PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. PCR Reaccion en cadena de la polimerasa Integrantes: Bárbara Avello Paulina Campos Profesor Guía: Isabel Castro Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Tecnología Médica Bioquímica II

2. Un poco de historia… Técnica desarrollada en 1985 por el Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis quien recibió el premio Nobel de Química de 1993. Esta tecnica resultó ser una revolución en la investigación biológica y médica.

3. Definición de PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la amplificación directa de un gen (o fragmento de DNA) o indirecta de un RNA , presente en mezclas de muy diversas fuentes. * No es necesaria una purificación previa de la muestra íntegra original.

4. Tiene la capacidad de amplificar millones de veces fragmentos pequeños de DNA de hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un período de tiempo relativamente corto. Es un método muy adecuado para preparar ácidos nucleicos en una cantidad muy superior a la de la muestra original.

5. Objetivo básico de la PCR

6. Fundamentos

7. Requerimientos 1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA) 2.- Primers 3.- DNA polimerasa resistente a alta temperatura 4.- Mg ++ 5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP, dGTP,dCTP, dTTP) 6.- Buffer, KCl

8. 1.- Templado o Molde Molécula que contiene la región de DNA que se quiere amplificar. Puede ser DNA o cDNA. Se requiere poca cantidad. No debe ser necesariamente puro. Tiene que ser libre de altas concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes .

9. 2.-Primers (iniciadores, partidores o cebadores) 2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a la región blanco, uniéndose por complementariedad de bases a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se quiere amplificar. Primer sentido Primer antisentido

10. Deben ser específicos para la secuencia a amplificar. Deben tener idealmente un alto % de C+G, entre un 40-60%. Deben evitar ser complementarios entre si, especialmente en el extremo 3 ´. Deben evitar formar estructuras secundarias. Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb .

11. La concentracion debe ser adecuada para favorecer la hibridacion entre el molde y el primer. Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de melting ) similar,con una diferencia de no mas de 5ºC. T m = [ 2 x (A + T) + 4 x (G + C) ] – 5 La temperatura de annealing o de hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos que los valores de Tm obtenidos.

12. 3.- DNA polimerasa Características que debe tener la enzima: PROCESIVIDAD FIDELIDAD TERMOESTABLE

13. Taq DNA polimerasa Termoestable: -Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas termales). -Comete un error cada 10.000 nucleótidos. -Su temperatura optima de actuación es a 72ºC. -Su concentracion varia entre 1 a 2 unidades de enzima por cada 100µL de reaccion . -No posee la actividad editora o correctora (3` exonucleasa ). Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias termófilas: Pwo Pyrococcus woesei Pfu Pyrococcus furiosus Tli Thermococcus littoralis

14. 4.- Mg ++ (MgCl 2 , MgSO 4 ) Mg ++ es un cofactor de DNA polimerasas. Determinar la [Mg ++ ] óptima es uno de los pasos más importantes en la puesta a punto de una PCR. [Mg ++ ] muy bajas : la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacci ó n. [Mg ++ ] muy altas :favorece amplificaciones inespecificas , afectando la especificidad reacci ón.

15. 5.- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) Provee de nucleotidos (base+ azucar + fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA. Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 µM cada dNTP ). No deben estar en exceso para que los iones Mg ++ no estén formando complejos con los dNTPs.

16. 6.- Buffer y sales Buffer  Mantiene el pH optimo para que la enzima actúe. El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl. pH óptimo para Taq: 8.3 Sales  KCl: contribuye al plegamiento correcto de la enzima.

17. Aditivos adyuvantes Existen una serie de reactivos que pueden contribuir a la reacción de amplificación. Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO) Glicerol

18. Equipos: Termociclador Instrumento programado para cambiar la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra.

19. PCR convencional en el laboratorio

20. 1. Creación del primer Los primer o cebadores (compuestos por oligonucleótidos específicos) son sintetizados químicamente. *Para realizar esta labor se utilizan bases de dato universales y programas computacionales que establecen la secuencia primer para un gen determinado.

21. 2. Extracción de DNA Se extrae el DNA genómico desde la muestra a analizar *Para esto existen Kits comerciales que aseguran:  Alto rendimiento.  Alta pureza.  Gran cantidad de DNA

22. La correcta extracción de DNA o RNA se comprueba mediante la determinación de: Integridad y concentración aproximada de DNA o RNA (electroforesis en gel de agarosa 1%) Relación Ác . Nucleicos/Proteínas (ABS a 260/280 con espectrofotometro )

23. 3. PCR y sus etapas

24. 3.1 Desnaturalización del DNA El DNA molde de doble hebra es desnaturalizado por calor a un t° por encima de su punto de fusión T° inicial del PCR: 95°C por 5 min T° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg .

25. 3.2 Alineamiento/unión del iniciador a la secuencia complementaria Se desciende la t° lo suficiente para que ocurra la hibridación entre los cebadores y el DNA molde. T° ideal: 65°C por 45 seg .

26. 3.3 Extensión/elongación de las cadenas La t° es nuevamente aumentada para favorecer la actividad catalítica de la polimerasa la cual se ha unido al extremo del duplex molde-cebador. T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg . T° Final: 72°C por 10 min.

27. *Amplificación exponencial

28. 4. Detección de resultados La detección del producto del PCR se realiza normalmente mediante una electroforesis. *Electroforesis en gel de agarosa, revelado con rayos UV gracias a la utilización de bromuro de etidio (colorante)

29. Precauciones Contaminación con DNA

30. Controles Control sin molde. Control positivo. Control de primers .

31. Aplicaciones PCR Huella digital genética. Test de paternidad. Detección de enfermedades hereditarias. Comparación de la expresión génica. Clonamiento de genes. Mutagénesis. Análisis de DNA antiguo. Genotipificacion de polimorfismos

32. Bibliografía Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética (Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud), José Luque y Ángel Herráez. Biología molecular y Biotecnología (2da edición), J.M. Walker y E. B. Gingold . 1997