Pruebas bioquimicas para detectar el genero candida

auxonograma
zimograma

1. UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO” PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DEL GENERO C andida INTEGRANTES: DOCENTE: CURSO: SEMESTRE ACADEMICO:   Piedra Alcalde Jefferson Alberto . Rojas Rojas Maicol Sleiter. Msc. Fransk Amarildo Carrasco Solano . Microbiologia General. 2020 – II.

2. IDENTIFICACION BASADA EN METODOS DE ASIMILACION DE NUTRIENTES AUXONOGRAMA CONVENCIONAL: Se fundamenta en la aplicación por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o nitrogenados, sobre un medio sintético base para apreciar el crecimiento selectivo de una levadura en la cercanía de los nutrientes necesarios para su desarrollo. Para su realización pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtración, cilindros de Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapados con el nutriente. Sin embargo, las pruebas de asimilación en medios líquidos no ofrecen ninguna ventaja adicional sobre los medios sólidos, resultando mucho más laboriosas y costosas .

3. MEDIO DE CULTIVO BASE Se prepararan según la técnica habitual y no necesitan ajustar el pH. Se expenden deshidratados como medios base de levaduras. Los más utilizados son los siguientes : MEDIO SIN CARBONO MEDIO SIN NITROGENO Sulfato amónico (5 g/l) Fosfato monopotásico (1 g/l) Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l) Glucosa (20 g/l) Fosfato monopotásico (1 g/l) Sulfato de magnesio (0,5 g/l) Agar (20 g/l).

4. PROCEDIMIENTO 1. La levadura en estudio se siembra previamente en caldo glucosado de Sabouraud más cloranfenicol a 28 °C durante 48 h. 2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como inóculo del medio sintético fundido. Enfriar a 50 °C, mezclar y verter en placa. 3. Preparar las soluciones estériles de los nutrientes, los azúcares al 10% y las sustancias nitrogenadas al 1%. 4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de un tubo de cristal, agujerear 5-6 pocillos por placa. Sobre cada pocillo se vierten dos gotas de los distintos nutrientes en estudio. 5 . se utilizan discos de papel absorbente, deben confeccionarse de distintos colores o rotularse previamente. Una vez esterilizados, y antes de su empleo, se empapan con dos gotas de las soluciones acuosas de los nutrientes (al 20% para los azúcares y al 2% para los substratos nitrogenados). Se secan en estufa y se aplican sobre el medio con pinzas estériles. 6. Incubar a 28 °C. (2-4 días).

5. INTERPRETACION En la zona circulante a los pocillos o los discos, crecen abundantes colonias de levaduras si utilizan el nutriente correspondiente; por el contrario, no aparecen en los contornos de los no utilizados

6. ZIMOGRAMA CONVENCIONAL Esta prueba permite determinar la capacidad de fermentar distintos azúcares, la prueba más importante y al mismo tiempo la más rápida para identificar levaduras. Consiste, en sembrar un medio básico al cual se agrega un glúcido y un indicador de pH. La fermentación se evidencia con la producción de acidez y de gas. MEDIO DE CULTIVO PARA ZIMOGRAMA g/l extracto de levadura, 4.5 peptona, 7.5 púrpura de bromocresol 6%, 2ml 100 ul de una solución al 20% de los siguientes azúcares: glucosa, maltosa, galactosa, lactosa y trehalosa

7. TECNICA 1- Distribuir en tubos de hemólisis con campanitas Durhan , 2ml de medio para zimograma 2- Expulsar el aire colocando los tubos en baño María hasta la ebullición durante unos minutos y dejar enfriar. 3- Sembrar 50 ul de una suspensión de levaduras con opacidad equivalente al tubo Nº3 de Mac Farland . 4- Incubar a 28ºC durante dos semanas.

8. INTERPRETACION La fermentación positiva se observa por la acumulación de gas (CO2) en la campanita y el viraje del indicador del violeta al amarillo.

9. METODOS ENZIMATICOS: Se detectan 2 enzimas: L- prolina aminopeptidasa y βgalactosaminidasa mediante métodos Fluorogenicos y Cromogenicos . Tienen una buena sensibilidad y especificidad. Lectura entre 5 min – 48 hr de incubación . Cromogénicos:   Se trata de medios diseñados para aislar e identificar simultáneamente especies del género Candida, tras 24-48 h de incubación a 35-37ºC.

10. ( CHROMagar)

11. Candida ID (bioMérieux)

12. 3. Albicans ID2 (bioMérieux) 4. Cromogen Albicans (Biomedics): 5. CandiSelect (BioRad):

13. Fluorogénicos: Facilitan la identificación de C. albicans en los cultivos primarios:   Fluroplate Candida (Merck): Agar SDCA-MUAG (Biolife ):