UNA BREVE REVISION DEL PCR EN TIEMPO REAL

UNA BREVE REVISIION DEL PCR EN TIEMPO REAL

1. PCR en Tiempo Real

2. Repasemos…
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Técnica que permite copiar o replicar millones de veces
pequeñas cantidades de ADN in vitro.
MUY SENSIBLE
Y
MUY ESPECÍFICA

3. PCR
Molécula de
ADN (molde)
dNTPs (A;G;T;C)
ADN polimerasa
termoestable
Cofactor Mg2+
Cebador sentido Cebador Antisentido
PCR

4. Tres pasos básicos
Desnaturalización
Apareamiento
Elongación
Primers
complementarios
PCR

5. PCR

6. PCR
Verificación del producto de PCR
en gel de agarosa
Productos de PCRMarcador de tamaño molecular

7. ¿La PCR puede ser
cuantitativa?

8. En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación
y detección se producen de manera simultánea en el
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción
posterior.
Además, mediante detección por fluorescencia se
puede medir durante la amplificación la cantidad de
ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión
de fluorescencia producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de ADN formado.
PCR en Tiempo Real

9. Northern Blot PCR tradicional
•Gold Standard
•No requieren
amplificación
•Grandes
cantidades de
ARN
•Radioactividad
PCR en tiempo real
•Semi-
cuantitativa
•Requiere
amplificación
•Pequeñas
cantidades de
ARN
•Sensible
•Cuantitativa
•Requiere
amplificación
•Pequeñas
cantidades de
ARN
•Sensible

10. PCR en tiempo real: Pasos
Aislamiento y Caracterización ARN
Síntesis de cDNA
Adquisición datos de Real Time PCR
Generación de factores de normalización
Datos normalizados
Análisis de Datos
PCR en Tiempo Real: Pasos

11. PCR en tiempo real
Aislamiento y Caracterización del ARN
Muestra
Extracción de
ARN
28 S
18 S
28 S
18 S
5 S
5 S
PCR en Tiempo Real

12. PCR en tiempo real
mRNA cDNA
Retrovirus
Transcriptasa Reversa hace el cDNA complementario del RNA
PCR en Tiempo Real

13. PCR en tiempo real
mRNA cDNA
Transcripción Reversa (RT-PCR)
OligodT se
une al mARN
Copia de la primera
hebra de cDNA
Copia de la segunda
hebra de cDNA
Digestión y
desplazamiento
del mARN
PCR en Tiempo Real

14. Molécula de
ADN (molde)
dNTPs (A;G;T;C)
ADN polimerasa
termoestable
Cofactor Mg2+
Cebador sentido Cebador Antisentido
PCR en Tiempo Real
DETECCIÓN: AGENTES
INTERCALANTES O SONDAS

15. Métodos de Detección
•Agentes intercalantes
•Sondas de Hibridación
PCR en tiempo real

16. Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN
•Unión al surco menor del ADN doble cadena.
•Emite fluorescencia cuando está unido al ADN doble
cadena (dsADN).
•La intensidad de fluorescencia aumenta
proporcionalmente a la concentración de dsADN.
PCR en tiempo real

17. Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN
•No se unen de manera secuencia-específica, pueden generar falsos positivos.
•Se puede usar un colorante para evaluar varios genes.
•No se puede usar para reacciones en multiplex.
•Los diferentes productos de PCR se reflejan en la temperatura de melting(Tm).
PCR en tiempo real

18. Sondas de Hibridación
•Senecesitan2primersydossondasespecíficasdesecuencia.
•Lassondasseunenenunarreglocabezaconcola.
•Laprimerasonda(upstream)estámarcadaconunfluoróforo
donante(D)enelextremo3´.Lasegundasonda(downstream)está
marcadaconunfluoróforoaceptor(A)enelextremo5´.
Fluoróforo Donante
Fluoróforo Aceptor
PCR en tiempo real

19. Sondas de Hibridación
•Cuandoseunen,losfluoróforosexperimentanuna
transferenciadeenergía(FRET)delfluoróforo
donantealaceptorconaumentodefluorescencia.
PCR en tiempo real

20. Sondas de Hidrólisis: Sondas TaqMan
•Lasondasehibridaconelamplicónblanco.
•Seencuentrabloqueadaenelextremo
3´(fosforilada,nopuedeseramplificadoporla
polimerasa).
•Tienedoscolorantesfluorescentesunidos
(R=reporteroyQ=quencher).
•ElQreducelaintensidaddefluorescencia
delreporterocuandolasondaestáintacta.
PCR en tiempo real

21. •Método consiste de 2 primersy dos
sondas específicas de secuencia.
•Sirve para evaluar múltiples genes con
distintos colorantes (multiplex).
Desnaturalización
Pegado de primers y sondas
Extensión por la ADN Polimerasa
Extensión por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero
Fluorescencia
Sondas de Hidrólisis: Sondas TaqMan
PCR en tiempo real

22. Molecular Beacons
•Esunasondaenhorquilla.
•Tieneunaregiónespecíficadesecuencia
flanqueadapordosrepeticionesinvertidas.
•Losfluoróforosreporteroyquencherestán
unidosalosextremos,reduciendola
fluorescenciacuandoestálibreensolución.
•Cuandoseunenalasecuencia,elQyelRse
separan,permitiendolaemisiómdelR.
PCR en tiempo real

23. Molecular Beacons
•Tienenmayorsensibilidadquelassondaslineares.
•Aplicación:Discriminacióndealelosconfluoróforosdistintos.
PCR en tiempo real

24. PCR en Tiempo Real

25. •ElsistemaderealtimePCRsebasaenladetecciónycuantificaciónde
unreporterofluorescente.
•PuedemonitorearselareaccióndePCRenlafaseexponencial.
•Seutilizanaparatos,placasyprogramasespecialesparallevaracabo
lareacciónyanálisisdedatos.
PCR en Tiempo Real

26. •Lasreaccionessecaracterizanporelpuntoenel
tiempo(ciclodePCR)dondelaamplificaciónes
detectadaporprimeravez:C
toC
p.
•ElC
teseltiempoalcuallaintensidaddefluorescencia
esmayorquelafluorescenciadefondo(umbralde
detección=threshold).
Fase Exponencial
Fase Plateau
PCR en Tiempo Real

27. •CuantomayorcantidaddeADNinicial,habráun
aumentomásrápidodelaseñalfluorescente,resultando
enunC
tmásbajo.
PCR en Tiempo Real

28. Cuantificación Absoluta
•Sedeterminalaconcentracióndelasmuestras.
•Senecesitaunestándar(ARN,ADNocADN)cuyaconcentraciónse
conozcacontotalexactitud.
•Serealizaunacurvadedilucionesconlasconcentracionesconocidas
delestándar.
•SeintrapolaelvalordeCtobtenidoparaconocerlaconcentraciónde
ADNinicialdelamuestra.
•Seutilizaparadeterminarlacargaviraldeunamuestra.
PCR en Tiempo Real

29. Cuantificación Relativa
•Senecesitauncontrolinternoocalibrador(housekeepinggene).
•Sedeterminacambiosenelniveldeexpresióndelasmuestras
basadosenunamuestradereferenciaoestándar.
•Seutilizaparacompararlosnivelesdeexpresióndeun
determinadogenenmuestrasdiferentes(porejemplotratadaso
no).
PCR en Tiempo Real

30. PCR tradicional vs. PCR en tiempo real

31. Beneficios
•No requiere manipulación post-amplificación.
•Método muy sensible.
•Puede detectar una simple copia de un transcripto específico.
•Puede detectar diferencias de expresión menores al 23%.
•Requiere menos cantidad de RNA.
Desventajas
•Requiereequipamientoyreactivosmuycostosos.
•Debidoasualtasensibilidad,senecesitauncorrectodiseño
experimentalytécnicasdenormalizaciónparaobtener
conclusionesprecisas.
PCR en tiempo real

32. PCR en tiempo real
Aplicaciones en Investigación
DNA:
•Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas.
•Genotipificaciónde cepas o subespecies
•Detección de mutaciones puntuales
•Estudio de depolimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
•Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células
iniciales en una muestra.
RNA:
•Detección de la expresión de genes
•Efecto de mutaciones sobre la expresión
•Análisis de mRNAsvariantes producidos por procesamiento diferencial
•Cuantificación de la expresión
PCR en tiempo real

33. PCR en tiempo real
Aplicaciones en Diagnóstico Clínico
Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos:
Virales (carga viral, carga pro-viral)
Bacterianos
Protozoarios
Hongos
Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos)
Detección de genes de resistencia –mejor elección de terapia
Monitoreo de terapia (enfermedad residual -recaída)
Detección de marcadores tumorales
Estado del desarrollo / progresión de la enfermedad
PCR en tiempo real

34. LightCycler® SeptiFastTest MGRADE
-Resultado en 6 horas
-1.5 ml de sangre
-Sin incubación previa
Aplicaciones de la Real TimePCR en el
diagnóstico de la sepsis neonatal

35. Probe Tm
E. Coli 52ºC
P. Aeruginosa 57ºC

36. COBAS® AMPLICOR CT/NG Test (Roche ®)
Test cualitativo para la detección de C. Trachomatis y N.
gonorrhoeae
Muestras:orina, hisopados endocervicales
y uretrales
1) Amplificación de las secuencias blanco mediante Real
TimePCR con cebadores específicos
2) Hibridación con sondas específicas para los dos agentes
3) Detección de los amplicones unidos a la sonda mediante
una determinación colorimétrica
Aplicaciones de la Real TimePCR en el diagnóstico de la
infección por C. Trachomatis y N. gonorrhoeae

37. Aplicaciones de la Real TimePCR en la determinación de
la variante del rs12979860 del gen IL28B
PREDICE LA
RESPUESTA AL
TRATAMIENTO
ANTIVIRAL EN
PACIENTES HCV +