Separation Processes in Biotechnology First Edition Asenjo

Separation Processes in Biotechnology First Edition Asenjo
Separation Processes in Biotechnology First Edition Asenjo
Separation Processes in Biotechnology First Edition Asenjo

1. Explore the full ebook collection and download it now at textbookfull.com
Separation Processes in Biotechnology First
Edition Asenjo
https://textbookfull.com/product/separation-processes-in-
biotechnology-first-edition-asenjo/
OR CLICK HERE
DOWLOAD EBOOK
Browse and Get More Ebook Downloads Instantly at https://textbookfull.com
Click here to visit textbookfull.com and download textbook now

2. Your digital treasures (PDF, ePub, MOBI) await
Download instantly and pick your perfect format...
Read anywhere, anytime, on any device!
Transport Processes and Separation Technologies J.M.P.Q.
Delgado
https://textbookfull.com/product/transport-processes-and-separation-
technologies-j-m-p-q-delgado/
textbookfull.com
Industrial Separation Processes Fundamentals 2nd Edition
André B. De Haan
https://textbookfull.com/product/industrial-separation-processes-
fundamentals-2nd-edition-andre-b-de-haan/
textbookfull.com
Transport Processes and Separation Process Principles 5th
Edition Christie John Geankoplis
https://textbookfull.com/product/transport-processes-and-separation-
process-principles-5th-edition-christie-john-geankoplis/
textbookfull.com
Novel Catalytic and Separation Processes Based on Ionic
Liquids Dickson Ozokwelu
https://textbookfull.com/product/novel-catalytic-and-separation-
processes-based-on-ionic-liquids-dickson-ozokwelu/
textbookfull.com

3. The Application of Green Solvents in Separation Processes
Francisco Pena-Pereira And Marek Tobiszewski (Eds.)
https://textbookfull.com/product/the-application-of-green-solvents-in-
separation-processes-francisco-pena-pereira-and-marek-tobiszewski-eds/
textbookfull.com
Food Biotechnology First Edition Bhatia
https://textbookfull.com/product/food-biotechnology-first-edition-
bhatia/
textbookfull.com
Chronicle of separation: on deconstruction's disillusioned
love First Edition Ben-Naftali
https://textbookfull.com/product/chronicle-of-separation-on-
deconstructions-disillusioned-love-first-edition-ben-naftali/
textbookfull.com
Extremophiles From Biology to Biotechnology First Edition
Durvasula
https://textbookfull.com/product/extremophiles-from-biology-to-
biotechnology-first-edition-durvasula/
textbookfull.com
Charged aerosol detection for liquid chromatography and
related separation techniques First Edition Gamache
https://textbookfull.com/product/charged-aerosol-detection-for-liquid-
chromatography-and-related-separation-techniques-first-edition-
gamache/
textbookfull.com

6. Separation Processes
in Biotechnology

7. Bioprocess Technology
Series Editor
W. Courtney McGregor
Xoma Corporation
Berkeley, California
Volume 1 Membrane Separations in Biotechnology, edited by
W. Courtney McGregor
Volume 2 Commercial Production of Monoclonal Antibodies:
A Guide for Scale-Up, edited by Sally S. Seaver
Volume 3 Handbook on Anaerobic Fermentations, edited by
Larry E. Erickson and Daniel Yee-Chak Fung
Volume 4 Fermentation Process Development of Industrial
Organisms, edited by Justin O. Neway
Volume 5 Yeast: Biotechnology and Biocatalysis, edited by
Hubert Verachtert and Rene De Mot
Volume 6 Sensors in Bioprocess Control, edited by John
V. Twork and Alexander M. Yacynych
Volume 7 Fundamentals of Protein Biotechnology, edited
by Stanley Stein

8. Volume 8 Yeast Strain Selection, edited by Chandra J.
Panchal
Volume 9 Separation Processes in Biotechnology, edited
by Juan A. Asenjo
Additional Volumes in Preparation
Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology,
edited by Anthony S. Lubiniecki
Extractive Bioconversions, edited by Bo
Mattiasson and Olle Hoist

10. Separation Processes
in Biotechnology
edited by
Juan A. Asenjo
University of Reading
Reading, England
CRC Press
Taylor & Francis Group
Boca Raton London New York
CRC Press is an imprint of the
Taylor & Francis Group, an informa business

11. Published ill 1990 by
CRC Press
Taylor & Francis Group
6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300
Boca Raton, FL 33487-2742
© 1990 by Taylor & Francis Group, LLC
CRC Press is an imprint of Taylor & Francis Group
No claim to original U.S. Government works
Printed in the United States of America on acid-free paper
10 98765432
International Standard Book Number 0-8247-8270-4 (Hardcover)
Library of Congress Card Number 90-3600
This book contains information obtained from authentic and highly regarded sources. Reprinted material is
quoted with permission, and sources are indicated. A wide variety of references are listed. Reasonable efforts
have been made to publish reliable data and information, but the author and the publisher cannot assume
responsibility for the validity of all materials or for the consequences of their use.
No part of this book may be reprinted, reproduced, transmitted, or utilized in any form by any electronic,
mechanical, or other means, now known or hereafter invented, including photocopying, microfilming and
recording, or in any information storage or retrieval system, without written permission from the publishers.
Trademark Notice: Product or corporate names may be trademarks or registered trademarks, and are used only
for identification and explanation without intent to infringe.
Library of Congress Cataloging-in-Publication Data
Separation processes in biotechnology / edited by Juan A. Asenjo.
p. cm. — (Bioprocess technology; v .9)
Includes bibliographical references and index.
ISBN 0-8247-8270-4
1. Biomolecules—Separation. 2. Biotechnology—Technique.
I. Asenjo, Juan A.
TP248.25.S47S45 1990
660' .6—dc20 90-3600
T&Finforma
Visit the Taylor & Francis Web site at
http://www.taylorandfrancis.com
Taylor & Francis Group
is the Academic Division oi'T&F Informa pic.
and the CRC Press Web site at
http://www.crcpress.com

12. Series Introduction
The revolutionary developments in recombinant DNA and hybridoma
technologies that began in the mid-1970s have helped to spawn sev-
eral hundred new business enterprises. Not all these companies
are aimed at producing gene products or cell products, as such.
Many are supportive in nature; that is, they provide contract re-
search, processing equipment, and various other services in support
of companies that actually produce cell products. With time, some
small companies will probably drop out or be absorbed by larger,
more established firms. Others will mature and manufacture their
own product lines. As this evolution takes place, an explosive
synergism among the various industries and the universities will re-
sult in the conversion of laboratory science into industrial process-
ing. Such a movement, necessarily profit driven, will result in
many benefits to humanity.
New bioprocessing techniques will be developed and more con-
ventional ones will be revised because of the influence of the new
biotechnology. As bioprocess technology evolves, there will be a
need to provide substantive documentation of the developments for
those who follow the field. It is expected that the technologies will
continue to develop rapidly, just as the life sciences have developed
rapidly over the past 10—15 years. No single book could cover all
of these developments adequately. Indeed, any single book will be
in need of replacement or revision every few years. Therefore,
our continuing series in this rapidly moving field will document the
growth of bioprocess technology as it happens.
iii

13. iv Series Introduction
The numerous cell products already in the marketplace, and the
others expected to arrive, in most cases come from three types of
bioreactors: (a) classical fermentation; (b) cell culture technology;
and (c) enzyme bioreactors. Common to the production of all cell
products or cell product analogs will be bioprocess control, down-
stream processing (recovery and purification), and bioproduct
finishing and formulation. These major branches of bioprocess tech-
nology will be represented by cornerstone books, even though they
may not appear first. Other subbranches will appear, and over
time, the bioprocess technology "tree" will take shape and continue
growing by natural selection.
W. Courtney McGregor

14. Foreword
The successful reduction-to-industrial-practice of modern biotech-
nology is the ultimate responsibility of the chemical and biochemical
engineering profession. The explosive growth of scientific and com-
mercial activity in the fields of basic and applied life sciences over
the past decade has confronted the practicing chemical/biochemical
engineer with the formidable problem of trying to keep abreast of
developments at the life science laboratory frontier. Undoubtedly
these developments will have an impact on industrial bioprocessing
techniques and methods. Proliferation of the life science and bio-
technology literature has rendered it virtually impossible for even
the most meticulous practitioner to become (and remain) aware of
advances in bioprocessing technology that are of essential importance
to the manufacture of biological products. This book represents one
of the first comprehensive efforts to deal with this critical problem.
University education in chemical engineering, at both the gradu-
ate and undergraduate levels, if it is to be responsive to the grow-
ing need for engineering expertise in industrial biotechnology, must
structure its teaching and research programs to provide insight into
the application of chemical engineering principles to the solution of
applied life science problems. Very few academic institutions around
the world today possess faculties with appropriate training and ex-
perience to organize and institute such programs, or to teach them
effectively. There is, however, a consensus among chemical/bio-
chemical engineering educators that proper preparation for a career
in biotechnology requires awareness by the student that the basic,
classical tools of the chemical engineer are essential to his capacity
to deal competently with bioprocess engineering problems, and that
developing confidence in applying these concepts to real bioprocess-
V

15. vi Foreword
ing operations is central to proper training in this discipline. This
book, with its excellent integration of life science fundamentals,
chemical engineering principles, and the needs and practices of
downstream bioprecessing, will be particularly useful to educators
and students of biotechnology. Of particular importance to both
practicing chemical engineers and chemical engineering educators
will be the attention paid to modern chemical engineering concepts
and their application to bioprocessing: namely, rigorous modeling,
process simulation, process synthesis and optimization, large-scale
equipment design, and process economics.
Increasing numbers of life scientists—particularly those involved
in the biotechnology industry—are beginning to appreciate the impor-
tance of an understanding of the problems and limitations of bio-
product separation and purification in the selection and optimization
of cells and cell-culture methods for the industrial production of
biologicals. The critical role of cross-disciplinary interaction between
life scientists and engineers early in the development of biotechnology
processes is now widely acknowledged by industrial research and
development managers in this field. Thus, there is considerable
pressure building in both industry and academia to provide oppor-
tunities for basic life scientists to familiarize themselves with bio-
process engineering fundamentals. This book should serve a useful
function in providing a broad overview of bioprocess principles and
techniques for life science researchers interested in successful com-
mercialization of the products of their creative efforts.
Dr. Asenjo is to be commended for having enlisted the participa-
tion of a distinguished group of internationally recognized experts
to contribute to this landmark volume, and for having organized its
contents in a rational and readable form. It will serve as a valuable
reference and teaching text for many years to come.
Alan S. Michaels
North Carolina State University
Raleigh, North Carolina

16. Preface
It is accepted today that advances in recovery, separation, and puri-
fication techniques used in bioprocesses will play a crucial role in
the development of large-scale biotechnology. They are the aspects
of bioprocess engineering most in need of attention, in particular for
the production of novel products and proteins. Downstream opera-
tions are crucial stages in terms of maintaining product character-
istics and activity aiming at high yield and purity.
The aim of this book is to be not just a collection of papers or
monographs but an attempt to include in a comprehensive text the
recovery, separation, and purification operations of bioprocess tech-
nology. To achieve this the editorial role has been an active one in
order to avoid duplication and favor comprehensiveness. Individual
chapters emphasize concepts that are, and will be, important in the
development of large-scale versions of techniques that have been
well established at the laboratory level. These concepts lay in the
interface of basic physical biochemistry and biochemical engineering.
This book should encourage the development of new ideas emerging
from this interface between biological scientists and chemical engi-
neers. This volume will be useful to basic biological scientists with
an interest in scale-up, to people doing frontier research in bio-
process separations, to engineers interested in biological processes,
and to those having to design actual downstream separation sequences
and flowsheets in biotechnology, in both industry and academia. It
should also serve as a textbook for graduate students taking ad-
vanced courses or carrying out research in the field.
Individual chapters are comprehensive and contain a balanced
blend of theory, present state of the art, and important and recent
practical applications. At the end of many chapters some problems
vii

17. viii Preface
or exercises which are either numerical or of the essay type have
been included. These will help in clarifying basic concepts and
understanding in order to induce the development of new ideas
necessary to build this emerging area.
This book has been divided into five parts according to the role
of the separation operation in the downstream process. The first
part describes fundamental features of physical, chemical, and bio-
chemical characterization of the product and its contaminants, which
is the first consideration to take into account when deciding on a
downstream processing strategy. It also considers some questions
on rationalizing the separation sequence by choosing a minimum num-
ber of necessary separation operations. The question of optimiza-
tion and process synthesis is covered in more detail in the last part.
Part II concerns the extraction and release of products from the
microbial cells. This is of main concern for heterologous proteins
that microbial cells cannot secrete. It covers more traditional non-
specific operations such as homogenization and bead mill disruption
and recent advances in protein secretion systems, differential prod-
uct release, and membrane permeabilization by enzymatic and chemi-
cal methods which offer the attractive advantage of selectivity.
Part III covers main separation and concentration operations
including ion-exchange processes used for this purpose, membrane
processes, aqueous two-phase extractions, and precipitation. High
resolution ion-exchange chromatography used for purification is
covered in the following section. Filtration and centrifugation, and
liquid-liquid extraction using organic solvents are not discussed in
this section, but have been widely described in the literature and
are fully reviewed in Chapter 19 on processing plants and equipment.
Part IV is on purification operations and has five chapters. Of
the available large-scale protein purification operations, ion-exchange
is probably by far the most widely used one. Affinity chromatogra-
phy, on the other hand, represents the protein purification opera-
tion that most probably has the largest potential for very specialized
proteins as it can be extremely specific and a very high purification
factor can be obtained in one step. Reversed-phase chromatography
(RPC) is largely used for assaying and preparing peptides, always
in the "high pressure" mode (HPLC). Gel filtration is not specifi-
cally reviewed in this section but this operation is widely covered in
the literature (Scopes, 1987; Wiseman, 1986) and is also documented
in Chapter 19. In addition, gel filtration is not particularly suitable
as a large-scale purification operation and is efficient only as an
intermediate desalting operation or for final polishing (Pharmacia,
1983; Asenjo and Patrick, 1990).
Part V covers the more relevant process engineering aspects of
downstream processing (DSP). It begins with a review of recent
developments in process synthesis and design, stressing their poten-

18. Preface ix
tial for biotechnology. It includes an evaluation of rigorous compu-
ter methods in chemical engineering, recent developments in artifi-
cial intelligence (expert systems), and present trends in this ex-
panding field. Recent developments of automation in chromatography
(expert systems for control) are covered in Chapter 18. Chapter
19 is a thorough review of virtually all equipment used in DSP in
biotechnology, not only in the more recent field of protein purifica-
tion but also in the manufacture of Pharmaceuticals, organic acids,
and others. This very comprehensive chapter provides important
information for process design and equipment selection. The final
chapter is on economics. It has two sections. It first discusses
general aspects of the relationship between economic viability and
scale in biotechnology processes and then gives a detailed example
of the economic evaluation of a typical modern biotechnology process.
Juan A. A sen jo
REFERENCES
Asenjo, J. A. and Patrick, I. (1990). Large Scale Protein Purifi-
cation, in Protein Purification Applications: A Practical Ap-
proach , E. Harris and S. Angal (eds.). IRL Press, Oxford.
Pharmacia (1983). Scale up to process chromatography. Guide to
design, Pharmacia, Uppsala, Sweden.
Scopes, R. K. (1987). Protein Purification, 2nd ed., Springer
Verlag, New York.
Wiseman, A. (1986). Handbook of Enzyme Biotechnology, Ellis
Horwood, Chichester

20. Contents
Series Introduction Hi
Foreword (Alan S. Michaels) v
Preface vii
1 Separation Processes
1 Selection of Operations in Separation Processes 3
Juan A. A sen jo
2 Chemical, Physical, and Biochemical Concepts in
Isolation and Purification of Proteins 17
Milton T. W. Hearn and Birger Anspach
II Product Release and Recovery
3 Protein Secretion Systems in Microbial and
Mammalian Cells 67
Donald T. Moir and Jen-l Mao
4 Cell Disruption by Homogenizer 95
Cady R. Engler
5 Bead Mill Disruption 107
Worst Schutte and Maria-Regina Kula
6 Enzymatic Cell Lysis for Product Release 143
Juan A. Asenjo and Barbara A. Andrews
1 Chemical Permeabilization of Cells for
Intracellular Product Release 177
Thomas J. Naglakj David J. Hettwer,
and Henry V. Wang










XI

21. xii Contents
III Concentration and Separation Operations
8 Membrane Systems 209
A. C. Fane and J. M. Radovich
9 Ion-Exchange Processes 263
Charles D. Shuey
10 Aqueous Two-Phase Separations 287
Per-Xke Albertsson, Cote Johansson,
and Folke Tjerneld
11 Precipitation 329
Charles E. Clatz
IV Purification Operations
12 Ion Exchange in Purification 359
Nien-Hwa Linda Wang
13 Process Affinity Chromatography 401
Yannis D, Clonis
14 Reversed-Phase and Hydrophobia
Interaction Chromatography of
Peptides and Proteins 447
Ziad El Rassi, Ann L. Lee, and Csaba Horvath
15 Analysis of Effluent Profiles in Large-
Scale Liquid Chromatography 495
J. Hong
16 Electrically Driven Separation Processes:
Analytical and Preparative Methods 517
Cornelius F. Ivory
V Design of Separation Processes
17 Synthesis of Downstream Processes 571
George J. Prokopakis and Juan A. Asenjo
18 Automation in Protein Purification: The Use of
Expert Systems for Control of Process
Chromatography 603
Andrew C. Kenney
19 Downstream Processing Plant and Equipment 617
M. P. Brocklebank
20 Downstream Process Economics 741
Rajiv Datar and Carl-Custaf Rosen
Index 795

22. Contributors
Juan A. Asenjo Biochemical Engineering Laboratory, University of
Reading, Reading, England
Per-Ake Albertsson Department of Biochemistry, University of Lund,
Lund, Sweden
Barbara A. Andrews Biochemical Engineering Laboratory, Univer-
sity of Reading, Reading, England
Birger Anspach Department of Biochemistry, Monash University,
Clayton, Victoria, Australia
M. P. Brocklebank John Brown Engineers and Constructors Limited,
Portsmouth, England
Yannis D. Clonis Department of Chemistry, University of Patras,
Patras, Greece
Rajiv Qatar"*" Department of Chemical Engineering, Massachusetts
Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts
Cady R. Engler Agricultural Engineering Department, Texas A&M
University, College Station, Texas
A. C. Fane School of Chemical Engineering and Industrial Chemis-
try, University of New South Wales, Kensington, New South Wales,
Australia
Current affiliations:
*Gesellschaft Fur Biotechnologische Forschung, m.b.H., Braun-
schweig, West Germany
'''Scientific and Laboratory Services, Pall Corporation, Glen Cove,
New York
XIII

23. xiv Contributors
Charles E. Glatz Department of Chemical Engineering, Iowa State
University, Ames, Iowa
Milton T. W. Hearn Department of Biochemistry, Monash University,
Clayton, Victoria, Australia
David J. Hettwer Department of Chemical Engineering, Univer-
sity of Michigan, Ann Arbor, Michigan
J. Hong Biochemical Engineering Program, University of California,
Irvine, California
Csaba Horvath Department of Chemical Engineering, Yale University,
New Haven, Connecticut
Cornelius F, Ivory Department of Chemical Engineering, Washington
State University, Pullman, Washington
Cote Johansson Department of Biochemistry, University of Lund,
Lund, Sweden
Andrew C. Kenney Oros Instruments Limited, Slough, Berkshire,
England
Maria-Regina Kula Institut fur Enzymtechnologie, Heinrich-Heine
Universitat, Diisseldorf, Julich, West Germany
Ann L. Lee Department of Chemical Engineering, Yale University,
New Haven, Connecticut
Jen-I Mao Department of Human Genetics, Collaborative Research,
Inc., Bedford, Massachusetts
Donald T. Moir Department of Molecular Biology and Biochemistry,
Collaborative Research, Inc., Bedford, Massachusetts
Thomas J. Naglak Department of Chemical Engineering, University
of Michigan, Ann Arbor, Michigan
George J. Prokppakis Department of Chemical Engineering and
Applied Chemistry, Columbia University, New York, New York
J. M. Radovich Cobe Laboratories, Inc., Lakewood, Colorado
Ziad El Rassi • Department of Chemical Engineering, Yale Univ-
ersity, New Haven, 'Connecticut
Carl-Gustaf Rosen Abitec AB, Bjornlunda, Sweden
Horst SchiJtte Aufaubertungstechnik, GBF, Gesellschaft fur Bio-
technologische Forschung m.b.H., Braunschweig, West Germany
Current affiliation:
*Amgen, Thousand Oaks, California
tMETBA S.A., Athens, Greece
Department of Chemistry, Oklahoma State University, Stillwater,
Oklahoma

24. Contributors xv
Charles D. Shuey BioDesign, Inc., Pasadena, California
Folke Tjerneld Department of Biochemistry, University of Lund,
Lund, Sweden
Henry Y. Wang Department of Chemical Engineering, University of
Michigan, Ann Arbor, Michigan
Nien-Hwa Linda Wang Department of Chemical Engineering, Purdue
University, West Lafayette, Indiana

26. Separation Processes
in Biotechnology

28. I
SEPARATION PROCESSES

30. 1
Selection of Operations in
Separation Processes
JUAN A. ASENJO University of Reading, Reading, England
Separation and purification of a protein from a large-scale fermenta-
tion or cell rupture supernatant is a critical element of modern pro-
cess biotechnology. It represents the major manufacturing cost, and
therefore competitive advantage in production will depend not only
on innovations in molecular biology, immunology, and other areas of
basic biological sciences, but also on innovation and optimization of
separation and downstream processes (Wheelwright, 1987).
The design of a large-scale process to economically purify a pro-
tein, maintaining a high yield, yet obtaining a virtually pure product
while also minimizing the cost, requires three main considerations:
(1) clearly defining the final product objective, (2) characterizing
the starting material, and with these two pieces of information in hand
(3) defining possible separation steps and constraints regarding the
protein product, operations, and conditions to be used (Asenjo, 1988).
The aim of this chapter is to analyze and discuss the main criteria
used to select separation and purification steps on a rational basis.
I. DEFINING FINAL PRODUCT
At this stage it is necessary to have information on or (if this is not
the case) to be able to define the final product to be obtained and
its uses. What is the product going to be and how is it going to be
used (if therapeutic, for humans or animals, how large doses, how
many, how often)? Questions regarding the purity required are vital
(e.g., 99%, 99.9%, or 99.98%), as well as allowable ranges of impurity
concentrations. With therapeutic and recombinant proteins any impuri-
ties have to be minimized, whereas for the production of bulk indus-
3

31. H A sen jo
trial enzymes this is not the case. For instance, in vaccine produc-
tion it is necessary to remove all traces of unwanted immunogens to
prevent potentially catastrophic immunological side reactions. Experi-
ence with fetal calf serum contamination of therapeutic proteins has
given rise to a consensus that levels of contaminating protein of
around 100 ppm should be acceptable from the product safety point
of view (Cartwright, 1987). The major perceived hazard appears to
be the persistence of nucleic acids with oncogenic potential. State-
of-the-art assays (Cartwright, 1987) will allow detection of around
10 pg of nucleic acids, and it is generally agreed that final product
contamination should not exceed 10 pg/dose. Common contaminants
that will have side reactions even if present in very small amounts
are pyrogens that mainly originate from bacterial cell walls. For
these, in vivo testing using established methods is necessary; hence
on-line control of such processes is very difficult to achieve.
II. CHARACTERIZATION OF STARTING MATERIAL
Probably the most crucial elements that will affect large-scale process
design are the physical, chemical, and biochemical properties of the
contaminating materials in the original broth and those of the protein
that will constitute the final product. The properties of the starting
material will be partly determined by its fermentation source, viz.,
bacterial, yeast, or mammalian cell, the type of cultivation medium
used (e.g., presence of albumin, calf serum, proteases, solid bodies
like whole cells or cell debris), the length of the fermentation, and
whether the product is intracellular or extracellular. To these factors
we must add the actual physicochemical properties of the product
(surface charge/titration curve, biospecificity toward certain ligands,
surface hydrophobicity, M.W., pi, stability) as compared to those of
the contaminant components in the crude broth. The stability of the
final product is also of utmost importance as this will affect the types
of operations that can be used as well as the conditions and process-
ing times that can be afforded.
III. SELECTION OF SEPARATION SEQUENCE
The next stage is to define realistic separation steps on the basis of
all the information provided in Sections I and II. The following five
main heuristics or rules of thumb, which are discussed in some detail
in Chapter 17, provide a good basis for process selection:
Rule 1: Choose separation processes based on different physical,
chemical, or biochemical properties.
Rule 2: Separate the most plentiful impurities first.

32. Selection of Operations 5
Rule 3: Choose those processes that will exploit the differences in
the physicochemical properties of the product and impurities
in the most efficient manner.
Rule 4: Use a high-resolution step as soon as possible.
Rule 5: Do the most arduous step last.
IV. PURIFICATION PROCESS AND UNIT OPERATIONS
The number of necessary steps in a large-scale protein purification
procedure is usually not more than four or five and they can be
divided into two main subprocesses, protein recovery and protein
purification:
Protein recovery
1. Cell separation
2. Cell disruption and debris separation (for intracellular proteins
only)
3. Concentration
Protein purification
4. Pretreatment or primary isolation
5. High-resolution purification
6. Polishing of final product
It is important to bear in mind that, as noted above, there will
be interactions between the fermentation system and conditions and
protein recovery; hence, production methods used will affect the
later purification steps. Such interactions have been discussed in
some detail (e.g., Wang, 1983; Fish and Lilly, 1984; Cartwright,
1987). It is important, then, to consider the process of fermentation
and downstream processing as a single system so that, for example,
the effect of decisions about the fermentation conditions on subsequent
purification stages is made clear. Product concentration will partly
depend on the reactor system used. The presence of nucleic acids
and proteases as well as bacterial contamination must be minimized,
which results in a need for rapid processing. The presence of calf
serum will probably increase the number of purification stages re-
quired. Recombinant proteins are in many cases present in particles
that need to be solubilized and refolded (Chapter 7). In conclusion,
not only is it important to discuss the upstream processing in the
light of all the protein purification stages, but also to make the
necessary decisions to improve the recovery of the protein product
early in the process development stages.
The two subprocesses of recovery and purification are discussed
in more detail below.

33. 6 Asenjo
V. PROTEIN RECOVERY
Recovery comprises taking the broth out of the biochemical reactor
system (e.g., a fermenter, a hollow fiber reactor) and processing it
until a cell-free solution is obtained in which the total protein con-
centration including the product is around 60 to 70 g/liter (Asenjo
et al., 1989; Pharmacia, 1983).
Cell separation or harvesting is always required. The variety
of equipment found in industrial practice is not very large (centri-
fuge, rotary vacuum filter, membrane filtration) and the decision
depends on the microbial source, equipment availability, equipment
efficiency, and economics. If the product of interest is secreted
(extracellular), then the liquid part is kept (Fig. 1); if the product
is intracellular, the solid fraction of the harvesting is kept (Fig. 2).
When a mammalian cell culture is used, the product is usually extra-
cellular. Typical harvesting operations used are centrifugation
(mainly for yeast, but also for mammalian cells and bacteria), rotary
vacuum filtration (mainly for fungi), and microporous filtration (for
bacteria, yeast, mammalian cells, and also fungi).
Cell disruption is required when the product is intracellular.
The equipment is selected mainly on the basis of the microbial source,
as each type of microbe presents particular resistance to disruption.
The choice of disruption technique determines the size of the resulting
debris, which in turn has an influence on subsequent operations.
Typical operations used are pressure homogenization (most bacteria
including Escherichia coli and yeast) and bead milling (gram-positive
bacteria and specific yeast applications). Mechanical disruption
releases nucleic acids which need to be precipitated. There is
Figure 1 Recovery subprocess of extracellular product (yeast,
mammalian, bacterial).

34. Another Random Document on
Scribd Without Any Related Topics

35. TOINEN LUKU
Oli syyskuun päivä vuonna 1787.
Haugen talossa oli kaikki vilja kuhilailla ja rakennusten lähellä
oleva oli jo ajettu taloon. Karja kävi syömässä äpärettä vainiolla,
Anne, talon tytär, istui kivellä pellon aitauksen edessä ja kutoi
sukkaa. Muuta väkeä ei ollut näkyvissä; nyt oli päivällislevon aika.
Aurinko paistoi lämpimästi siniseltä taivaalta; ilmassa tuntui
hiljainen länsituulen leyhäys.
Kivellä istuva tyttö hyräili hiljalleen siinä istuessaan ja kutoessaan;
hän katsoi tuon tuostakin karjaan päin ja hyräili taasen. Hän oli ehkä
noin seitsemäntoista vuotias.
Aitan yliseltä, jonka ovi oli auki, kuului höylän sihahtavaa ääntä.
Siellä joku työskenteli ahkerasti. Toisinaan työ seisahtui, mutta sitten
kuuluivat sihahtelevat äänet taasen päivällishetken hiljaisuudessa.
Kivellä istuva tyttö tähysteli tuonne ylös nähdäkseen jonkun;
mutta sisälläolija jatkoi työtään uutterasti eikä ketään näkynyt ylisen
ovella.

36. Työntekijä tuolla ylisellä oli Hans, Annen nuorin veli, joka valmisteli
pappi Hammerin tilaamaa säilikköä. Sen piti olla valmis kahdeksan
päivän kuluessa eilisestä lukien ja poika teki vankasti työtä kaikkina
joutoaikoina.
Hans Nielsen oli kohta aikuinen mies ja kävi kuuttatoista;
kuukauden lopulla oli hänen määrä päästä ripille.
Hän ja sisar olivat paljon yhdessä ja keskustelivat usein
kaikenlaatuisista asioista, sillä toveriensa parissa ei Hans Nielsen
Hauge oikein viihtynyt eikä häntä liioin haluttanut yhtyä heidän
vallattomiin kepposiinsa. Häntä kutsuttiinkin "lukijaksi", mutta hän ei
ryhtynyt vastaamaan eikä puolustautumaan muulla tavoin kuin että
hän tuon tuostakin saattoi sanoa: "ellet tee pahempaa kuin luet, niin
pääset kyllä eteenpäin."
Silloin pojat naureskelivat ja heidän mielestään hän oli
kummallinen. "Sinähän luet kohta järjen päästäsi", sanoivat he silloin
useinkin; mutta koskaan eivät he häntä lyöneet, sillä hänellä oli
sellaiset kummalliset, lempeät silmät, eikä hän koskaan lyönyt
takaisin. Sen lisäksi hänellä oli rahoja, joita hän oli erilaisilla
hommillaan ansainnut. Sillä Hans Nielsen osasi käyttää sekä veistä
että kirvestä; tarpeen sattuessa teki hän sepän työtäkin.
— — —
Jopa loppui höylääminen tuolla ylisellä. Nuorukainen astui sieltä
ulos, seisahtui ylisen portaille ja vilkasi ympärilleen.
Sitten astui hän hiljalleen alas ja astui sisartaan kohti.
Tulija oli Hans.

37. Hän seisahtui sisarensa eteen kädet selän takana ja katseli häntä.
Hans käveli aina kädet selän takana, kuten isoisä Ole Hansen Hauge
oli tehnyt, aina lapsesta saakka.
Sisar katseli häntä jatkaen kutomistaan.
"Saatko valmiiksi?" kysyi hän.
Hans hymyili.
"Niinpä luulen", vastasi hän. "Muuten täytyy käyttää öitä lisäksi."
Sisar hymyili, hänkin.
"Niinpä niin, Hans rakas", sanoi hän ja vilkasi samalla karjaan
päin.
"Täytyy pitää, minkä on luvannut", sanoi Hans kuin itsekseen.
"Aivan niin, silloin kun se on oikein", vastasi sisar. Hans seisoi ja
mietti hetkisen. "Onko siinä jotakin hullusti?" kysyi hän äkkiä. Sisar
loi silmänsä alas.
"Sinun sopisi ehkä lahjoittaa se säilikkö papille", sanoi hän — aivan
kuin kokeeksi.
Hans seisoi siinä hetken aikaa. Hänen viisaat silmänsä sinertivät ja
välähtivät.
"Työmies on palkkansa ansainnut", sanoi hän vihdoin.
Sisar Anne oli kauan vaiti.

38. "Ehkäpä asianlaita on niin", vastasi hän, katseli käsiinsä ja kutoi
edelleen.
"Ei sinun pidä riihtä puivan härän suuta kiinni sitoa" — sanoi
taasen Hans.
Silloin purskahti Anne iloiseen nauruun.
"Oletko sinä härkä, sinä Hans?" kysäsi hän.
Hans meni suoraan häntä kohden, otti häntä kaulasta ja ravisteli
vähäisen.
Sisar hymyili.
Sitten istahti Hans hänen viereensä.
"Sinä et ymmärrä kauppaa", sanoi hän ja sylkäsi.
Sisar ei vastannut; hän kutoi vaan edelleen sukkaa, mutta tuo
ystävällinen hymyily pysyi suupielessä.
"Sinusta, Hans, tuleekin ehkä kauppias?" sanoi hän hetkisen
kuluttua.
Hans istui ja hypisteli heinän kortta.
"Ei ihmisen sovi kaivaa leiviskäänsä maahan", vastasi hän sitten.
Sisar mietiskeli.
"Paljonko saat säiliköstä?" kysyi hän katsahtamatta ylös. "Kaksi
taaleria." Vallitsi hiljaisuus.

39. "Papilla on varoja kyllin", ilmoitti Hans. Silloin katsahti sisar
häneen.
"Sekö sitten on sitä, mitä sanotaan kaupaksi?" sanoi hän. Nyt oli
Hansin vuoro olla vaiti, ja hän vaikenikin kauan. Vihdoin hän nousi.
"Kuule, Anne", sanoi hän vaimentuneena. "Ehkäpä minä lopetan
tuon säilikön teon." Anne hymyili.
"Älä lopeta, sinä olet sen luvannut", sanoi hän. "Ja kyllä sinun on
se saatava valmiiksi."
Hans Nielsen Hauge seisoi tuokion. Sitten meni verkalleen takaisin
latoon ja ylös yliselle.
* * * * *
Haugen pohjoispuolista tietä tuli muuan mies käyden. Takki oli
repaleinen; hänellä oli tumman ruskea, kulunut hattu päässään ja
kankaaseen käärittyä viulua kantoi hän selässään. Mies oli nuori —
hän oli ehkä viiden, kuudenkolmatta vuotias; silmät olivat tummat
kuin mustalaisella. Tukka oli pörröinen ja mustanruskea.
Saavuttuaan aitauksen luo, missä Haugen karja oli laitumella,
seisahtui hän, istuutui tien vieressä olevalle kivelle, otti viulumytyn
selästään, otti esille vähän leipää ja voirasian ja rupesi syömään.
Mies oli Kristen Gleng, kylä-soittaja, joka oli matkalla kylän kautta.
Kristen Gleng oli kuuluisa Tunessa ja muissakin pikkupitäjissä.
Milloin oli hän Sannesundissa, milloin Glemmingessä, ja kaikkialle,
mihin hän saapui, tuli iloa ja elämää. Sillä tästä Kristenistä mainittiin,
että hän oli yhtä sukkela soittamaan suutaan kuin viuluaankin; sitä

40. paitsi piti hän myös kaupan kaikenlaatuisia pikkutavaroita, kuten
veitsiä, esiliinoja, solkia, nappia y.m. nuoren kansan koristuksia ja
tarpeita.
Kristen Gleng istui kauan rauhassa ja söi. Anne Hauge, joka nyt
seisoi keskellä vainiota karjan luona, oli nähnyt hänen tulevan ja
ihmetellyt; nyt hän yhtä mittaa tähysteli sinnepäin.
Oli vielä päivällislevon aika eikä mitään muuta ääntä kuulunut kuin
höyläämistä yliseltä, jossa Hans rakenteli säilikköä.
Anne Hauge sovitti siten, että hän siirtyi karjan mukana, yhä
enemmän aitaa kohden.
Hän tahtoi vihdoinkin tietää, mikä kummallinen mies tuo oli, joka
asettui tuohon tien viereen eikä lähtenyt edelleen.
Kulkihan tuota tietä ihmisiä, mutta ne tulivat mielellään sisälle
pyytämään ruokaa tahi sitten jatkoivat matkaansa, mutta tämä jäi
tuohon istumaan.
Nyt nousi mies ylös ja silloin Anne tunsi hänet; sehän olikin Kristen
Gleng — soittoniekka. Nyt hän taas istuutui.
Anne kääntyi hiljalleen ja asteli verkalleen vainiolla karjan keskelle.
— — —
Keskellä lämmintä syksyisen puolipäivän hiljaisuutta kaikui
yksinäinen sävel. Ensin muutamia salaperäisiä näppäyksiä — sitten
kummallisen raju sävel.
Kristen soittoniekka oli ruvennut soittamaan.

41. Lehmät nostivat päitään ja kuuntelivat; Anne Hauge kääntyi ja
seisoi aivan liikkumatta.
Koskena kaikuivat säveleet ilman halki; ne sulautuivat
päivänpaisteen ja vapaan sinisen taivaan kanssa yhdeksi; ne
kaikuivat syksyn hienohenkäyksisen pohjatuulen lävitse ja
kantautuivat salaperäisinä etäisyyteen.
Kypsyvästä viljasta ja äpäreheinästä lähtevä vilpoisa tuoksu tuntui
sävelten lomassa melkein voimakkaammalta. Tuossa seisoessaan
Anne Haugea rupesi kuin itkettämään ja kuitenkin niin omituisesti
soitto kiinnitti hänen mieltään. Se oli synnin himoa; se oli paholaisen
kiusausta maailmalliseen mieleen ja menoon!
Rajummin ja yhä rajummin kaikuivat säveleet tuolta aitauksen
vierestä. Soittajan silmät tummenivat; säveleet nousivat kuin
maasta.
Silloin seisoi veli Hans ylisen sillalla. Hänellä oli kädet selän takana
ja hän katseli vakavana tielle päin.
Sitten tuli hän hitaasti kävellen alas yliseltä vainion lävitse sinne,
missä sisar seisoi.
"Mikä mies se tuo on?" kysyi hän.
Sisar loi silmänsä alas.
"No, sehän on Kristen Gleng" vastasi hän hiljaisesti.
Hans Nielsen seisoi ja kuunteli. Hän vilkaisi tavan takaa mieheen
ja kääntyi sitten sisareensa päin.

42. "On muutamia tuollaisiakin", sanoi hän.
Sisar pudisti päätään.
"Onpa niitä paljonkin", sanoi hän.
Soitto lakkasi. Kristen Gleng nousi ylös, näki nuo molemmat ja
seisoi nojautuneena aitaa vastaan.
"Hoi!" huusi hän heihin päin.
Anne Hauge kääntyi ja meni verkalleen loitommaksi vainiolle.
Hans jäi seisomaan ja katsomaan. "Hoi!" huudettiin taaskin.
Sitten Gleng istuutui aidan taakse. Hetkisen kuluttua alkoi kuulua
vilkasta tanssisoittoa.
Välähtipä Hans Nielsenin silmissä kuin vihan kipinä. Hän näki
karjan seisovan ja kääntävän päitään viulun soittoa kohden; Annekin
oli kääntynyt tuolla kauempana vainiolla.
Hans meni kädet selän takana hitaasti soittajaa kohden ja
seisahtui varsin lähelle aitaa.
Kristen Gleng ei kohottanut katsettaan. Hän istui viulu leuan alla,
pää vinossa ja vasen kyynärpää polveen nojautuneena. Hän soitti
silmät ummessa niin että humisi ja raikui. Ruskettuneissa,
ahavoituneissa kasvoissa näkyivät soiton vivahdukset; suupielissä
näkyi pieni vavahdus aina kun viulun käyrä sattui kieliin.
Äkkiä hän siinä istuessaan kääntyi.
"Tanssippa nyt, Hans", huusi hän yhä soitellen.

43. Hans Hauge tuli suoraan hänen luokseen.
"Saatpa lopettaa soittosi", sanoi hän päättävästi. "On parhaillaan
ruokalevon aika."
Kristen Gleng laski alas viulunsa.
"Olethan sinä jalkeilla ja sisaresi myös", vastasi hän.
Hans Hauge seisoi vakavana.
"Me olemme hiljaa", sanoi hän.
Kristen Gleng oli vaiti ja näppäili viulun kieliä.
"Sinäpä et ehkä kärsi viulua?" kysyi hän ja vilkasi sivuttain Hansiin.
Hans ei vastannut.
"Sinäpä et taida tanssiakaan?"
"En, sitä en tee."
Silloin Kristen Gleng nauroi.
"Vasikkakin tanssii. Voi peeveli kuinka vasikka sentään tanssiikin",
sanoi hän viuluaan näppäillen.
Hans Hauge seisoi siinä suuttuneena.
"Enhän minä ole elukka", sanoi hän.
"Helkkarin varmasti sinä olet vasikka", vastasi Kristen Gleng. Sitten
hän taaskin nauroi.

44. Hans Hauge vaikeni hetkiseksi.
"Sinä olet paha kiroilemaan", sanoi hän sitten. "Onko se sinusta
oikein?"
Kristen Gleng nauraa hohotti.
"Minä olen paha kaikkeen", sanoi hän. Sitten kääräsi hän riepuja
viulun ympäri ja syleili sitä.
"Tässä on minun heilani", sanoi hän.
Hans Nielsen kääntyi lähteäkseen pois.
Silloin nousi Kristen Gleng seisomaan.
"Älähän hätäile!" huudahti hän. "Teehän kauppaa kanssani ensin."
Hans Nielsen seisahtui ja epäröi.
Hän katseli laukkua, jonka soittoniekka nyt nosti aidalle ja aukaisi.
Siellä oli veitsiä, esiliinoja ja solkia, jotka auringossa välähtelivät.
Hans Hauge meni lähelle. Ehkäpä hän ostaisi jotakin — ja möisi
sen sitten sopivassa tilaisuudessa, jos hän nyt saisi hyvällä kaupalla.
Hän kyseli hintoja.
Kristen Gleng ilmoitteli hinnat. Silloin Hans Hauge kääntyi ja teki
lähtöä.
"Älähän nyt; odotappas vähän!" huudahti Kristen Gleng taasen.
"Kaksitoista veitsestä, neljä soljesta ja kahdeksantoista esiliinasta

45. morsiamellesi — jos ostat ne kaikki", sanoi hän.
Hans Hauge kääntyi ja kääntyi taas menemään. Hän katseli
tarkasti noita kolmea esinettä.
"Taalari kaikesta", sanoi hän.
"Hyi helvettiä", sanoi Kristen soittoniekka.
Hans Hangen silmät kävivät vakaviksi.
"Jos sinä kiroilet, niin minä en osta", sanoi hän sävyisästi.
Kristen soittoniekka pyyhki suutaan.
"Sinun ei pidä kiroilla", sanoi hän.
Hans Hauge seisoi hetkisen.
"Tahdotko taalarin?" kysyi hän.
Kristen Gleng hymyili.
"Mielelläni kaksikin", vastasi hän. Hänen tummanruskeista
silmistään loisti veitikkamaisuus.
Hans Nielsen ei vastannut, hän ei edes hymyillyt; sivelipä vaan
takkinsa taskua ja otti esille vanhan nahkakukkaron. Hän kaiveli
varovasti rahoja ja sai vihdoin esiin taalarin.
"Täsmällinen raha", sanoi hän. Kristen Gleng sylkäsi.
"No olkoon menneeksi", sanoi hän. "Mutta minun täytyy saada
kaupantekijäisiä."

46. Hans Hauge otti veitsen, soljen ja esiliinan ja antoi Kristenille
taalarin.
Sitten pisti hän tavarat taskuunsa.
"Saat maitoa", sanoi hän.
Silloin Kristen Gleng hymyili.
"Maitoa — enhän minä ole vasikka", vastasi hän.
Hans Hauge nauroi.
"No vettä sitten", sanoi hän.
"Vettä — enhän minä lehmäkään ole!" sanoi Kristen Gleng. "Viinaa
minä tahdon."
Hän pyyhki suutaan.
"Viinaa", vastasi Hans Hauge. "Ethän sinä sikakaan ole."
Kristen Gleng hymyili ja pisti taalarin taskuunsa.
"Sinäpä Hans olet kummallinen", sanoi hän. Hän veti laukun
hihnat kiinni, sitoi viulun laukun kylkeen ja asetti koko kantamuksen
sitten selkäänsä.
Hans Hauge seisoi ja katseli.
"Mihinkä sinä nyt lähdet?" kysyi hän.
Kristen Gleng niisti itsensä.

47. "Huutokauppaan Glemmingiin", vastasi hän. "Siellä teen kauppoja
— on tyttöjä — saan viinaa — on tanssit!"
Hän sovitteli laukun paremmin hartioilleen ja lähti.
Hans katseli hänen jälkeensä, kääntyi sitten ja meni talon
rakennuksia kohden.
Kun hän saapui aitan luo, oli isä pihalla.
"Mikä otus se oli?" sanoi hän.
Poika loi katseensa alas.
"Se oli Kristen Gleng", vastasi hän hiljaisesti.
Isä seisoi vakavana.
"Mitä sinulla on hänen kanssaan tekemistä?"
Hans nosti katseensa; hän punastui.
"Ostin yhtä ja toista", sanoi hän masentuneena.
Isä vaikeni.
"Tein hyvän kaupan", lisäsi Hans.
Isä vaikeni edelleen.
"Sinä valmistut Herran ehtoolliselle kahden viikon kuluttua", sanoi
hän kummallisen lempeällä äänellä.
Poika ei vastannut; kumpikin lähti omalle taholleen.

48. Mutta kun Hans Hauge oli saapunut yliselle ja tiesi olevansa yksin,
otti hän ostamansa tavarat esille ja pani ne höyläpenkin alla olevaan
työkalulaatikkoon aivan alimmaisiksi. Tuntui siltä kuin hän ei enää
olisi tahtonut olla niiden kanssa missään tekemisissä. Ja myöhemmin
illalla makasi hän kynttilä sytytettynä ja luki ja tutki.
Ehkäpä ostaminen ja myyminen onkin paholaisen juonia. Ehkäpä
se onkin koron kiskomista veljeltään, ja ehkäpä se, joka niin tekee,
ei perikään Jumalan valtakuntaa?
* * * * *
Tietä myöten, joka johti Tunen pappilaan, missä pitäjän esipappi
Seeberg asui päärakennuksessa ja kappalainen Hammer puutarhan
toisella puolella olevassa rakennuksessa, tuli joku rattailla ajaen.
Hevonen oli ruskea, sen häntä oli sidottu solmuun; puolikasvuinen
poika siinä ajeli.
Se oli Hans Hauge, Niels Mikkelsenin poika, joka kuljetti papin
säilikköä.
Molemmat papit astelivat edestakaisin puutarhassa piippujaan
poltellen ajomiehen seisahtuessa portille.
Vieno tupakan tuoksu levisi syysilmaan; kahleissa oleva koira
haukahteli varovaisesti kopissaan. Muutamat kellertävän ruskeat
kanat ja kullanpunertava kukko kuljeskelivat marjapensaitten ja
omenia täynnä olevien puitten välissä.
Esipappi Seeberg vilkasi tulijaan.
"Onhan tosin niinkin, rakas veliseni", sanoi hän keskustelua
jatkaen, "mutta hyvät työt eivät kuitenkaan tee autuaaksi, vaan usko

49. yksin."
Kappalainen Hammer otti piipun imukkeen hetkiseksi suustaan.
"Verbaliter dictu on teidän kunnia-arvoisuutenne oikeassa", sanoi
hän; "mutta realiter on kuitenkin usko ilman töitä kuollut."
Hän seisahtui nyt katselemaan tulijaa.
Molemmat papit jäivät seisomaan.
"Mitä haluatte?" huusi esipappi Seeberg, kun Hans Nielsen aukaisi
portin ajaakseen sisälle. "No, jopa näen, sehän on ystäväni Hans
Nielsen, joka tuo säilikköämme."
Molemmat papit menivät lähemmäksi.
Hans Nielsen Hauge tervehti ja ajoi kartanolle. Sitten veti hän
portin kiinni.
"Sepä kävi nopeasti, poikaseni", sanoi Hammer. "Olet jo saanut
valmiiksi!"
Kaikki kolme seisoivat ja katselivat säilikköä.
Esipappi Seeberg meni lähemmäksi. Hän katseli esinettä tarkasti ja
kääntyi sitten kappalaisen puoleen.
"Totisesti on pieni koululaiseni myöskin puuseppä", sanoi hän. "Ja
minä kun odotin hänestä pappia."
Kappalainen hymyili.
"Tämäpä osaa kirjansa", sanoi hän ja taputteli poikasta olalle.

50. Sitten meni hän lähemmäksi ja koetteli tuon valkoisen honkaisen
säilikön lukkoja ja vetimiä.
"Kuka nämät on takonut?" kysyi hän.
Hans Nielsen vilkasi pappiin.
"Minä", vastasi hän hiljaisesti.
Molemmat papit vetelivät oivalliset savut piipuistaan.
"Katsopas!" huudahti Seeberg; "sinähän olet seppäkin."
Hans Nielsen naurahti.
"Vieläkö mitä", sanoi hän.
Esipappi Seeberg kääntyi vielä katselemaan säilikköä. Hän poltteli
piippuaan kiihkeästi ja meni taasen lähemmäksi.
"Jopa jotakin", sanoi hän. "Sinullapa totisesti on taipumusta
käsitöihin!"
Kappalainen kääntyi Hans Haugen puoleen, joka seisoi ohjakset
kädessä.
"Hyvin tehty", sanoi hän. Sitten otti hän piipun suustaan.
"Mitä tämä koreus nyt maksaa?" kysyi hän. Hans Nielsen katsahti
kysyjään. "Kaksi taalaria", vastasi hän. Silloinpa esipappi Seeberg
hymyili. "Sinäpä olet lisäksi kauppamieskin", sanoi hän. Hans Nielsen
punastui.

51. "Kaksi taalaahan oli puhe", vastasi hän hiljaisesti. Kappalainen
Hammer poltteli, nosteli piippuaan ja poltteli taaskin.
"Niinkö minä sanoin?" virkkoi hän hymyillen. "Puolitoista riittänee,
ystäväiseni", sanoi nyt esipappi Seeberg.
"Ei pidä vaatia liikaa."
Hans Hauge katseli alaspäin.
"Pastori antakoon mitä tahtoo", sanoi hän.
Esipappi Seeberg iski silmää virkatoverilleen.
"Taalari olisi kylläksi", sanoi hän; "mutta kun hän on niin kätevä
sekä puusepän että sepän töissä, niin tulee hänen saada puolitoista."
Kappalainen Hammer nyökäytti päätään tyytyväisenä. "Ajahan
säilikkö asunnolleni ja kanna se sisälle", sanoi hän, "ja tule sitten
tänne saamaan rahasi."
Hans Nielsen teki kuten käskettiin ja molemmat papit jatkoivat
keskeytymättä kävelyään puutarhassa.
"Kuten teidän korkea-arvoisuudellenne jo huomautin", sanoi
Hammer ja pani tupakkaa piippuun nahkakukkarosta, "niin on
realiter usko ilman töitä kuollut. Tosin on niin, ettei ilman uskoa
voida vastaan ottaa lunastusta; mutta usko on kuitenkin ainoastaan
se käsi, jolla me vastaan otamme Kaitselmuksen armon; siinä
eläminen ja siitä onnen saavuttaminen, se riippuu ihmisestä
itsestään."
Esipappi Seeberg puhalteli savuja ahkerasti.

52. "Siinä te totisesti suuresti erehdytte", vastasi hän kiihtyneesti;
"totinen onni riippuu yksinomaan uskon antautumisesta Jumalalle ja
siitä kasvavasta ilosta. Ilman uskoa eivät parhaatkaan työmme
merkitse mitään."
"Aivan niin", sanoi Hammer, "mutta —"
Samalla palasi Hans Hauge rattaineen takaisin ja seisoi nyt
odotellen.
"Aivan niin" — Hammer katseli poikasta ja otti verkalleen esiin
rahapussinsa.
"Niinpä niin, mutta — tulehan nyt tänne!" Hän viittasi Hans
Nielsenille, joka heitti ohjakset ja lähestyi verkalleen.
"No, niin" — jatkoi Hammer piippu hampaissa. — "Yksi taalari
kaksitoista killinkiä — tee hyvin poikaseni."
Hän nyökäytti päätään. Hans Hauge tarttui hattuunsa.
"Monet kiitokset pastorille", sanoi hän.
"Eipä kestä kiittää." Kappalainen puristi kättä, esipappi Seeberg
samoin. Sitten ajoi Hans Nielsen verkalleen ulos pappilan portista ja
sulki varovasti portin.
"Aivan niin", jatkoi nyt kappalainen, "mutta sanoohan Kristus itse
vuorisaarnassaan ettei kukaan tule taivaan valtakuntaan, ellei hän
täytä jokaista lain kirjainta — item —"
"Seeberg!" huusi esipapin rouva, joka seisoi portailla. — "Ruoka on
valmista. Eikö herra kappalainenkin haluaisi tänään syödä

53. kanssamme; meillä on pieni lampaan paisti ja tuoreita kurkkuja!"
"Kiitos — kunnioittava kiitos!" vastasi kappalainen. Molemmat
papit ottivat piiput suustaan ja astuivat sisälle.
"Item", jatkoi Hammer portailla — "item näyttää olevan terveen
järjen mukaista, että —"
"Järkemme on luonnostaan sumentunut", keskeytti esipappi
Seeberg; "ainoastaan se valo, minkä me sanasta saamme — —" nyt
ovi sulkeutui heidän jälessään.
Ja pappilan kullanpunertava kukko marssi, kanat ympärillään,
vakavana portaitten ohitse, löysi jyvän ja kutsui kotkottain kanat
ympärilleen. Sitten se lauloi.
Lampaan paistin ääressä siirtyi keskustelu siihen oliko Kingon
virsikirjaa pidettävä evankeelista virsikirjaa parempana.
Mutta kun Hans Nielsen Hauge oli ehtinyt kotiin, möi hän
seuraavana päivänä veitsen ja soljen, minkä hän oli Kristen Glengiltä
ostanut, kahdesta taalarista muutamalle naapuritalon miehelle;
hänestä tuntui kuin olisi hän ollut oikeutettu voittamaan heiltä sen,
mitä hän oli pappiin nähden hävinnyt.

54. KOLMAS LUKU
Tunen kirkossa laskettiin rippilapsia Herran ehtoolliselle.
Vanhat kirkonkellot soivat juhlallisen surumielisesti; syysaurinko
paistoi kellastuneeseen maahan. Vilja oli kuhilailla: koivumetsän
kullankeltaiset lehdet lepäsivät jo mättäillä ja kivikolla; haapa värisi
tulipunertavana ja kellertävänä länsituulessa; pihlaja oli kuin
veripunainen liekki lehtimetsän moninaisten muitten kalvenneitten
puitten keskellä.
Kaikista taloista tuli juhlapukuista kansaa jalan tahi rattain.
Vanhempaansa seuraamia rippilapsia uusissa puvuissaan;
vanhempaa kansaa ontuen ja käyden, ukkoja keppi kädessä tahi
kädet selän takana, vaimoja virsikirjat punaisiin nenäliinoihin
käärittyinä.
Niels Mikkelsen Hauge seisoi pihalla kirkkopuvussaan ja odotteli.
Naisväki tuli myöhään valmiiksi; rippilapsi myöskin vielä viipyi.
Hän oli vielä kamarissaan, jossa sisar Anne auttoi häntä
pukemisessa.

55. Mieluimmin olisi hän tapansa mukaan mennyt ilman mitään
koristelemista ja laittelemista Herran huoneeseen. "Ei tule noudattaa
maailman turhuutta tällaisena päivänä", oli hän sanonut; mutta sekä
äiti että sisar olivat sanoneet että hänen tuli laittaa itsensä juhla-
asuun; "täytyyhän kunnioittaa Jumalan huonetta ja ottaa sinne
parhaimpansa", oli äiti sanonut — ja niin poikanen taipui.
Nyt seisoi hän kärsivällisesti kamarissa ja antoi Anne-sisaren
hääriä ja laitella miten parhaaksi katsoi.
"No niin", sanoi sisar saatuaan hänet valmiiksi ja pannen hatun
hänen päähänsä, joka oli kammattu ja laitettu ajan tavan mukaan.
"Nyt olet hieno niinkuin pitääkin", sanoi hän.
Hans Nielsen huokasi.
"Kunhan vaan olisin sisällisesti niin hieno", sanoi hän itsekseen.
Sisar syleili häntä.
"Rakas Hans!" sanoi hän.
Hans katseli sisartaan rakkaasti.
"Ei tule olla kuin valkeaksi sivelty hauta", sanoi hän.
"Älä puhu sellaista", sanoi sisar.
Sitten he lähtivät hiljaisina alas portaita.
Ja kohta oli Niels Mikkelsen Hauge koko huonekuntansa kanssa
kirkkomatkalla.

56. Nuoret kävelivät nopeammin, ja tapahtuikin niin että he puolitiessä
saavuttivat joukon muita etelästä päin tulevia rippilapsia. Oli mukana
muutakin nuorisoa.
Siinä sitten kauniisti tervehdittiin ja puheltiin.
Pojat kävelivät ja katselivat toisiaan; tytöt vilkasivat myös poikiin.
Sitten sanoi se, joka käveli Hans Nielsenin vieressä:
"Sinunkin tukkasi on tänään ylöspäin kammattu, Hans Nielsen."
Samallapa hän hymyili.
Hans Nielsen Hauge punastui. Kaikkien toverien oli tapana
kiusotella häntä, kun hän tavallisesti sanoi että koreilu ja sen
sellainen oli maailmallista.
Nyt kääntyi hän sen puoleen, joka oli puhunut, ja sanoi:
"Kun me tänään olemme somistaneet ruumiimme juhla-asuun, niin
sopiipa toivoa, ettemme olisi unhottaneet kuolematonta
sieluammekaan, vaan että olisimme muistaneet sitä suurta lupausta,
minkä tänään tulemme tekemään, nimittäin jättämään perkeleen
työt ja toimet, ja uskomaan Isään Jumalaan, Poikaan ja Pyhään
Henkeen!"
Hän lausui tämän kuuluvasti ja vapaasti. Ja nytpä tulikin hänen
ympärilleen hiljaisuus.
Mutta muutamat pojat hymyilivät ja katsahtivat toisiinsa.
"Hän on pyhimys — tuo Hans", kuiskasi muuan.
Sen enempää ei puhuttu.

57. Kun, joukkue oli saapunut kirkkoaidan luokse, jossa oli mustanaan
kansaa, erosi Hans Nielsen muista ja meni sisarensa kanssa, joka oli
seurannut häntä, odottamaan vanhempiaan ja muita.
Niels Mikkelsen ja hänen vaimonsa puhelivat monen kanssa
ennenkuin menivät kirkkoon. Esipappi ja kappalainen eivät vielä
olleet saapuneet; mutta kansa oli nähnyt hevosen valjastettuna
kulkiessaan pappilan ohitse.
Vihdoinkin he tulivat. Esipappi Seeberg, jolla oli suuri käyrä nenä
ja rohkeat siniset silmät, istui kieseissä oikealla puolella; kappalainen
Hammer tummana ja kalpeana vasemmalla puolella.
Lakattiin soittamasta, kun papit tulivat kirkon kohdalle; vallitsi
hiljaisuus; kansa nosti lakkiaan heidän ohi ajaessaan.
Hans Hauge, joka seisoi sisäänkäytävän lähellä, omaistensa
keskellä, sai kappalaiselta osakseen ystävällisen päännyökkäyksen
tämän astuessa alas kieseistä.
Nuoresta pojasta tuntui lämpöiseltä se, että pappi todella tervehti
häntä; hän otti hatun päästään ja kumarsi syvään.
Sitten tulvi kirkkokansa sisälle ja kohta istui Hans isänsä ja
veljiensä vieressä haugelaisten penkissä. Vähän sen jälkeen luki
lukkari kirkkorukouksen ja virren veisuu alkoi.
Esipappi Seeberg saarnasi sinä päivänä. Hän puhui lämpimästi ja
lempeästi jumalan suuresta rakkaudesta ja teroitti nuorten mieliin
sitä syvää, totista kääntymystä, jossa ihminen kokonaan antautui
Hänelle eikä tietänyt mitään muuta autuutta kuin Kristuksen
kärsimisen ja kuoleman kautta saavutetun.

58. Hans Nielsenille tulivat kyyneleet silmiin hänen istuessaan siinä
kädet ristissä ja pää kumarassa. Hän rukoili Jumalaa, että hänen
sallittaisiin tulla oikeaksi Jumalan lapseksi; mutta samalla kertaa
tunsi hän väristyksen ruumiissaan siitä, ettei hän ehkä ollutkaan
siihen kelvollinen. Hän tunsi kyllä Jumalan sanaa, ehkäpä paremmin
kuin useimmat muut hänen ikäisensä; mutta vapaana maallisista
haluista ei hänen sydämensä ollut; sen oli hän aivan äsken
surumielin kokenut. Sillä vaikka hän nyt istui täällä Jumalalle
pyhitetyssä huoneessa ja kohta tulisi uudistamaan kasteensa liiton,
niin suuntautuivat hänen ajatuksensa kuitenkin maallisiin asioihin.
Eikö hän ollutkin juuri silloin kun pappi Hammer meni sakaristoon
ajatellut säilikköä ja sitä puoltatoista taalaria, minkä pappi hänelle
antoi kahden sijasta? Ja eikö hän salavihkaa ollut vilkaissut naisten
puolelle, jossa tytöt istuivat kauneina hohtavissa juhlapuvuissaan?
Ja Hans Nielsen kumartui yhä syvempään sekä rukoili Isämeidän-
rukousta lakkaamatta, etteivät maailmalliset ajatukset olisi saaneet
aikaa eikä tilaisuutta hiipiä häneen, myrkyttää hänen sieluaan.
Mutta kun hän lakkasi rukoilemasta, tulivat taasen joukottain ne
ajatukset, jotka hän oli karkoittanut. Ne eivät tahtoneet väistyä, ne
hämmensivät hänen mieltään, ja sitten hän ajatteli, että hän totisesti
olikin pahan hengen lapsi, eikä kuulunutkaan niihin, jotka Jumala oli
autuuteen valinnut; ja kylmä hiki nousi hänen otsalleen.
Silloin hän hädissään vilkasi äitiinsä, joka nyökkäsi hänelle
kolmasti, hyvin lempeästi.
Häneltä pääsi itku — oli kuin olisi rinnassa jotakin irtaantunut;
mutta hän kumartui vaan syvempään ja pidätti kyyneleet; olihan
häpeä ison pojan itkeä.

59. Nyt alettiin uusi virsi; hän tunsi säveleen ja taisi sanat, mutta hän
lauloi mukana tietämättä mitä lauloi.
Sitten alkoi kuulustelu.
Hans Nielsen tunsi itsensä varmaksi päästyään kirkon permannolle
yhteen muitten kanssa. Ja kuulustelun jatkuessa nousi myös hänen
rohkeutensa ja varmuutensa. Kolmeen kysymykseen hän jo oli
vastannut ja vastannut oikein, sen hän tiesi; nyt seisahtui pappi
Hammer neljännen kerran hänen eteensä ja kysyi taaskin, kerran ja
sitten vieläkin, sai vastauksen ja kysyi jälleen.
Hän laski kätensä Hansin olkapäälle ja taasenkin saatuaan oikean
vastauksen nyökkäsi hän ja katseli lähellä olevia aikaihmisiä, jotka
kuuntelivat.
"Aivan niin, aivan oikein, poikaseni", sanoi hän.
Hans Nielsen Haugesta tuntui sanomattoman onnelliselta hänen
siinä seisoessaan; mutta äkkiä tuli hän ajatelleeksi että tämä ehkä
olikin ylpeyttä ja niin hän hiljaa ja kiireesti rukoili Jumalaa, että Hän
antaisi hänelle nöyrän sydämen ja johtaisi hänen sydämensä ja
ajatuksensa pois kaikesta katoovaisesta. Kunhan vaan en taasen
tulisi ajatelleeksi sitä puoltatoista taalaria, tuumi hän — ja kylmä hiki
nousi taaskin hänen otsalleen. "Aivan oikein, ihan oikein poikaseni",
sanoi uudelleen pappi, joka huomasi hänen kalpeutensa; sitten
taputti hän Hansia olalle ja meni edelleen.
Silloinpa kääntyivät Hansin silmät väkisinkin naisten penkkiin,
jossa hänen äitinsä istui.
Äiti nyökkäsi ja näytti onnelliselta.

60. Ja Hans Nielsen veti syvän henkäyksen.
— — —
Kuulustelu oli lopussa; lupaus oli nyt tehtävä. Hiljaisesti ja silmät
alasluotuina tulivat rippilapset alttaripöydän luo.
Kullekin vuorostaan tehtiin ratkaisevat kysymykset.
Yksi kerrallaan vastasi hiljaisesti.
Kun pappi Hammer tuli Hans Nielsenin kohdalle huomasi hän
itkusta kosteat kasvot, ja kun kysymykset oli tehty ja myöntävä
vastaus hiljaisesti annettu, katsoi Hans Nielsen pappia silmiin
hätääntyneenä ja sellainen rukous silmissä, että papin sydän aivan
lämpeni. Ja kun pappi tarttui lupauksen tekijän käteen lausuttuaan:
"niin anna siis Jumalalle sydämesi ja minulle siitä todistukseksi
kätesi", tunsi pappi, kättänsä niin puristettavan kuin ei olisi puristaja
sitä tahtonutkaan heittää.
Pappi nyökkäsi ja meni seuraavan luo. Ja samalla äänellä tehdyt
kysymykset ja vastaukset kaikuivat Hans Nielsenin korvien ohi hänen
siinä seisoessaan tovereitaan huomaamatta ja itkiessään kädet
silmien edessä.
Niin, totisesti! Hän tahtoi antaa sydämensä Jumalalle!
Kun loppuvirsi oli veisattu ja lähtökumaukset kolme kertaa kolme
kirkonkelloista kaikuneet, seurasi Hans Nielsen hiljaisesti
vanhempiaan. Ei siinä mitään puhuttu; he ottivat häntä vaan lujasti
kädestä, kun oli tultu ulos kirkosta.

61. Mutta kun oli saavuttu Haugen tienhaaraan ja äiti kulki Hansin
vieressä, sanoi äiti sävyisästi:
"Minusta näytti että kaikki meni hyvin!"
Hans Nielsen katsahti äitiinsä. Hänen silmänsä kirkastuivat ja
suupieleen nousi hymy. "On niin paljoa vastaan taisteltava, äiti",
sanoi hän.
* * * * *
Hans Nielsen Haugesta oli tullut aikamies.
Itsensä elättämisen velvollisuus alkoi hänessä nousta
voimakkaana, ja luonnostaan lahjakkaana ja käytännöllisenä oli
hänen helpompi kuin monen muun antautua aloille, joista hän sai
varman taloudellisen toimeentulon.
Hän harjoitti sepän ja puusepän ammatteja, kuten poikanakin;
hän vuokrasi maita, joita hän viljeli; hän harjoitti mehiläishoitoa ja
pientä kauppaa, ja mihin ikänä hän ryhtyi, oli hänellä menestystä.
Siinä, minkä hän kasvavalla ijällä oli katsonut maailmallisiksi
ajatuksiksi ja haluiksi, oli hän nyt velvollinen ja oikeutettu
toimimaan; mutta olipa vaara että tämä hommailu kiinnitti kaiken
hänen halunsa ja vei hänen aikansa; raamattu ja kristilliset kirjat
tulivat toiselle sijalle ja moni seikka, joka oli polttanut hänen sieluaan
poikaijässä, haalistui myöhemmin ja jäi pois mielestä.
Mutta tapahtuipa seikkoja, jotka taasen herättivät tämän rikkaan
ja vastaanottavan mielen ajattelemaan ijäisiä asioita.
* * * * *

62. Vähän matkan päässä eteläänpäin Haugen talosta oli silloin suuri
metsämaa, enimmäkseen mätäsmaista lehtimetsää. Tämä metsä,
jossa maaperä oli lihavaa ja rehevää, oli täynnä purosia, jotka milloin
maanalaisina, milloin sen päällisinä juoksivat suurempaa jokea kohti,
joka virtasi Glommeniin päin ja laski siihen vähän etelämpänä.
Tähän metsämaahan olivat edelliset omistajat muinoin useamman
kerran yrittäneet tehdä peltoa. Mutta he olivat taasen jättäneet
yritykset sikseen, ja pientä metsää, enimmäkseen haapaa ja leppää,
oli taasen päässyt juurtumaan väkevään maaperään, jossa
puunrunkojen välissä kasvoi kyynäränkorkuista heinää.
Tästä metsämaasta oli Hans Nielsen Hauge huokealla hinnalla
vuokrannut itselleen maakappaleen. Siellä hän nyt työskenteli ja teki
uutta peltoa, poltti viidakkoa ja kylvi heinänsiementä; hänen
tarkoituksensa oli, että "Haugen uutisviljelys", joksi hän sitä
sisarusten kesken mielellään kutsui, muodostuisi kelpo niityksi ja
antaisi hänelle vuosittain hyvät tulot.
Kun joku haasteli, että tuo ehkä oli turhaa työtä ja vaivaa, vastasi
hän:
"Se, joka ei kynnä, ei saa koskaan kylvää, ja se, joka ei koskaan
kylvä, ei se myöskään saa niittää."
Ja niin teki hän luottavasti edelleenkin työtä. Hänen verensä
hehkui halua alkaa alusta, oman mielensä mukaan, ja kulkea omia
teitään.
Isäkin toisinaan sai sanoneeksi, että hän voisi käyttää aikaansa
paremmin kuin hukkaamalla sitä korvessa semmoiseen, josta ei
tiennyt tulisiko se kannattamaan, ja äitikin lempeällä tavallaan

63. kannatti isän mielipiteitä; mutta silloin Hans vastasi tavalla, joka
lopetti kaikki vastaansanomiset:
"Korvessahan työtä parhaiten tarvitaan. Jos Jumala tekisi meille
siten kuin te neuvotte minun menettelemään maaperän suhteen,
silloinpa ei kukaan eksyksissä oleva ihminen pelastuisi ja moni hyvä
sydämen pelto menisi hukkaan."
Olipa päivä jälleen syksyllä, lokakuussa, vuosi sen jälkeen kun
Hans
Hauge oli päässyt Herran ehtoolliselle.
Kauimpana uutisviljelyksellään, aivan joen lähellä, joka nyt
syysvesistä kirkkaana, vuolaana virtasi, oli Hans Nielsen
raivaustyössä.
Oli keskipäivä. Hän oli tehnyt työtä aamusta varhain ja odotteli nyt
Anne-sisartaan, joka tavallisesti toi hänelle ruokaa. Anne oli
sisaruksista se, joka häntä parhaiten ymmärsi; hänen kanssaan Hans
myös enimmin puhui sekä hengellisistä asioista että maallisista
aikeistaan.
Hän oli nyt saanut uutismaan raivaustyön melkein loppuun
suoritetuksi; ainoastaan pari suurta puuta oli jälellä joen rannalla;
niitä hän nyt alkoi kaataa.
Puu vapisi ja natisi iskujen sattuessa; kellastuneita lehtiä putoili ja
ne menivät yksittäin virran mukana, joka syvänä juoksi
savikkorannan vieritse.
Nyt puu rupesi kaatumaan. Hän siirtyi pois alta, mutta liukastui
märällä maalla; hän päästi kirveen käsistään tarttuakseen johonkin

64. kiinni, mutta putosi päistikkaa jokeen puun tullessa suhisten jälestä.
Hän huudahti päästyään veden pinnalle; hän tarttui erääseen
oksaan ja piti siitä kiinni, hän huomasi pohjaavansa, mutta havaitsi
samalla, ettei hän voinut päästä ylös eikä eteenpäin.
Hän huusi taasen. Suuri hätä saavutti hänet. Nyt puhui Jumala
hänelle jo toisen kerran.
Tuona ensimäisenä kertana Glommenissa kuului Jumalan varottava
ääni; nyt oli jo kuolema tulossa.
Ja hänen elämänsä siitä ajasta lukien kierteli hänen ajatuksissaan
tuskallisesti.
Oliko hän käyttänyt armon ajan oikein? Olivatko Jumalan sana ja
Jumalan tahto olleet hänelle kaikki kaikessa?
Eivätkö maalliset asiat ja maallinen voitonhimo olleet päässeet
valtaan hänen sielussaan ja vieroittaneet häntä Jumalasta? Ja nyt oli
hänen kuoltava täällä yksinäisyydessä, saamatta sanoa jäähyväisiä
kenellekään omaisista! Hän taisteli kaikin voimin päästäkseen ylös
virrasta, mutta kaadetun puun tiheät oksat estivät häntä kaikkialla ja
hän vaipui lopen väsyneenä takaisin.
Joen syvä syysharmaa vesi ulottui hänelle kaulaan saakka;
käsivarret pitivät kiinni oksista, mutta hän ymmärsi ettei sellainen
voinut kauan kestää; virta oli liian vuolas eikä silloin ollut enää
mitään pelastumismahdollisuutta.
Hän sulki silmänsä ja rukoili viimeisessä hädässään Jumalaa, että
hän Kristuksen haavain tähden antaisi hänelle hänen syntinsä
anteeksi ja pelastaisi hänet kuoleman vaarasta.

65. Silloin, viime hetkessä, juuri kun voimat olivat loppumassa, kuuli
hän ikäänkuin joku olisi kaukana huutanut häntä.
Hän huusi takaisin äänensä koko voimalla. Ja taasen joku huusi
hänen nimeään, tällä kertaa lähempänä. Hänen sisarensa Anne oli
tullut.
Nyt seisoi sisar tuolla ylempänä ja huusi taasen, tähystellen.
Ja hän vastasi.
Kun sisar huomasi hänet, huusi hän ja löi kätensä yhteen. Sitten
tuli hän juosten ja tarttui kirveeseen, joka oli rannalla.
"Pysyttele kiinni!" huusi hän.
Oksan toisensa perästä löi sisar irti ja ne menivät virran mukana;
Hans piti kiinni suu valjuna ja hampaat yhteen puristettuina.
"Kiiruhda", huusi Hans.
Silloin ojensi sisar kirveen ja kurottui ulospäin rannasta, pitäen
vasemmalla kädellään lujasti eräästä haavan rungosta.
Hans Nielsen sai kiinni kirveestä molemmin käsin ja liukui virran
mukana rantaa kohden.
Vähän ajan kuluttua makasi hän kalpeana ja huohottaen
pensaitten keskellä. Sisar seisoi itkien hänen vieressään.
"Jumalan kiitos, että tulin!" huudahti hän, pani kätensä ristiin ja
itki taasen.

66. Veli makasi kauan puhumattomana. Vihdoinkin yritti hän nousta
ylös.
"Saammepa tosiaan kiittää Jumalaa", sanoi hän vapisevalla
äänellä.
Silloin sisar kietoi kätensä hänen kaulaansa.
"Jumalan olkoon kiitos!" sanoi hän taas.
* * * * *
Vaikeasti sujui molempain matka kotiin. Hans oli kovin väsähtänyt;
ilma oli kylmä ja läpimärät vaatteet painoivat.
Kun he vihdoin saapuivat kotiin ja isä, joka juuri istui pöydän
ääressä kahvia juomassa, kuuli mitä oli tapahtunut, sanoi hän:
"Hullusti siis kävi kuitenkin!"
Hans ei vastannut. Hän astui vaan ylös portaita kamariin ja muutti
yltään märät vaatteet; mutta kun hän sitten tuli alas syömään ja
istuutui, oli hänellä sisällinen vilu.
— — —
Kaksi päivää tämän tapauksen jälkeen sairastui Hans Nielsen.
Yhtaikaa rupesi viluttamaan ja tuntumaan vaikeita pistoksia
rinnassa; sen jälkeen tuli polttavan kuuma ja painosti hengitystä niin,
ettei hän sellaista ollut koskaan ennen tuntenut. Sellaisena makasi
hän kolme vuorokautta, ja niiden mielestä, jotka häntä hoitivat,
näytti hän tulevan yhä huonommaksi.

67. Mutta Hans Nielsen Hauge arvelikin itse, että hänen täytyi nyt
kuolla. Tämä oli Jumalan kolmas ja viimeinen kutsuminen.
Ja hänen maatessaan tuskissaan ja vaikeasti hengittäen, tuntui
hänestä kuin tapahtuisi hänelle onni, jos nyt kaikki loppuisi.
Ainoastaan yksi ainoa asia ahdisti häntä enemmän kuin kuoleman
pelko, nimittäin se ajatus, ettei hän ehkä ollutkaan Jumalan lapsi ja
että hän nyt ehkä siirtyisi tuskista täältä helvetin ikuiseen vaivaan.
Kolmannen päivän illalla oli hän kovin levoton.
"Minua niin peloittaa, Anne", sanoi hän tavan takoa sisarelleen.
Sitten hän taasen vaipui horroksiin, lyhyesti hengittäen, unissa
valittaen ja kovasti kuumeisena.
Kello kymmenen aikaan hän heräsi. Silloin istui äiti hänen
vuoteensa ääressä.
Talikynttilä paloi, äiti istui ja luki postillaa.
Poika avasi sinisenharmaat, sameat silmänsä kuin unessa. Sitten
hän nousi puolittain istumaan vuoteessa.
"Minäpä kuolen, äiti!" sanoi hän. Ääni vapisi kuumeesta; hengitys
kuului raskaalta.
Silloin äiti purskahti itkuun ja itki kauan kirjan yli kumartuneena.
Poika makasi ja katsoi eteensä.
"Älä itke, äiti", sanoi hän.
Hän itki yhäti, nyyhkyttäen.

68. Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
textbookfull.com