The Coulter Principle for Cellular & Biological Applications

1. The Coulter Principle for Cellular and 
Biological Applications
Multisizer™ 4

2. The Coulter Principle
•The Coulter Principle, which uses electrical 
impedance to measure particulate volume was 
developed over 60 years ago for counting and 
sizing red blood cells.  
•It is the subject of numerous ASTM and ISO 
standards for sizing and counting.  
•It is independent of particle refractive index, 
chemistry, etc.  It 
will detect any particle that 
displaces liquid.

3. The Coulter Principle in Practice
Particles, liquid and electric current are pumped through an 
orifice of an exact diameter 
The particles cause changes in the electric current & these 
changes are monitored to count and size particles

4. Current Users of the Multisizer
•Georgia Tech
•MIT
•Harvard
•U. Texas
•UC London
•UC Berkeley
•Leiden U.
• McGill U.
•U. Chicago
•NYU
•UCLA •Lehigh U.
•RIT
• Johns Hopkins
• Columbia

5. http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/pics/Apoptosis.gif http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/pics/Apoptosis.gif
•Apopotosisinvolves the swelling and breaking apart of cellular 
structure
•Carefully designed studies can use the Coulter Principle to 
understand the role of various chemicals, proteins, etc. in the 
process
Studying Cell Death
(Apopotosis)

6. Cell Shrinkage is a prerequisite 
for Apopotosis
Maeno, et al. PNAS 2000, 97, 17, 9487 Maeno, et al. PNAS 2000, 97, 17, 9487

7. Determining Fertility 
based on Sperm Volume
• Depending on the time of year, farm animals display 
high or low fertility (counts)
•Volume changes can be indicative of disorders (size)
Hossain, et al, Human Reproduction, 13. 6. 1578-1583. 1998

8. Effect of Quinine on Sperm
Yeung, et al, J. of Andrology, 23. 4. 522-528 2002 Yeung, et al, J. of Andrology, 23. 4. 522-528 2002

9. Characterization of Cell Culture
ƒIndustrial scale cell cultures require constant   
monitoring and analysis
ƒCoulter Counter provides answers to many 
common questions
9How big are the host cells?
9How uniform are  the host cells?
9Have any of the host cells broken apart?
9What is the relative percentage of debris to 
desired cell type?

10. Characterization of host rDNA 
Cell Culture

11. Environmental Conditions 
Effect Cell Stability and Viability  

12. Filtration Efficiency
•After growing up cell culture, filtration is used to remove debris
•Key parameters are efficiency and fouling‐batch differences in 
media culture can cause filter fouling
•The Coulter Principle can be used to help select filters that 
perform the best

13. Data from Major Pharma Company
Company was interested in removing the cellular debris/fragments prior to 
pumping the supernatant into downstream processing steps.  First two curves 
are as harvested (showing debris/fragment concentrations).  The remaining 
curves are samples set aside in beakers etcthat were then sampled. Two 
different clarification filtering systems were used.

14. Cell Banking:  Real Time 
Measurement of Changes in Cell Size 
Mukherjee, et al, Cryobiology, 55(1):10-18. 2007 Mukherjee, et al, Cryobiology, 55(1):10-18. 2007
•To permanently preserve cell lines, cryoprotectants are 
used prior to freezing
• Cryoprotectants themselves cause cell damage
• Studying the rate of this damage and changes in cell size as 
a function of time allows users to make better decisions 
about preservation methods

15. Multi‐Tube Overlap: 
Bacterial Aggregation in a Culture
Bacterial aggregates can reduce the effectiveness of antimicrobial agents. A 
combination of detergents and filters can be used to decrease the amount of 
'clumps'.  The percentage of 'clumps' relative to single cells can be determined 
by using two different apertures. The Multi‐Tube Overlap function merges the 
results into a single
 continuous distribution.

16. Corollary I: Which Bead 
Formulations?
•Micron Sized Beads are used in a variety of 
cellular and biological applications
9Typically coated with recognition molecules
9Can be dye‐loaded, magnetic, or other…
9Optimization of formulation conditions is key
•The Coulter Principle is the only technique that 
can provide the resolution necessary for these 
studies

17. ~6
~12
~18
~24
Formulation B
Formulation A
Corollary I: Which Bead 
Formulations?
The volume peaks increase by multiples of 6, indicating singlets,
doublets, triplets, etc.

18. Corollary II: Microbubble 
Characterization
•Large beads (2‐20 micron)
9Hollow and filled with imaging agents
9Most typically applied in ultrasound
9Heavy focus for biomedical research
•The Multisizer
TM 
allows researchers to 
characterize these emerging imaging agents

19. Particulates and Aggregates in Protein 
Formulations
Beckman Coulter Particle Characterization

20. Protein Aggregates: Overview
•Problem statement
•The opportunity
•How the Coulter Principle competes
•Voice of the customer
• Frequently asked questions
• References
•The Coulter Principle

21. Problem Statement:
• Protein scientists have identified an overlooked region of
product quality data.
9Currently, techniques such as AUC, CE, and chromatography provide
information up to 100 nm particles in size.
9Other technologies, such as light blockage provide information above 10 micron
in size.
• A “blind spot” exists with particles between 100 nm and 10
micron.
9Particles in this range may cause immunogenicity.
9Active studies of this size range began in mid-2008.
9Regulators are demanding data in this range.
Journal of Pharmaceutical Science-2009 Journal of Pharmaceutical Science-2009

22. Genzyme Case Study:
Importance of Particles in Biologics
November 2009 ¾
FDA reports that Cerezyme, Fabrazyme and three other
enzyme drugs that are put into vials at the factory were
contaminated withPARTICLES of steel, rubber or fiber .
¾
Financial analyst predicts the overall cost to the Genzyme
will be in the$200 million to $300 million
range
Genzyme says FDA will oversee its factory
By ANDREW POLLACK
NEW YORK TIMES, Published: March 24, 2010
Key Message
FOREIGN OR PROTEINACEUOS PARTICLES
HAVE THE POTENTIALTO MAKE PEOPLE SICK

23. The Opportunity:
Regulatory pressure is forcing manufacturers to 
account for particulates of smaller and smaller 
sizes.  
9Current lower limit =10 micron
9Likely future lower limit = 1 micron
Currently used technologies do not perform well 
below 10 micron
9The Multisizer™4 has been shown to be very 
effective in this size range.

24. The Opportunity:
•FDA & EMEA require data for particulates less 
than 10 micron, but do not specify the technique 
that should be used.
9USP and EDQM pharmacopeias DO establish 
acceptable techniques for FOREIGN particles greater 
than 10 µm
9Two current, acceptable techniques for foreign 
particulates greater than 10 µm
‐Technique 1: Light Obscuration
‐Technique 2: Microscopy
USP: United States Pharmacopeia
EMEA: European Medicines Agency

25. The Opportunity:
•Competing techniques being evaluated for 
particulates less than 10 micron:
9The Coulter Principle (BEC)
9Light Blockage (HIAC)
9Flow Imaging (MFI, Flowcam)

26. Opportunity Matrix:
Particulate
Characteristics
Less than
10 micron
Greater than
10 micron
Foreign
Particulates
Opportunity for MS4
Covered by current
USP & EMEA Methods
Protein
Aggregates
Opportunity for MS4 Opportunity for MS4
USP: United States Pharmacopeia
EMEA: European Medicines Agency

27. Coulter Principle: Advantage
0.00E+00
6.00E+04
1.20E+05
0.4 1.9 3.4
Diameter (mm)
Number per mL
Pre-filtration Post-Filtration
Approx. light
blockage
lower limit
(~2 μm)
Approx. flow
imaging
lower limit
(~1.5 μm)
Diameter (μm)
Multisizer
TM
4 Data from Actual Protein Therapeutic
Other techniques miss the majority
of particulates

28. Technique Comparison:
Operating
Principle
Handles
Transparent
Particles?
Min
Sample
Volume
Min
Size
Max
Concentration
Light
Blockage
Light Based Questionable 2 mL
2.0
micron
18,000
particles/mL
Flow
Imaging
Light Based Questionable 2 mL
1.5
micron
750,000
particles/mL
Coulter
Principle
Multisizer
TM
Impedance Excellent 4 mL
0.4
micron
>1,000,000
particles/mL

29. How can we estimate aggregate mass?
Mass = Density x Volume

30. AsphericalObjects: Preview

31. Voice of the Customer:
“We WANT…”
1. Accurate counts below 10 micron, and 
ideally as low as 0.1 micron
2. The ability to run samples neat
3. Total sampling volumes between 2 and 5 mL
4. Extremely linear and reproducible data

32. How We Meet Customer Needs:
Accurate counts below 10μm, ideally as low as 0.1μm 
9The MS4 is the only instrument that can count particulates 
under 1 μmand down to 0.400 μm. 
The ability to run samples neat 
9The MS4 can count proteins in a wide variety of native buffers 
without dilution 
Sampling volumes between 2 and 5 mL 
9Our new sample procedure and adaptor allow s volumes as 
small as 4 mL 
Extremely linear and reproducible data 
9The MS4 is highly sensitive and reproducible 
9Typical CV's are below 2% 
9The Coulter Principle has been used as the #1 method for 
counting red blood cells for over 50 years 

33. “Do you have to dilute?”
9Not necessarily.  Depends on sample characteristics and 
smallest size range needed.  
9Protein scientists often dilute for other analyses (size 
exclusion chromatography, CE, AUC)
“Can you provide morphology information?”
9Ask why this is important.  Customers are most 
concerned about counts and current flow image 
techniques and rely upon image aspect ratios for 
morphology
Frequently Asked Questions

34. Frequently Asked Questions
“Can you count down to 100 nm?”
9How low can you count now? The Multisizer
TM
is the 
only instrument with accurate and reproducible data 
below 1 micron.
“What sample volumes are required?”
9The standard set up accommodates 10 mL.  However, 
we have a special technique for proteins that can use 
as little as 4 mL.
“What is the Coulter Principle?”
9It uses electrical impedance to count and size 
particles.  It has been around for more than 55 years 
and widely used as a counting standard.