Radioimunoensaio

Aula sobre adioimunoensaio da disciplina Imunologia I

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 Trabalho realizado pela Médica Veterinária MSc Maria Tereza Barreto Guedes sob orientação dos Professores Robert Schaer , Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010. RADIOIMUNOENSAIOS (RIA)

2. CARACTERÍSTICAS GERAIS

3. 1959 Berson e Yalow – primeiro RIA para quantificação de insulina. O RIA foi a primeira técnica imunológica padronizada capaz de detectar e quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas. Torna-se então possível determinar qualquer tipo de molécula biológica, desde que haja um receptor específico e que a molécula biológica possa ser marcada. CARACTERÍSTICAS GERAIS

4. DEFINIÇÃO O termo radioimunoensaio (RIA) é mais empregado em ensaios com antígenos marcados. O termo imunorradiométrico (IRMA) é utilizado em ensaios com anticorpos marcados. CARACTERÍSTICAS GERAIS

5. Apresenta alta sensibilidade que é conferida pela detecção radioativa. O RIA também apresenta elevada especificidade. Graças à sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no líquido biológico. Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor. CARACTERÍSTICAS GERAIS

6. Vantagens Método muito sensível, específico e de alta afinidade. Baixo custo. Requer pouca amostra. Rápido. CARACTERÍSTICAS GERAIS Desvantagens Instabilidade dos radioisótopos. Risco operacional. Necessidades de medidas especiais. Elevado custo de biossegurança e problemas com o descarte de material.

7. Alta sensibilidade → permite dosagem de substâncias não encontradas em concentrações suficientes para serem percebidas por outras técnicas. polipeptídios, catecolaminas, esteróides, antibióticos, hormônios tireoidianos, proteínas, vitaminas, drogas e outras. vírus da hepatite B. marcador tumoral. APLICAÇÕES

8. PRINCÍPIOS

9. Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente. PRINCÍPIO GERAL Componentes Anticorpo radioativo Antígeno radioativo Amostra a ser testada Leitor radiométrico Leitor radiométrico

10. 125 I É o radioisótopo mais comumente empregado. Meia vida de 57,5 dias. Liga-se facilmente aos resíduos de tirosina das proteínas. Produz radiação Υ . Estabilidade menor que 3 H. Dosagem de hormônios protéicos. Trítio ( 3 H) Produz radiação β . Dosagem de esteróides. Carbono 14 CARACTERÍSTICAS DOS MARCADORES

11. TIPOS DE RIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE Ag

12. De competição com Ag marcado. De competição com Ac marcado. Sanduíche ou captura de Ag . Para detecção de IgE : Paper Radioimmunosorbent Test (PRIST). Radioallergosorbent Test (RAST). TIPOS DE RIA

13. Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida. Y Em seguida, adiciona-se o antígeno marcado com 125 I. Uma amostra de soro de um paciente suspeito é então acrescentada. O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos. A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade. DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO Y Y Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo específico

14. Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida. A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente. Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados. Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag / Ac com o Ag do soro. Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos , que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade. DE COMPETIÇÃO COM Ac MARCADO Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo marcado Y Y Y

15. Teste realizado em duas etapas: Primeira etapa: 1) Fixação de Acs não marcados na fase sólida. 4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem para eliminação de componentes não específicos. Segunda etapa: 1) Acrescenta-se um segundo anticorpo específico e marcado, que formará o “sanduíche”. 2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo. SANDUÍCHE OU CAPTURA DE Ag 2) Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos). 3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra. Antígeno do soro Y Ac marcado Y Ac não marcado Componentes não específicos Y Y Y Y

16. TIPOS DE RIA PARA DETECÇÃO DE IgE

17. Anticorpos anti -IgE e não marcados são fixados na fase sólida. Acrescenta-se o soro a ser pesquisado para a presença de IgE. Em caso positivo, haverá a união do anticorpo IgE + anticorpo anti -IgE. Após lavagem para retirada do excesso de Ac não ligado, acrescenta-se anticorpos anti-IgE marcados com isótopo para que haja a revelação da amostra. Após lavagem, procede-se com a leitura. A determinação da concentração de IgE total presente na amostra ocorrerá através de cálculo que relacionará os valores obtidos com uma determinada curva padrão. PAPER RADIOIMMUNOSORBENT TEST (PRIST) Y Ag IgE da amostra Y Ac anti-IgE marcado Y Ac anti-IgE não marcado Y Y Y Y Y Y Y Y Y

18. O alérgeno específico para o Ac IgE pesquisado é previamente fixado ao fundo do tubo na fase sólida. Acrescenta-se soro do paciente. Havendo presença de IgE específica ao alérgeno em questão, haverá a formação do complexo Ag/Ac. Acrescenta-se o anticorpo anti-IgE marcado, e este se liga ao Ac IgE pesquisado. A reação então será revelada através do segundo anticorpo. RADIOALLERGOSORBENT TEST (RAST) Y Y Alérgeno Y IgE do soro do paciente Y Ac anti-IgE marcado Y Y