Tincion de scheffer fulton

1. PRACTICA # 6 TINCION DE SCHEFFER-FULTON MESA # 5

2. Introducción Dado que la clasificación de las bacterias depende principalmente de su tamaño, forma y propiedades de coloración, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbiólogo. Las preparaciones no teñidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se utilizan preparaciones fijadas al calor y teñidas.

3. MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS Cantidad Material y equipo Capacidad descripción cantidad Reactivos formulas 24 Portaobjetos Portaobjetos de 25x75mm 100 ml Safranina C20H19CIN4 24 Cubre objetos Cubreobjetos de 25x75mm 100 ml Alumbre de potasio KAI(SO4)2·12H2O 18 Asas Bacterioló-gicas 100 ml Acido tánico C76H52O46 6 Mecheros Bunsen 100 ml Verde de malaquita C8H10N4O2 12 varillas de tinción Armar varillas con mangueras de hule 100 ml Fucsina básica C20H19N3 100 ml Fenol C6H5OH 100 ml etanol CH3CH2OH

4. Tinción de S heaffer-Fulton Tinción de sheaffer-Fulton usado para colorear biometría hemática para esporas está también es conocida como la de Wright . La tinción de Sheaffer Fulton permite observar: a.- Esporas. b.- Cuerpos fructíferos c.- Conidias d .- Células gemantes . .-¿ De qué color se ven las esporas y las células vegetativas en la tinción de Sheafer y Fulton? .- Verde y rojas

5. Las esporas Una espora (Gr. spora =semilla) es una unidad diminuta y simple; que se propaga sin un embrión y sirve para la producción de un nuevo individuo de la misma especie. Desde la espora empieza el desarrollo del hongo en forma filamentosa.

6. ´´Tipos de esporas que existen´´

7. Clasificación de las esporas Por su función: -En hongos, las clamidospora -Los hipnozigotos de los hongos zigomicetos Por su origen durante el ciclo biológico son haploides . La mayoría de los hongos producen mitoesporas . Por la motilidad es la capacidad de moverse autónoma y espontáneamente.

8. Partes de la espora

9. ¿ Que es un frotis? Extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Posteriormente, el frotis debe ser fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

10. ¿Que es un colorante? En química, se llama colorante a la sustancia colorida usada en tinciones para resaltar diferentes microorganismos . También se le llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas longitudes de onda de espectro visible. Los colorantes son sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores físicos/químicos como por ejemplo: luz, lavados, agentes oxidantes, etc.

11. VERDE DE MALAQUITA El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativas. Cuando se calienta en la preparación también penetra las esporas. Durante el lavado con agua, verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la espora.

12. Las esporas quedan teñidas de verde y las células vegetativas teñidas de rosa. Características: aspecto Solido verde Olor Característico pH 2.4 Punto de Fusión 159ºC Solubilidad 110g/L en agua a 25ºC

13. Preparación Verde de malaquita................. 5 g Agua destilada..................... 100 mil Preparación: - Disolver el colorante en el agua y dejar en reposo durante una hora y media. - Filtrar. - Guardar en frasco oscuro.

14. PELIGROSIDAD Nocivo en contacto con la piel y por ingestión. Evitar contacto con los ojos. Usar guantes adecuados. En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al medico y muéstrele la etiqueta o el envase. Ingestión: provoca irritaciones de las mucosas en la boca, faringe, esófago y tracto gastrointestinal. Piel: irritante Ojos: irritante Inhalación: causa irritación de las vías respiratorias.

15. SAFRANINA El colorante de contraste (la  safranina ) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el agua). La safranina , es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacteria s G- ; en histología  y en citología. La safranina se usa como l íquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular  de rojo.

16. CARACTERISTICAS: Aspecto Liquido rojo Olor Alcohol Etílico Solubilidad Miscible con agua Formula C 20 H 19 ClN 4 Peso molecular 350,85 g/mol

17. Preparación Safranina ..................................... 0.5 g Agua destilada............................ 100 mil Preparación: - Disolver el colorante y filtrar.

18. PROCEDIMIENTO 1. Hacer un frotis de Bacillus sp. De la manera usual: Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.  Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero.

19. 2. Cubrir la extensión con papel de filtro (dificulta la precipitación del colorante sobre las bacterias ).

20. 3. Depositar la preparación sobre una platina de Koch. Añadir verde de malaquita. Esperar un minuto .

21. 4 . Seguir la tinción con calor : en emisión de vapores durante 5-10 minutos. Dejar enfriar.

22. 5 . Lavar con agua abundante. Secar.

23. 6 . Teñir con safranina (dos minutos). Lavar con agua. Secar. Observar con objetivo de inmersión.

24. RESULTADOS Luego del montaje al microscopio óptico, se observaron bacilos Gram positivos esporulados; asimismo se apreciaron esporas solitarias de forma circular y bacilos que no presentaban formación de esporas . Las e sporas teñidas de verde y otras bacterias teñidas de rojo .  

25. CONCLUSION La tinción de Scheffer y Fulton emplea verde malaquita, como colorante primario, el cual es eliminado posteriormente por el resto de la célula bacteriana, pero no de la espora, mediante un enjuague con agua. Como contra tinción la emplea la safranina, la cual tiñe la célula vegetativa. Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura muy pequeña, por medio de la tinción con verde de malaquita, el cual requirió del calor para la penetración; se pudo observar la estructura interna de la célula bacteriana, particularmente las endeosporas . En este experimento se utilizó una tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda la célula excepto la espora que se observa de un tamaño bien aceptable El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. La Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endoesporas , tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante