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TIPOS Y TECNICAS DE SIEMBRA MICROBIOLOGÍCA

1. TIPOS Y TECNICAS DE SIEMBRA MICROBIOLOGÍCA

I. Tipos de siembra microbiológica

En Placa

1. Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre
el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se
utiliza para microorganismos aerobios.
2. Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una
vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para
cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
3. Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda
de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por
el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos
aerobios estrictos.
4. Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido
y se deja solidificar.
Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener
colonias aisladas.
5. Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una
muestra liquida cuyo volumen no puede ser predeterminado, en medio de
cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado vaginal
tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que
este tipo de pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina
empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puede determinar
con pipeta o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado.
6. Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar
la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con
la espátula por toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiendo un
movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un

2. hisopo grueso embebido de un cultivo líquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.

En Tubo
1. Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el
caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del
asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos
moderados.
2. Siembras por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie del
agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con
el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a
sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se
inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría
en la parte más cerca de la boca del tubo.
3. Siembra por punción: Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será
la aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de
ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son
similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método,
es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de
cultivo.

II. Técnicas de siembra microbiológica

En placa

1. Técnica de siembra por estría en placa: Es el método más fácil y el más usado
para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una
muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la
superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri
también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo
estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del
medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la
región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la
misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las
placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas
experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles.
Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola
célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan
juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos
de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a
partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se
desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos.

3. 2. Técnicas de extensión en placa: Las muestras diluidas se siembran directamente
en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de
Drigalsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las
células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban
hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no
existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas
por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en
placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de
siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor
número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto, se
eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios
tipos de microorganismos.


En tubo
1. Siembra por inoculación o agitación: con un asa bacteriológica, esterilizada, se
toma cantidad de inoculo, se introduce en el centro del medio líquido, agitándose,
no tocando la pared del tubo.

4. 2. Siembra por estría (en tubos de agar inclinado): Muestra de material en asa de
siembra, deslizar en zigzag, empezar por superficie más profunda.
3. Siembra por picadura: Asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semisólido,
en el tubo de ensayo hasta que la muestra quede bien impregnada al agar.
4. Siembra por vertido en placa: Diluciones en varios tubos, pipeta 1cc de muestra o
dilución, agregar tubo de ensayo estéril, se agrega medio licuado, mantener a
55°C, movimientos rotatorios, solidificar.







AISLAMIENTO DE MICROORGNISMOS
Técnicas de aislamiento
I. Métodos generales

1. Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri: Es la técnica
más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el mechero y
enfriada cerca del mismo, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se
extiende sobre la superficie de la placa con el medio agarizado, pero sin hacer
presión para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar a la temperatura adecuada,
siempre en posición invertida lo que evitará que el agua de condensación se
deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias
aisladas. Mediante estas técnicas se obtienen colonias aisladas a partir de una
muestra que contenga un elevado número de bacterias.
Existen distintos tipos de trazados tendientes a lograr una buena separación entre
los gérmenes sembrados. Se puede sembrar por:
✓ Agotamiento en ansa: Se flamea el ansa, se enfría y después de rozar la
siembra realizada previamente, se realizan estrías en dos placas en forma
consecutiva sin recargar el ansa.

5. ✓ Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías
se extienden sobre un área pequeña de la superficie de la placa. Se retira el
ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en el interior de la placa se
hacen nuevas estrías por otra zona tocando ligeramente la muestra
sembrada anteriormente. Este proceso puede repetirse sucesivamente,
flameando y enfriando el ansa al comienzo de las sucesivas siembras en
estría, de acuerdo a la carga inicial de microorganismos. Tras la incubación,
se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada,
donde se puede estudiar la morfología colonial.
✓ Dilución previa en solución fisiología o caldo: Se toma la muestra para
aislar y se la resuspende en solución fisiológica o caldo nutritivo,
preparando luego diluciones seriadas decimales en condiciones asépticas.
Se toman las diluciones y se estría con ellas una placa para cada una. En la
dilución adecuada se obtendrán colonias aisladas.
✓ Extensión en superficie con espátula de Drigalsky: Aquí también pueden
prepararse diluciones decimales. Se deposita sobre la superficie de la placa
una gota o 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de
microorganismos y se extiende con ayuda de la espátula, previamente
esterilizada por flameado, en todas las direcciones hasta que esté
completamente seco.
2. Por mezcla
Esta técnica tiene la ventaja de permitir el cálculo del número de bacterias presentes
en la muestra, si se trabaja con exactitud. Se realizan diluciones seriadas de la
muestra y se coloca en tubos estériles, por separado, el mismo volumen de cada
una. Luego se vierte en el tubo, medio de cultivo fundido y atemperado
aproximadamente a 45ºC. El contenido se homogeneiza por rotación, y luego se lo
vierte sobre la superficie de una placa de Petri. Tras la homogeneización, se dejan
enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la
temperatura adecuada (siempre en posición invertida).
Otra variación de esta técnica consiste en depositar en una placa de Petri vacía un
pequeño volumen conocido de muestra y a continuación añadir el medio de cultivo
fundido y atemperado, mezclando por rotación suave de la placa. De esta forma los
microorganismos se distribuirán homogéneamente en el medio de cultivo,
permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

6. Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en
la superficie tendrán distintas características, dependiendo del tipo microbiano,
mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del
agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas
colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la
profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por
su morfología. Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente
sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una
muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos.

II. Métodos especiales

Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en cuenta
que puede haber gérmenes que poseen idénticos comportamientos frente a un mismo
agente físico o químico.

✓ Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no
esporulados. Consiste en calentar la suspensión a 100ºC durante 10 min. y 85ºC
durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios sólidos.
✓ Agregado de álcali o ácido: tratamiento de la muestra con algunos de estos
agentes ya que existen microorganismos que los resisten y otros que no.
✓ Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas
distintas
✓ Cambios en el pH: existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios
con pHs extremos.
✓ Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de distintos
microorganismos de crecer o no en medios con sales, sustratos, colorantes o
antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el fin de lograr su
aislamiento.