
4
de protones (H
+
) cerca de la pared
cargada negativamente. Estas cargas positivas, incluyendo las moléculas de
solvatación de agua, son atraídas hacia el cátodo provocando el ya citado EOF
(Fig.3).






4
Se le denomina doble capa elctroquímica (DCE), formada por dos sub-capas: capa adyacente fija por
adsorción (Capa de Stern) y capa difusa y móvil (Capa de Gouy-Chapman).
Figura3
EOF
Capa difusa
Capa de Stern
Pared capilar
CÁTODO

14. 14


La velocidad del flujo electroosmótico, veof, depende de la magnitud del campo
eléctrico aplicad y de la movilidad electroosmótica de la disolución tampón, µeof:
Veof = µeofE
La movilidad electroosmótica se define como:
µeof = εζ / 4πŋ
Donde ε es la constante dieléctrica de la disolución tampón, ζ es el potencial
zeta y ŋ es la viscosidad de la disolución tampón. El potencial zeta es el cambio de
potencial a través de una doble capa.
Los principales factores que afectan a la movilidad electroosmótica son la
constante dieléctrica, la viscosidad de la disolución de separación y el valor del
potencial zeta. El uso de aditivos y otros modificadores de la disolución de trabajo
pueden influir en la constante dieléctrica y la viscosidad (que dependerá a su vez de la
temperatura a la cual se lleva a cabo la separación).
El potencial zeta (ζ) es proporcional a la densidad de carga en la pared del
capilar, la cual, a su vez, es dependiente del pH. Por tanto, la movilidad variará acorde
con el pH de la disolución de separación, de tal forma que a elevados valores de pH, la
movilidad del EOF será significativamente más importante que a pH bajos (Fig.4). El
potencial zeta también dependerá de la fuerza iónica de la disolución de separación,
puesto que una fuerza iónica elevada hará que la doble capa se comprima, lo cual
producirá un decrecimiento del potencial zeta y reducirá la movilidad de flujo
electroosmótico.



A pH>7, la movilidad de EOF es suficiente para asegurar la completa migración
de la mayoría de los iones hacia el cátodo independientemente de su carga. Por lo
tanto, la velocidad de migración observada de un soluto no está relacionada
directamente con su movilidad electroforética, sino que está relacionada con una
combinación de la movilidad electroforética y electroosmótica. Así, la velocidad total o
neta del soluto, vtot, es la suma de su velocidad electroforética, vef, y de la velocidad del
flujo electroosmótico, veof, (igual que la movilidad electroforética total de un soluto, µtot,
puede ser calculada utilizando su velocidad de migración observada, que corresponde
Figura4
Movilidad
EOF
pH
Grupos silanoles
completamente ionizados

15. 15

al vector suma de la movilidad electroforética real, µef, y la movilidad de flujo
electroosmótico, µeof).
vtot = vef + veof (µtot = µef + µeof)
Si el flujo electroosmótico es mayor que las movilidades electroforéticas de los
iones de la muestra, los aniones, los cationes y las moléculas neutras contenidas en
ella pueden ser separados en una misma inyección.
En condiciones normales, se mantienen las relaciones siguientes:
 (vtot)cationes > veof
 (vtot)aniones < veof
 (vtot)neutros = veof
Por tanto, los cationes salen primero, según un orden que corresponde a su
movilidad electroforética, con los cationes pequeños y de carga elevada antes que los
cationes de carga menor y de mayor tamaño. Las especies neutras salen en una sola
banda, con una velocidad de elución que corresponde a la velocidad del flujo
electroosmótico. Los aniones son los últimos componentes en salir, siendo los más
pequeños y de mayor carga los que tienen un tiempo de elución más largo (Fig.5).

El perfil del flujo en electroforesis capilar es plano (Fig.6) como consecuencia
de que la doble capa es muy delgada y la fuerza conductora está uniformemente
distribuida a lo largo de todo el capilar. Gracias a esto, el ensanchamiento de banda
debido a la resistencia a la transferencia de masa, y los efectos de calentamiento son
mínimos, lo que permite obtener altas resoluciones en la separación. En los sistemas
conducidos por presión (HPLC, por ejemplo) el perfil del flujo es parabólico, dando
lugar a picos más anchos.


Figura6


Flujo laminar (HPLC) Flujo electroosmótico
ÁNODO CÁTODO ÁNODO CÁTODO
Figura5

16. 16

3. Instrumentación.

La electroforesis capilar tiene ciertas similitudes con la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography), hasta tal punto que
en ocasiones la electroforesis capilar se ha nombrado como electroforesis capilar de
alta resolución (HPCE, High Performance Capillary Electrophoresis). La CE ha tomado
los componentes esenciales de la HPLC y de la electroforesis convencional.
Los componentes básicos de cualqui er sistema de EC (Fig.7),
independientemente de su configuración, aspecto exterior, modelo y marca, son los
siguientes: Viales fuente y destino. Medio electroforético. Capilar. Fuente de alto
voltaje. Vial de muestra. Sistema de detección. Sistema de refrigeración. Sistema de
registro.


Este conjunto de componentes básicos puede ser ampliado con otros como
muestreadores automáticos, colectores de fracciones, softwares diferentes, etc., que
son los que marcan las diferencias entre unos instrumentos y otros.
Los viales de fuente y destino son imprescindibles en cualquier sistema de
electroforesis. En ellos se introducen los extremos del capilar para que se llene con el
medio electroforético que contienen. En los respectivos viales de entrada (fuente o de
muestra) y salida (destino), además, se encuentran sumergidos el electrodo positivo
(ánodo) y el electrodo negativo (cátodo), los cuales están conectados a la fuente de
alto voltaje que proporciona la energía para que tenga lugar la electroforesis.
Generalmente las cubetas o viales contienen el mismo tipo de disolución reguladora
que a su vez es el mismo con el que se rellena el capilar.
El medio electroforético facilita el contacto eléctrico entre el cátodo y el
ánodo. Este medio electroforético suele ser una disolución reguladora para evitar las
modificaciones de pH que puedan influir en la migración electroforética y contiene
además una determinada cantidad de electrolitos disueltos (carga iónica) para
aumentar su conductividad eléctrica. Éste es un componente esencial de la
electroforesis capilar ya que sin él no se establecería la corriente eléctrica necesaria
para permitir la migración de especies. Según la composición del medio electroforético
podemos modificar las condiciones de la electroforesis. En las técnicas con enfoque
Figura7

17. 17

isoeléctrico, la disolución reguladora contiene anfolitos que generan gradientes de pH
durante la “carrera” electroforética. Se emplea una amplia variedad de disoluciones
reguladoras y aditivos para ajustar una mayor resolución de las muestras de acuerdo
con el analito a estudiar y el tipo de metodología que se utilice. No obstante, todas las
disoluciones reguladoras tienen una toxicidad nula o baja, en contraste con las
utilizadas en HPLC que suelen ser tóxicas.
El capilar hace de puente de contacto entre el cátodo y el ánodo cerrando el
circuito eléctrico, Se rellena de disolución reguladora cuando se introduce en el vial de
entrada. Los capilares son de sílice fundida y tienen un diámetro interior que oscila
entre 20-200 mm, y una longitud que también puede oscilar entre 20-100 cm. Suelen
estar recubiertos en el exterior de poliamida para conferirles flexibilidad y resistencia.
La fuente de alto voltaje desarrolla, durante la separación, unos voltajes muy
elevados necesarios en esta técnica (20-30 kV). Debe intercalarse un estabilizador de
corriente para mantener el campo eléctrico aplicado.
Existen diferentes sistemas de introducción de la muestra en el capilar. Se
dispone en un vial que corresponde a uno de los viales de entrada. Entre los más
comunes se encuentran:
- Sistema hidrodinámico: Se basa en una diferencia de presión a lo largo del
capilar que puede conseguirse por presión (en el que se establece una presión
con gas auxiliar sobre la muestra en la que está sumergido el capilar, lo que
requiere un sistema cerrado), por gravedad (estableciendo una presión
hidrostática por gravedad mediante el llenado del capilar hasta una altura dada
en un tiempo definido) y por vacío (aplicando vacío por el otro extremo del
capilar, lo que induce la succión de la muestra por el extremo en contacto con
la misma).
- Sistema electrocinético: En este caso la muestra se desplaza al interior del
capilar mediante el movimiento electroforético y/o electroendosmótico
producido por la generación de un campo eléctrico en el ánodo, es decir,
dentro del vial de la muestra.
El sistema de detección permite determinar y cuantificar los diferentes
componentes de la muestra previamente separados. Los detectores que se pueden
acoplar a los sistemas de CE deben ser sensibles a pequeñas cantidades de muestra
y compatibles con las dimensiones físicas del capilar. El detector puede situarse fuera,
en uno de los extremos del capilar (detección off line) o bien en el mismo capilar, cerca
del vial de salida (detección on line). Éste será diferente según la naturaleza y tipo de
sustancia a analizar. Se utilizan las mismas detecciones que en HPLC.
El sistema de refrigeración es necesario para disipar el exceso de calor
producido en el capilar por efecto Joule y evitar los problemas que derivan de este
efecto.
El sistema de registro y procesamiento permite introducir instrucciones, variar
los parámetros del sistema, interpretar las lecturas del detector, realizar cálculos y

18. 18

presentar los datos obtenidos en el análisis posterior a la separación electroforética. La
presentación se puede hacer mediante cualquier sistema habitual de registro (pantalla,
representación en papel…) mostrando el electroferograma resultante del análisis. Hoy
en día los instrumentos de electroforesis capilar están controlados por ordenador.

4. Tipos de electroforesis capilar.
Existen diferentes tipos de Electroforesis Capilar, Electroforesis Capilar de
Zona (ZCE), Cromatografía Electrocinética Capilar Micelar (MEKC), Electroforesis
Capilar de Geles (CGE), Isoelectroenfoque Capilar (CIEF), Isotacoforesis Capilar
(CITP) y Electrocromatografía Capilar (CEC).

4.1. Electroforesis capilar de zona (ZCE).
Es la técnica más comúnmente utilizada debido a su simplicidad y versatilidad.
El mecanismo de separación se basa en las diferencias en la relación
carga/masa de las diferentes sustancias que componen una muestra. Estas
diferencias implican diferentes movilidades electroforéticas y por tanto, diferentes
velocidades de migración de las especies iónicas en el medio electroforético que
contiene el capilar. Este mecanismo de separación permite la separación de mezclas
de aniones y cationes aunque las especies neutras no podrán ser separadas.
El tubo capilar se rellena de una disolución tampón. La muestra se carga en
uno de los extremos del tubo capilar. Se coloca de nuevo la columna en sendos viales
que contienen el mismo tampón y se aplica el campo eléctrico.
En condiciones normales, la muestra se sitúa en el ánodo, y los solutos migran
hacia el cátodo a causa del flujo electroosmótico (FEO). Los cationes migran los
primeros. Siendo los más rápidos los que tienen mayor carga y menor tamaño, y los
últimos los de menor carga y gran tamaño. Los elementos neutros están englobados
en una sola señal. Los aniones, son los últimos, su orden es contrario al de los
cationes.

19. 19

MICELA
ZCE puede usarse para separar casi cualquier compuesto ionizado que sea
soluble en el tampón, incluyendo aniones y cationes inorgánicos, moléculas pequeñas
incluidas en productos farmacéuticos o biomoléculas grandes.
Un problema de la ZCE es la tendencia de algunos cationes a adsorberse
sobre la pared del capilar cargado negativamente. Este efecto supone un hándicap en
la separación de proteínas. Para minimizarlo las separaciones son llevadas a cabo a
menudo a bajos valores de pH donde la carga del capilar es mínima. Alternativamente,
los capilares pueden ser recubiertos con aditivos.
También, numerosos compuestos insolubles en agua han sido separados por
ZCE con tampones no acuosos.

4.2. Cromatografía Electrocinética Capilar Micelar (MEKC).
Separa tanto especies cargadas como moléculas neutras. Se
basa en el reparto de los analitos entre dos fases que son las
micelas y la disolución tampón de separación.
La disolución tampón contiene surfactante, un detergente (el
dodecilsulfato de sodio (SDS) es el surfactante más utilizado) a
una elevada concentración, que corresponde a una
concentración micelar crítica. De esta manera se forman
micelas (agregados de moléculas de detergente). Las micelas
son de forma esférica, y tienen una región hidrofílica y una
región hidrofóbica. Los agregados se sitúan en contacto con la disolución y su parte no
polar se dirige hacia el centro de la micela. Esto hace que la micela tenga una
superficie cargada y migre con el flujo electroosmótico y con su propia movilización
electroforética. Al ser de distinta naturaleza que la disolución acuosa, estas micelas
constituyen una segunda fase que puede considerarse como una pseudofase en un
sentido cromatográfico. Los analitos se reparten entre la disolución acuosa y la
pseudofase micelar.
Puesto que las micelas están negativamente cargadas, migraran hacia el
cátodo a menos velocidad que los cationes.
Los compuestos hidrofóbicos tendrán afinidad con la porción hidrofóbica de la
micela, mientras que los compuestos hidrofílicos permanecerán en la disolución
tampón.
El orden de migración es el siguiente: compuestos hidrofílicos, compuestos
menos hidrofóbicos y compuestos más hidrofóbicos.

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Las moléculas neutras interaccionan con la micela en diferente grado en
función de su hidrofobicidad, dando lugar a la separación. Todos los compuestos
neutros deben aparecer entre los compuestos hidrofílicos y los más hidrofóbicos.
Los compuestos más hidrofóbicos interactúan más fuertemente con la micela, y
son más retenidos. La separación de solutos neutros es esencialmente
cromatográfica. La selectividad puede ser manipulada variando la naturaleza física
(tamaño, carga, geometría) de la micela, usando diferentes tensoactivos.
Esta metodología ha sido aplicada sobre una amplia variedad de analitos que
incluyen tanto moléculas pequeñas (en análisis de alimentos, vitaminas…) como
grandes biomoléculas (proteínas y péptidos).
4.3. Electroforesis capilar de geles (CGE).
Opera usando capilares rellenos de gel. En muchos casos un gel es un
polímero entrelazado de porosidad controlable. Se forma una matriz sólida pero
porosa. Es decir, esta separación está basada en un tamizado o criba molecular.
La separación se basa en la diferencian de tamaños y de cargas. Si tenemos
una misma relación de carga, la separación está basada únicamente en el tamaño.
Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico,
las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas
positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente.

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Se emplea para separar grandes biomoléculas: fragmentos de ADN, proteínas,
nucleótidos, polisacáridos.
4.4. Isoelectroenfoque capilar (CIEF).
Separa analitos atendiendo a las diferencias entre sus puntos isoeléctricos.
Este procedimiento está destinado a la separación de componentes anfóteros
(como proteínas o polipéptidos) de una mezcla en un gradiente de pH continuo y
estable que se extiende desde bajo pH en el ánodo y elevado en el cátodo.
Los anfolitos son compuestos anfóteros que pueden existir como aniones o
cationes dependiendo del pH de la disolución en la que se encuentren. El pH al cual el
anfolitos es neutro se denomina punto isoeléctrico (pI). A un valor del pH menor del pI
el anfolito se encuentra como catión, y por encima del pI, como anión.
Es decir, el CIEF se basa en la migración electroforética de sustancias
anfóteras en un gradiente de pH.

Para realizar la separación siguiendo este principio, el extremo anódico del
capilar tendrá que estar sumergido en una disolución ácida, mientras que el catódico,
en una solución básica.

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La columna se rellena con una disolución de anfolitos y la muestra. Tras la
aplicación de un voltaje se genera un gradiente de pH estable en el interior de la
columna capilar.
Los componentes cargados de la muestra, migran entonces a través del capilar
hasta que lleguen a una región donde el pH sea igual a su pI, momento en el cual se
convierten en especies neutras y por lo tanto, cesan de migrar. El resultado final será
una serie de zonas estrechas donde se agrupan (enfocan) los solutos hasta conseguir
una condición de estado de equilibrio.
Una vez alcanzado el enfoque (la proteínas se sitúan en zonas de pH igual a su
punto isoeléctrico) hay que movilizarlos para que pasen a través detector y obtener así
el correspondiente electroferograma.


Una vez que cada analito ha alcanzado la región donde es neutro, las
posiciones de las bandas se mantienen constantes y no cambian con el tiempo.
4.5. Isotacoforesis capilar (CITP).
Este modo puede ser empleado para separar especies iónicas, pero no es
posible realizar la separación de aniones y cationes durante el mismo análisis.
Las bandas de todos los analitos migran a la misma velocidad.
En una separación, la muestra se inyecta entre dos tampones; el líder, que
contiene los iones de mayor movilidad y el terminal en el que van los iones de menor
movilidad que los iones de la muestra. Las bandas de las muestras se desplazan en el
interior del capilar de separación entre estas dos disoluciones tampón de diferente
conductividad eléctrica.

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Se consigue que los distintos iones que componen la muestra sean acelerados
o frenados hasta conseguir bandas estrechas donde se concentra cada uno de ellos,
que se desplazan a la misma velocidad a través del capilar.
Cuando en una separación por isotacoforesis se aplica inicialmente un
potencial, los iones migran como en la electroforesis de zona, cada ion a una
velocidad característica. La diferencia en las velocidades de migración da lugar a la
separación de los distintos analitos en bandas adyacentes, con la especie más rápida
situada en la banda más próxima al tampón conductor y la más lenta inmediatamente
por delante del tampón terminal. Una vez que se han formado todas las bandas, todas
ellas se mueven a la misma velocidad. La razón por la que todas las bandas se
mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace más reducido para las
bandas más móviles y se hace más intenso para las bandas más lentas, de tal forma
que la corriente es la misma en todas las zonas del tampón.
La señal obtenida es totalmente diferente al resto de tipos de electroforesis
capilar y se denomina isotacoferograma. La señal que se obtiene es forma de
escalera. Cada escalón se caracteriza por su anchura y altura. Esta última es una
propiedad cualitativa de las sustancias y se emplea para su identificación, mientras
que el análisis cuantitativo se basa en la anchura del escalón.
4.6. Electrocromatografía capilar (CEC).
Es una técnica de separación híbrida que combina características tanto de EC
como de HPLC.
El tubo capilar está relleno de una materia de sílice empaquetado con alguna
fase estacionaria no polar o algún tipo de fase enlazada a la pared del capilar de forma
directa. Puede retener los solutos por medio de equilibrios de distribución normales
asociados a cromatografía.
Como el líquido está en contacto tanto con las paredes de sílica como con las
partículas de sílica en la fase estacionaria, se genera flujo electroosmótico. El solvente
se transporta gracias a este FEO en lugar de por una bomba mecánica de alta presión.
La FEO es generada de forma uniforme a lo largo de todo el capilar.

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Las moléculas neutras se separan en base a mecanismos puramente
cromatográficos, mientras que los ácidos y las bases se separan por una combinación
de mecanismos cromatográficos y electroforéticos.

5. Aplicaciones al análisis de alimentos.
La electroforesis capilar puede detectar la mayoría de los grupos de sustancias
químicas en alimentos.
HIDRATOS DE CARBONO: Es una categoría muy examinada con EC. Se
realizan análisis satisfactorios en los productos que requieren edulcorantes artificiales
como los jugos, el café, azúcares en vino, etc. Los hidratos de carbono absorben en el
bajo UV, por lo que la derivación con complejos de borato es comúnmente utilizada.
Un método indirecto utilizando electrolitos cromóforos es otra posibilidad en el análisis
de azúcares.
ÁCIDOS ORGÁNICOS: Los ácidos carboxílicos son componentes importantes
en los alimentos. En las bebidas fermentadas como el vino, la sidra, la cerveza y otras,
la detección de ácidos orgánicos como cítricos e isocítricos, málico o tartárico, permite
controlar la calidad de los productos elaborados. La electroforesis capilar es capaz de
aislarlos de forma exhaustiva.
IONES ORGÁNICOS: También por métodos indirectos es posible separar y
cuantificar, mediante el uso de un detector de UV, la mayoría de los cationes y
aniones. Se detectan en el control de calidad de aguas, aguas minerales, en yogurt,
vino, etc.
AMINOÁCIDOS, PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS: La proteólisis de las
caseínas es el fenómeno más importante para cuantificar el grado de maduración del

25. 25

queso y se puede optimizar la separación de caseínas mediante electroforesis capilar
(EC), sobre muestras de leche de vaca y oveja
5
.
Las gliadinas son proteínas del trigo que desempeñan un papel central en la
formación del gluten, ya que son las responsables de la viscosidad de la red. Pese a
su importancia han sido menos estudiadas que las gluteninas, debido a que sus
inusuales propiedades de solubilidad e hidrofobicidad dificultan su caracterización. La
capacidad de la electroforesis capilar para discriminarlas ha permitido estudiar su perfil
proteico
6
.
Sólo tres aminoácidos absorben en el UV. Varios investigadores han logrado
modificar las superficies internas de las capilares, agregando surfactantes específicos
en los tampones para permitir su separación. Estos métodos han sido utilizados para
la detección de proteínas en productos lácteos, huevo, cereales, soja o carnes.
Además, la detección de productos de degradación de proteínas y ácidos nucleicos
son marcadores en el control de calidad de los productos cárnicos.
ADITIVOS Y COMPONENTES NATURALES: Se han logrado identificar y
caracterizar por primera vez
7
diferentes compuestos antioxidantes de alimentos como
el aceite, la miel, la nuez y una planta medicinal denominada Teucrium polium.
Utilizando dos técnicas, la electroforesis capilar y la cromatografía líquida de alta
resolución, que han permitido identificar y cuantificar gran parte de los compuestos
fenólicos que poseen cada una de ellas.
Las vitaminas B y la vitamina C, han sido examinadas en varios tipos de
alimentos, particularmente en jugos. La determinación de ácido sórbico en diversos
alimentos como bebidas o pan dulce, es posible realizarla en pocos minutos. Otros
aditivos como el ácido benzoico pueden ser cuantificados sin inconvenientes.
CONSERVANTES: El benzoato de sodio y el sorbato de potasio se usan
mucho como conservantes y se pueden cuantificar en jugos por electroforesis capilar.
MICOTOXINAS: son unas toxina producidas por organismos del Reino Fungi
(setas, mohos y levaduras). Las micotoxinas pueden contaminar los alimentos, o los
piensos originando un grupo de enfermedades y trastornos (micotoxicosis) que
resultan tóxicos para el hombre o los animales. La cromatografía electrónica micelar
es la más empleada para el análisis de estas micotoxinas.




5
Tesis Doctoral: Albillos García, Silvia María. Universidad de Burgos
6
Estudio realizado por Colombo A.; P.D. Ribotta y A.E. León, UNC.
7
Estudio realizado por Científicos de la Universidad de Granada.

26. 26

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