TUGAS RESEARCH METHODOLOGY & BIOSTATISTIC_dr.Tri Nugaraha S,,M.Med,Phd _ Anita Fauzziah Yusuf.pptx

BIOSTATISTIK

1. ANITA FAUZZIAH YUSUF, MD, AIFO-K Titin as a force-generating muscle protein under regulatory control Tugas Journal Reading Dosen Pengampu : Prof. Dono Indarto, dr., M.Biotech.St, Ph.D,

2. Titin sebagai protein otot pembangkit gaya yang berada di bawah kendali regulasi. J Appl Physiol 126: 1474 –1482, 2019. First published December 6, 2018; doi:10.1152/japplphysiol.00865.2018

3. INTRODUCTION Titin telah lama dikenal sebagai protein mekanis dalam sel otot yang memiliki fungsi utama sebagai pegas molekuler pada unit kontraktil, sarkomer. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa pegas titin berkontribusi pada kontraksi otot dengan cara yang lebih aktif daripada yang diperkirakan sebelumnya. Dalam tinjauan ini, kami menyoroti sifat ini, khususnya kemampuan domain mirip imunoglobulin (Ig) titin untuk menjalani transisi pelipatan-pembukaan ketika molekul titin terisolasi atau miofibril rangka dipertahankan pada tingkat gaya fisiologis. Pelipatan domain Ig titin di bawah tekanan merupakan sumber produksi kerja yang sebelumnya tidak disadari dalam sel otot, yang dapat bekerja secara sinergis dengan sistem aktomiosin untuk memaksimalkan energi yang dihasilkan oleh otot yang diregangkan dan berkontraksi secara aktif.

4. INTRODUCTION Tinjauan ini juga berfokus pada mekanisme yang terbukti memodulasi gaya viskoelastis berbasis titin dalam sel otot rangka, termasuk pengikatan chaperone, oksidasi titin, fosforilasi, pengikatan Ca2+, dan interaksi dengan filamen aktin. Dalam pembahasan ini, kami membahas mekanisme modulasi mana yang mungkin berkontribusi pada fenomena peningkatan gaya residual yang relevan untuk kontraksi otot eksentrik. Terakhir, perspektif singkat ditambahkan tentang potensi perubahan gaya berbasis titin untuk secara dinamis mengubah jalur pensinyalan mekanokimia dalam sel otot. Kami menyimpulkan bahwa titin dari otot rangka merupakan penentu tegangan pasif dan aktif, serta mekanosensor yang bonafide, yang kekakuannya diatur oleh berbagai mekanisme independen.

5. Dalam mekanika otot, istilah "pasif" dan "aktif" digunakan untuk membedakan gaya otot yang diregangkan tetapi tidak diaktifkan oleh rangsangan listrik/potensial aksi (dan peningkatan Ca2+ bebas intraseluler yang diakibatkannya) dari gaya otot yang berkembang karena kopling eksitasi-kontraksi. Namun, "pasif" dalam konteks ini jangan disamakan dengan "kurang penting". Berbagai penelitian yang dilakukan selama beberapa tahun terakhir menunjukkan bahwa gaya otot pasif dan aktif terkait lebih erat daripada yang diperkirakan sebelumnya dan bahwa, misalnya, tingkat gaya pasif mengatur sifat kontraktil aktif (1, 32, 48). Hubungan ini sebagian dihasilkan dari susunan unik miofilamen utama dalam unit kontraktil, sarkomer, yang terdiri dari filamen tebal berbasis miosin, filamen tipis berbasis aktin, dan filamen elastis berbasis titin (Gbr. 1, atas). ANITA

6. Meskipun terdapat hubungan struktural dan fungsional yang jelas antara miofilamen-miofilamen tersebut, bidang ini seringkali masih memisahkan gaya "pasif" berbasis titin dari gaya "aktif" berbasis aktomiosin. Kami telah menganjurkan pandangan bahwa saling ketergantungan antara sifat mekanis titin dan aktomiosin dalam sarkomer berfungsi untuk mengoptimalkan kontraksi otot (14, 48, 78).

7. Sebagian besar gaya pasif otot saat diregangkan dihasilkan oleh titin, suatu protein raksasa dengan massa molekul 3–4 MDa (Gbr. 1). Gaya berbasis titin secara langsung maupun tidak langsung berkontribusi dan memodulasi tegangan aktif (48). Lebih lanjut, perubahan konformasi yang menyertai peregangan pegas titin dapat memicu peristiwa pensinyalan mekanis di miosit yang menyebabkan, misalnya, peningkatan degradasi protein otot dan aktivasi sintesis protein (55). Dalam tinjauan mini ini, kami memberikan informasi terbaru tentang mekanisme molekuler ekstensibilitas titin di sarkomer dan menunjukkan bagaimana wawasan baru tentang sifat-sifat ini menunjukkan peran yang lebih aktif bagi protein dalam pengembangan gaya. Kami kemudian menyoroti mekanisme yang terbukti secara akut memodulasi kekakuan pegas titin pada otot rangka, termasuk pengikatan chaperone, modifikasi pascatranslasi, pengikatan Ca2+, dan interaksi aktin-titin. Kami membahas mekanisme mana dari mekanisme-mekanisme ini yang dapat berkontribusi pada peningkatan produksi gaya dalam kontraksi otot yang memanjang secara aktif (eksentrik), sebuah fenomena yang gagal dijelaskan oleh sifat-sifat aktomiosin (27). Penelitian yang diulas di sini mengarahkan kami untuk menyimpulkan bahwa titin merupakan penentu stres otot, yang sifat-sifat mekanisnya sangat diatur. Karakteristik ini menempatkan titin pada posisi unik untuk bertindak sebagai mekanosensor dalam sel otot rangka. ANITA

8. Gambar 1. Tata letak dan arsitektur domain filamen titin pada sarkomer otot rangka. Atas: skema sarkomer 3-filamen yang menyoroti filamen miosin, aktin, dan titin. Tengah: domain protein yang diekspresikan dalam isoform N2A dari titin otot rangka (urutan konsensus). Segmen titin yang disambung secara diferensial ditunjukkan. FnIII, mirip fibronektin tipe-III; Ig, mirip imunoglobulin; PEVK, protein do main yang kaya akan residu prolin, asam glutamat, valin, dan lisin; TK, titin kinase. Bawah: tata letak pegas titin (urutan konsensus isoform N2A) pada setengah sarkomer. Kode warna domain titin seperti pada panel tengah. Perhatikan bahwa terdapat jeda yang disisipkan di wilayah pita A dekat pita M, yang menunjukkan bahwa segmen pita A jauh lebih panjang daripada yang sebenarnya ditunjukkan.

9. ELEMEN PEGAS TITIN YANG AKTIF SECARA MEKANIS

10. EKSTENSI DAN PEMBENTUKAN LIPATAN DOMAIN IG Ketika sarkomer otot rangka diregangkan secara "pasif",misalnya, oleh otot antagonis atau gaya gravitasi, segmen domain Ig titin dan daerah PEVK meregang secara berurutan (Gbr. 2). Tanpa adanya gaya eksternal, pada Panjang longgar, domain Ig berada dalam keadaan lipatan aslinya dan daerah penghubung antar domain mengadopsi konfigurasi bengkok [analogi "penggaris tukang kayu" (91)]. Domain PEVK tidak meregang. Ketika gaya rendah diterapkan untuk meregangkan sarkomer, daerah penghubung yang menghubungkan domain Ig akan diluruskan; domain-domain tersebut masih terlipat (53). Hal ini memberikan ekstensibilitas awal pada gaya rendah (Gbr. 2) (53, 56). Ketika gaya regangan meningkat lebih lanjut, domain PEVK mulai meregang dan memberikan ekstensibilitas yang memadai (52, 53, 56, 84). Gaya pegas segmen-segmen titin ini terutama muncul dari elastisitas entropiknya (34, 77, 86), meskipun faktor-faktor tambahan, seperti interaksi elektrostatik, mungkin penting bagi elastisitas PEVK (52, 65). Model teori elastisitas entropic berhasil diterapkan untuk menggambarkan secara kuantitatif mekanisme ekstensi bertahap pegas titin di sarkomer (44, 52, 56, 84).

11. Gambar 2. Model mutakhir ekstensi dan kontraksi pegas titin diferensial pada peregangan dan pelepasan sarkomer, masing-masing, dan tingkat gaya/molekul titin yang ditemukan. Skema utama menggambarkan pelurusan awal segmen domain mirip imunoglobulin (Ig) dari tampilan melengkung pada gaya regangan rendah (F), diikuti oleh penguraian domain protein yang kaya akan residu prolin, asam glutamat, valin, dan lisin (PEVK) pada gaya regangan menengah dan tinggi. Probabilitas penguraian domain Ig individual meningkat seiring dengan gaya regangan dan menjadi signifikan secara fisiologis pada gaya ≥ 4 pN/titin. Setelah dilepaskan, domain Ig yang terurai melakukan kontraksi pelipatan di bawah gaya, yang menghasilkan kerja selama transisi ke keadaan globul cair/kolaps (yang dihemat selama penguraian). Keadaan terlipat asli membutuhkan waktu yang relatif lebih lama untuk dicapai. Sisipan, hubungan antara molekul gaya/titin dan ekstensi sarkomer relatif. Kontribusi segmen domain Ig (pelurusan; pembukaan modul individual) dan wilayah PEVK pada panjang masing-masing ditunjukkan.

12. PELUNCURAN ULANG DOMAIN TITIN IG DI BAWAH GAYA: SUMBER PRODUKSI KERJA PADA OTOT

13. Pelipatan ulang domain titin Ig di sarkomer memiliki implikasi luas bagi fungsi miosit, karena pemendekan melawan gaya menghasilkan kerja. Kerja mekanis dihasilkan sebelum domain titin mencapai keadaan terlipat asli, khususnya, saat transisi dari keadaan tidak terlipat ke keadaan globul kolaps/cair (Gbr. 2) (14, 60, 78). [Sebagai perbandingan, mekanisme pelipatan hanya mencakup intermediet pelipatan yang sangat singkat, jika ada (59).] Berdasarkan temuan ini, telah disarankan bahwa titin menghasilkan sejumlah tertentu dari total kerja yang dihasilkan oleh otot yang berkontraksi (78). Pertimbangan teoretis mengungkapkan bahwa titin memulihkan energi yang tersimpan saat diregangkan hanya dalam derajat yang kecil melalui rekoil entropik, sementara sebagian besar dikembalikan melalui kontraksi pelipatan titin (14).

14. ANITA Pentingnya kontraksi pelipatan titin bagi fungsi mekanis otot telah diulas secara ekstensif baru-baru ini (14, 48). Apakah pelipatan-pembukaan titin memberikan otot utuh "keunggulan" ekstra belum diketahui dan akan menjadi topik yang menarik untuk dieksplorasi di masa mendatang. Berbagai masalah dalam skenario di atas memerlukan studi lebih lanjut. Misalnya, perlu dipastikan bahwa tingkat SL/gaya dalam sel otot yang diregangkan secara pasif cukup tinggi dan bervariasi sehingga memungkinkan terjadinya pelipatan-pembukaan kembali Ig titin yang substansial.

15. KEKAKUAN PEGAS TITIN DAPAT DISESUAIKAN OLEH BEBERAPA MEKANISME INDEPENDEN

16. Pengikatan Protein Kejut Panas dan Tegangan Pasif Berbasis Titin Pembukaan domain protein pada pegas titin berisiko menyebabkan kesalahan pelipatan dan agregasi, sehingga menyebabkan hilangnya fungsi protein. Memang, peristiwa kesalahan pelipatan telah dilaporkan untuk domain Ig titin yang diekspresikan secara rekombinan yang dibuka dengan peregangan dalam studi mekanis molekul tunggal, meskipun sebagian besar domain ini melipat ulang dengan benar (7, 67, 68). Namun, ketika domain Ig titin rekombinan dibuka secara kimiawi dalam eksperimen massal, domain tersebut akan beragregasi (37, 93). Berbeda dengan segmen Ig titin, wilayah PEVK memiliki sifat khas wilayah yang tidak teratur secara intrinsik (24), yang menghindari agregasi: wilayah ini diperkaya dengan residu pemecah struktur (prolin) dan bermuatan (glutamat, lisin), tanpa sistein dan asparagin, dan secara keseluruhan memiliki muatan bersih yang tinggi dan hidrofobisitas yang rendah, serta tidak memiliki sekuens agregasi (37). Oleh karena itu, segmen Ig titin, tetapi bukan wilayah PEVK, memerlukan perlindungan terhadap agregasi ketika mereka meregang/terbuka akibat tekanan mekanis pada sel otot.

17. Perlindungan ini disediakan oleh kelas chaperone spesifik, protein kejut panas kecil (sHSP), terutama HSP27 (HSPB1) dan B-kristalin (CryaB; HSPB5) (Gbr. 3), yang terbukti mengikat domain Ig titin pita-I tetapi tidak mengikat PEVK (37). Chaperone (independen ATP) ini sangat melimpah di sitosol sel otot. Chaperone ini selanjutnya diinduksi dan sering ditranslokasi ke sarkomer dalam berbagai kondisi stres, termasuk latihan eksentrik (72), strain miosit (37), penyakit otot bawaan (16, 88) [di mana pengikatan pada pita I sarkomer dapat masif (88)], penuaan (10), dan stres oksidatif atau asam (63). CryaB mencegah agregasi domain Ig yang terlipat secara kimiawi dari daerah Ig proksimal atau N2A titin dalam uji in vitro, di mana kecenderungan agregasi dan efek perlindungan oleh CryaB ditingkatkan oleh asidosis sedang (37). Keberadaan sHSP rekombinan dalam miosit berkulit yang diregangkan secara berlebihan dalam kondisi agak asam melindungi sel dari pengerasan patologis yang mungkin terjadi akibat agregasi titin intrasarkomer (37). Singkatnya, pengikatan sHSP pada daerah pegas titin yang tidak terlipat mungkin merupakan mekanisme perlindungan krusial pada miosit yang mengalami stres mekanis. Interaksi ini kemungkinan besar mencegah agregasi titin, mendorong pelipatan ulang domain Ig yang tidak terlipat dengan benar, dan dengan demikian bertindak sebagai tindakan perlindungan dini, dan juga dapat memberikan sinyal untuk degradasi titin yang ditargetkan pada akhirnya. ANITA

18. Pengikatan sHSP pada domain Ig titin pada miosit yang teregang tampaknya dipicu oleh paparan residu hidrofobik yang sebelumnya terkubur dalam rantai protein titin saat domain Ig terlipat (37). Namun, sHSP seperti CryaB mungkin juga dapat mengikat domain Ig titin yang terlipat (8, 37). Fungsi fisiologis dari interaksi semacam itu masih belum jelas, tetapi efek sampingnya tampaknya berupa peningkatan tegangan pasif berbasis titin yang ringan (Gbr. 3, sisipan, kiri atas) (88). Efek pengerasan ini dapat dijelaskan, secara teori, oleh peningkatan gaya pelipatan domain Ig titin dengan adanya CryaB, yang menghasilkan stabilisasi mekanis pegas titin (8), dan/atau oleh efek pengikatan sHSP pada elastisitas entropik titin. Bagaimanapun, pengikatan HSP pada pegas titin merupakan penyebab perubahan kekakuan berbasis titin.

19. Gambar 3. Tinjauan umum mekanisme yang diketahui memodulasi gaya berbasis titin pada sarkomer otot rangka. Selain itu, berbagai protein yang berinteraksi dengan titin digambarkan pada situs pengikatannya masing-masing pada titin. Beberapa molekul ini dapat mengalami perubahan konformasi saat titin diregangkan, memicu jalur pensinyalan mekanokimia yang diinduksi regangan yang mendorong pergantian protein otot. Peristiwa mekanosensori ini ditinjau secara rinci di tempat lain (47). ADP, adenosin difosfat; ATP, adenosin trifosfat; Ca2+, konsentrasi ion kalsium bebas; FHL2, protein 2 domain empat setengah LIM; G, glutation; H, atom hidrogen; HSP27, protein syok panas 27 (HSPB1); HSP90, protein syok panas 90; Ig, seperti imunoglobulin; MARP, protein pengulangan ankyrin otot; MuRF1/2, protein jari RING-1 dan -2 spesifik otot; MyBPC, protein pengikat miosin-C; Nbr1, tetangga protein gen BRCA1-1; P, fosfat anorganik; ROS, spesies oksigen reaktif; S, atom sulfur dalam sistein; sHSP, protein kejut panas kecil; Smyd2, domain SET dan MYND yang mengandung 2 protein (metiltransferase lisin); TK, domain titin kinase.

20. Modulasi Kekakuan Titin dengan Modifikasi Oksidatif

21. Stres oksidatif berkaitan dengan aktivitas otot yang intens dan dapat meningkat lebih lanjut pada otot miopati. Modifikasi oksidatif memengaruhi, antara lain, sifat mekanis sel otot melalui perubahan fungsi protein sarkomer (5). Pegas titin tampaknya menjadi target utama oksidasi (3, 19, 23), yang berfungsi untuk mengatur kekakuannya (Gbr. 3). Dua jenis modifikasi oksidatif berpotensi mengubah elastisitas titin pada miosit skelet, dan keduanya memerlukan pembukaan domain Ig titin pita-I. Yang pertama adalah tiolasi S-gluta sistein yang terekspos ketika domain Ig terekspos (sistein "kriptik") (3). Glutation membentuk disulfida campuran dengan situs titin yang terekspos, yang menghambat pembukaan kembali domain tersebut. Karena pelipatan domain Ig sebelumnya meningkatkan panjang kontur pegas titin sebesar ~30 nm, sehingga menurunkan gaya elastis titin, efek keseluruhan dari pencegahan pelipatan ulang domain Ig titin oleh S-glutathiolation Adalah penurunan gaya pasif berbasis titin yang tahan lama (namun reversibel) (Gbr. 3) (3). Mekanisme kedua melibatkan pembentukan jembatan disulfida yang diinduksi oksidan di dalam domain Ig titin yang terlipat secara mekanis (19). Ikatan intramolekular ini mengurangi Panjang wilayah Ig yang terlipat dan oleh karena itu diprediksi akan meningkatkan kekakuan pegas berbasis titin (Gbr. 3). Menariknya, banyak domain Ig yang disambung secara diferensial pada titin pita-I mengandung setidaknya tiga sistein (yang secara evolusioner terkonservasi dengan baik), yang memungkinkan terjadinya isomerisasi S-S (19). Bergantung pada isomer S-S mana yang terbentuk di dalam domain, panjang bebas segmen yang tidak terlipat bisa lebih pendek atau lebih panjang, yang menyiratkan mode tambahan regulasi elastisitas titin melalui oksidasi. Peran oksidasi domain Ig dalam modulasi elastisitas titin in vivo masih belum diketahui. Uji coba penting adalah mempelajari apakah peregangan otot di bawah stres oksidatif benar-benar meningkatkan oksidasi domain Ig pada titin pita-I.

22. Peningkatan Kekakuan Melalui Pengikatan Ca2+ pada Elemen Pegas Titin Kalsium berikatan dengan segmen kaya glutamat di dalam bagian titin yang tersambung secara diferensial pada wilayah PEVK (42). Karena subsegmen PEVK ini bermuatan negatif (tidak seperti bagian PEVK yang diekspresikan secara konstitutif, yang memiliki muatan bersih positif ), pengikatan Ca2+ akan meningkatkan daya tarik intramolekul di dalam subdomain ini, sehingga meningkatkan gaya berbasis titin sebagai respons terhadap peregangan (Gbr. 3). Peningkatan stabilitas mekanis juga dilaporkan untuk domain Ig titin distal ketika domain tersebut dibentangkan dalam pengukuran mekanis molekul tunggal dengan adanya Ca2+ bebas, yang juga dapat menyebabkan pengerasan titin pada sarkomer (12). Peningkatan kekakuan yang signifikan teramati pada miofibril rangka tunggal yang teregang secara mekanis (hingga melampaui tumpang tindih filamen aktin dan miosin) dalam buffer aktivasi Ca2+ tinggi versus Ca2+ rendah dan diduga sebagian disebabkan oleh pengikatan Ca2+ ke titin (15%) tetapi sebagian besar disebabkan oleh interaksi titin dengan filamen aktin yang dipromosikan oleh Ca2+ (85%) (28, 73)..

23. Namun, karena peregangan sarkomer yang berlebihan menyebabkan hilangnya struktur sarkomer yang teratur, misalnya, terlepasnya titin pita-A dari miosin (49, 53, 92), peningkatan kekakuan yang besar yang terlihat dengan adanya Ca2+ tinggi bisa jadi merupakan artefak eksperimental. Namun demikian, sedikit peningkatan kekakuan berbasis titin diperkirakan berasal dari pengikatan Ca2+ ke PEVK (42) dan domain Ig (12), yang tampaknya merupakan interpretasi konsensus di lapangan. Mekanisme penguatan titin akibat pengikatan Ca2+ ini dapat menjelaskan peningkatan ketegangan dan kekakuan struktur non-jembatan silang selama masuknya Ca2+ ke otot rangka aktif (4, 9, 66, 76). Mekanisme ini mungkin bertanggung jawab atas sebagian kecil peningkatan gaya sisa pada otot yang diregangkan secara aktif (48), yang merupakan karakteristik kontraksi otot eksentrik tetapi tidak dijelaskan oleh teori filamen geser dan jembatan silang (27).

24. Pengikatan Aktin-Titin dan Gaya Viskoelastis di Sarkomer: Regulasi oleh Ca2+ ? Titin berikatan di beberapa tempat di sepanjang panjangnya dengan filamen aktin sarkomer, terutama di tepi cakram Z, yang berfungsi sebagai penjangkar (51, 83). Selain itu, baik subsegmen PEVK yang disambung secara diferensial maupun yang diekspresikan secara konstitutif, tetapi bukan domain Ig pada titin pita-I atau beberapa domain Ig/FnIII pada titin pita-A, berinteraksi dengan filamen aktin (6, 41, 51, 54, 64, 94). ANITA Hasil yang bertentangan telah diperoleh mengenai kecenderungan elemen N2A untuk mengikat filamen aktin. Penelitian sebelumnya tidak menemukan bukti pengikatan ini dalam "uji kompetisi", di mana fragmen titin N2A rekombinan ditambahkan ke miofibril tunggal yang terisolasi dan kemungkinan efeknya terhadap kekakuan pasif diukur (51).

25. Sebaliknya, penelitian terbaru mendemonstrasikan interaksi antara aktin dan fragmen N2A rekombinan melalui uji kosedimentasi, pengukuran gaya pecah menggunakan spektroskopi gaya molekul tunggal, dan uji motilitas aktin miosin in vitro (11). Di mana pun tepatnya interaksi utama titin pita-I dengan filamen aktin terjadi, asosiasi (yang relatif lemah) ini merupakan sumber gaya hambat viskos di sarkomer (Gbr. 3) (41) dan dapat memperpendek panjang efektif pegas titin pada sarkomer yang rileks (64), yang juga akan meningkatkan viskoelastisitas (6). Untuk mendukung saran ini, terdapat penurunan resistensi viskos internal terhadap pemendekan pasif pada sarkomer setelah pembelahan filamen aktin (69). Menariknya, interaksi aktin-titin bergantung, hingga tingkat yang bervariasi, pada konsentrasi ion Ca2+ bebas (11, 33, 41, 54). Studi paling awal yang menguji efek fungsional interaksi antara filamen aktin dan titin asli yang diisolasi (dengan mengamati pergeseran filamen aktin dalam uji motilitas aktin-miosin in vitro) menunjukkan bahwa interaksi ini meningkat dengan adanya kadar Ca2+ fisiologis (33). ANITA

26. Gagasan tentang interaksi yang lebih kuat antara wilayah pegas aktin dan titin yang terjadi ketika Ca2+ dinaikkan ke tingkat fisiologis yang lebih tinggi telah ada sejak lama (28, 46), tetapi tanpa bukti kuat yang mendukungnya. Peningkatan interaksi N2A-aktin yang bergantung pada Ca2+ dengan demikian merupakan petunjuk pertama bahwa pengerasan pegas titin dapat terjadi pada otot yang berkontraksi aktif dibandingkan otot yang tidak teraktivasi melalui peningkatan interaksi dengan aktin. Sejak itu, berbagai studi telah mengukur dampak Ca2+ pada interaksi antara aktin dan fragmen rekombinan dari segmen pegas titin elastis atau dari titin pita-A, dengan hasil yang berbeda-beda. Beberapa studi menemukan bahwa kadar Ca2+ fisiologis tidak berpengaruh pada interaksi (51, 64, 94). Studi lain menemukan bahwa keberadaan Ca2+ membuat interaksi antara aktin dan titin PEVK (terutama subfragmen konstitutif) lebih lemah (41, 54). Penurunan ini konsisten dengan hasil studi terbaru yang menyelidiki ekstensi segmental elemen pegas titin dengan peregangan dalam kondisi pasif dan teraktivasi Ca2+, yang mengungkapkan wilayah PEVK yang lebih mudah diregangkan dengan adanya Ca2+ (13). Hasil baru adalah peningkatan kekuatan pengikatan aktin elemen N2A titin ketika Ca2+ ada (11).

27. Namun, masalah ini masih sangat kontroversial: studi terbaru lainnya menyimpulkan bahwa wilayah PEVK tidak berinteraksi dengan aktin selama peregangan aktif (13). Dengan demikian, saat ini terdapat dasar yang lemah untuk usulan (28, 46) bahwa pengikatan aktin-titin yang dipicu oleh Ca2+ berkontribusi secara substansial terhadap peningkatan gaya pada otot yang diregangkan secara aktif, yaitu, dalam kontraksi eksentrik. Ca2+ masih dapat memengaruhi interaksi antara aktin dan titin di wilayah yang belum diuji, misalnya, di segmen pita-A. Singkatnya, terdapat bukti kuat bahwa aktin dan titin berinteraksi di dalam sarkomer, termasuk di pita I. Secara fungsional, interaksi ini meningkatkan viskoelastisitas berbasis titin di dalam sarkomer. Masih kurang pasti apakah kadar Ca2+ yang relevan secara fisiologis mengubah kekuatan ikatan antara elemen pegas titin dan filamen aktin. Hal ini tetap menjadi area yang menarik untuk penelitian di masa mendatang.

28. Dapat dikatakan bahwa mekanisme regulasi yang paling banyak dipelajari yang memodulasi gaya berbasis titin pada otot jantung adalah fosforilasi (26,30, 38 – 40, 75, 95). Fokus studi ini adalah satu-satunya segmen spesifik jantung pada titin, yang dikenal sebagai elemen N2B (dikodekan oleh ekson TTN 49), yang disambungkan pada isoform titin otot rangka. Dengan demikian, regulasi kekakuan yang bergantung pada fosforilasi pada wilayah titin ini tidak berlaku untuk miosit rangka. Namun, titin otot rangka telah lama diketahui dapat difosforilasi secara in vivo (81), dan terdapat ratusan fosfosit potensial di wilayah titin yang terdapat dalam otot rangka (25). Pengukuran fosforilasi titin total pada otot rangka menunjukkan tingkat perubahan yang bervariasi dalam berbagai kondisi stres, termasuk pelepasan muatan selama penerbangan luar angkasa 30 hari [hiperfosforilasi pada m. gastrocnemius tikus (87)], hibernasi [fosforilasi konstan pada beruang coklat hibernasi (80)], konsumsi alkohol kronis selama 6 bulan [hiperfosforilasi pada m. gastrocnemius dan m. soleus tikus (22)], atau bentuk miopati yang diwariskan [hipofosforilasi pada m. vastus lateralis pasien manusia vs. subjek sehat (88)]. Beberapa perubahan ini diduga memicu peningkatan degradasi proteolitik titin, yang kemudian berkontribusi pada perkembangan atrofi otot rangka (79). Modulasi Kekakuan Titin melalui Fosforilasi ANITA

29. Berbagai penelitian lain menunjukkan bahwa perubahan keadaan fosforilasi titin pita-I memodifikasi gaya pegas berbasis titin pada miosit skelet (Gbr. 3), seperti halnya pada kardiomiosit (31, 58, 62, 71, 88, 90). Sejumlah fosfosit yang terkonservasi secara evolusioner diidentifikasi dalam subsegmen PEVK titin yang diekspresikan secara konstitutif, dikonfirmasi oleh deteksi berbasis fosfoantibodi dan terlibat dalam modulasi gaya pegas titin (26, 29, 30, 88). Fosfosit juga terdeteksi dalam elemen N2A (38, 58). Beberapa penelitian menunjukkan perubahan tingkat fosforilasi dua serin dalam domain PEVK, S11878 dan S12022, yang diketahui sebagai substrat protein kinase C alfa dan kinase IIteta yang bergantung kalsium/kalmodulin (26, 30). Peningkatan fosforilasi pada situs-situs ini dalam subsegmen PEVK (bermuatan positif) meningkatkan kekakuan berbasis titin (Gbr. 3) (30). Peningkatan fosforilasi setidaknya pada salah satu situs ini dapat menjelaskan peningkatan kekakuan miofiber yang ditemukan dalam berbagai kondisi fisiologis dan patologis, seperti pada otot pasien dengan sindrom Ehlers-Danlos akibat defisiensi protein matriks ekstraseluler tenascin-X (71), pada otot diafragma tikus setelah latihan fisik (31), dan pada m. vastus lateralis tikus setelah latihan fisik akut (62). Sebaliknya, penurunan fosforilasi situs PEVK ini yang diamati pada otot vastus lateralis pasien miopati kronis dibandingkan subjek sehat (88) dapat menjadi mekanisme kompensasi yang berupaya mengurangi peningkatan kekakuan myofiber akibat pengikatan chaperone masif pada titin pita-I. Sebagai simpulan, fosforilasi situs PEVK memodulasi gaya berbasis titin pada otot rangka. Perubahan status fosforilasi domain PEVK diamati setelah latihan akut dan pada penyakit otot dan berhubungan dengan perubahan kekakuan otot. ANITA

30. Perubahan akut atau kronis pada tingkat gaya elastis titin, melalui salah satu mekanisme yang dibahas di atas, berpotensi untuk memulai jalur pensinyalan mekano-kimia pada miosit skelet. Melalui berbagai interaksi dengan beragam molekul (Gbr. 3), titin dapat bertindak sebagai mekanosensor yang bonafide. Mekanisme mekanosensori yang disarankan yang dipicu oleh titin telah diulas secara rinci di tempat lain (18, 36, 47, 48, 55, 58, 70) dan tidak dibahas di sini. Jalur-jalur ini terlibat dalam regulasi pergantian protein otot dan mencakup kaskade pensinyalan prohipertrofik dan antihipertrofik, serta sistem ubikuitin-proteasom dan mesin degradasi protein autofagi-lisosomal. Selain itu, titin tampaknya merupakan bagian integral dari sistem mekanosensori baru yang berfungsi di pita sarkomer A, yang dapat bertanggung jawab atas aktivasi otot yang bergantung pada panjang (48). Dengan demikian, tingkat gaya "pasif" berbasis titin dapat diterjemahkan secara lebih langsung menjadi tingkat gaya "aktif" berbasis aktomiosin. KEKAKUAN BERBASIS TITIN YANG BERUBAH DAPAT MEMICU JALUR PENSINYALAN MEKANO-KIMIA ANITA

31. Penelitian yang diulas di atas tidak menyisakan keraguan bahwa protein raksasa titin merupakan penentu utama kekuatan otot, baik dalam keadaan nonaktif maupun aktif. Peran mekanis titin dalam sarkomer, yang sebelumnya digambarkan sebagai "pasif", jauh melampaui peran sebagai elastomer seperti karet, karena protein ini merupakan pegas "pasif" sekaligus pembangkit kerja kontraktil "aktif" melalui kontraksi pelipatan domain Ig. KESIMPULAN

32. Sifat mekanis pegas titin dapat diatur secara akut oleh berbagai mekanisme, yang meliputi modifikasi pascatranslasi dan pengikatan chaperone, Ca2+, atau aktin sarkomer. Perubahan ini, Bersama dengan konektivitas tinggi dengan protein lain dalam miosit, memunculkan fungsi mekanosensor titin yang kemungkinan diaktifkan secara dinamis, bergantung pada Tingkat perubahan kekuatan pegas titin. Tantangan bagi penelitian di masa mendatang adalah menjelaskan mekanisme molekuler dari jalur mekanosensing yang dipicu oleh gaya titin ini, serta peran titin dan interaksinya dalam kontraksi otot eksentrik. ANITA

33. Thank you for listening