Unidad 3_Alineamiento II.pdf aplicados a la ingeniería de proteínas

alineamiento multiple de secuencias

1. Unidad 3: Alineamiento de secuencias II
Bloque I
Bioquímica e ingeniería de proteínas
Bloque I

2. Introducción
! Multiple Sequence Alignment (MSA)
! Hemos visto cómo comparar una secuencia con otra
(alineamiento de pares)
! Hemos visto cómo comparar una secuencia con muchas
otras en una BD (muchos alineamientos de pares - BLAST)
! Ahora veremos cómo comparar múltiples secuencias
simultáneamente, no de dos en dos.
3
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

3. Tipos de alineamientos en función de número de
secuencias a comparar
1.- Alineamiento de dos secuencias
2.- Alineamiento múltiple de secuencias (AMS)
Tipos de alineamiento
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

4. Los aa importantes para el mantenimiento de la estructura y/o función de la
proteína se encuentran bajo presión evolutiva: o se conservan o, si cambian,
lo hacen por aa parecidos. Un alineamiento múltiple de secuencias (AMS) de
proteínas homólogas permite identificar estos aa.
Si dos secuencias están muy próximas en
la evolución, habrán cambiado muy poco y
será difícil detectar qué aa son los
realmente importantes
Alineamiento de dos secuencias
Bloque I: Alineamiento de secuenciasBloque I: Alineamiento de secuencia II

5. Los aa importantes para el mantenimiento de la estructura y/o función de la
proteína se encuentran bajo presión evolutiva: o se conservan o, si cambian,
lo hacen por aa parecidos. Un alineamiento múltiple de secuencias (AMS) de
proteínas homólogas permite identificar estos aa.
Si dos secuencias están muy próximas en
la evolución, habrán cambiado muy poco y
será difícil detectar qué aa son los
realmente importantes
Si dos secuencias
están muy lejanas
será difícil hacer un
alineamiento capaz de
detectar los residuos
importantes.
Alineamiento de dos secuencias

6. Los aa importantes para el mantenimiento de la estructura y/o función de la
proteína se encuentran bajo presión evolutiva: o se conservan o, si cambian,
lo hacen por aa parecidos. Un alineamiento múltiple de secuencias (AMS) de
proteínas homólogas permite identificar estos aa.
Si dos secuencias están muy próximas en
la evolución, habrán cambiado muy poco y
será difícil detectar qué aa son los
realmente importantes
Si dos secuencias
están muy lejanas
será difícil hacer
un alineamiento
capaz de detectar
los residuos
importantes.
Este problema se
puede resolver
alineando el mayor
número posible de
secuencias
homólogas.
Alineamiento de dos secuencias
Bloque I: Alineamiento de secuenciasBloque I: Alineamiento de secuencia II

7. Bloque I: Alineamiento de secuenciasBloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento múltiple secuencias (AMS)

8. La fortaleza de los AMS
El AMS permite identificar los residuos conservados que
resultan cruciales para mantener la estructura y/o función.
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Mo#vo DFG

9. MSA
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
El AMS permite identificar homologías.

10. Análisis de secuencias (alineamiento múltiple)
Cuanto más similares sean dos secuencias, más similares tenderán a ser
también las funciones de las proteínas. Identidades, cambios conservativos/
cambios no conservativos
Normalmente dos secuencias tienen una alta similitud porque son homólogas,
es decir comparten un ancestro común. Cuanto más tiempo pase desde el
último antecesor común más diferentes serán las secuencias
La acumulación de mutaciones a lo largo del tiempo es la causa de que las
secuencias de una misma proteína en dos especies distintas no sean idénticas.
Utilidad de los alineamientos múltiples. Pueden servir para varias cosas,
entre las que a nosotros nos puede interesar:
Identificar dominios funcionales.
Identificar sitios potencialmente mutables para mejorar
Los aa conservados van a ser más importante para el
mantenimiento de la estructura/función de una proteína
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

11. AMS: a tener en cuenta1
2
3
4
5
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

12. Distintos grados de conservaciónAlineamiento AMS
Bloque I:Alineamiento de secuencias
Aminoácidosidénticos
Sustitucionesconservadoras
Sustituciones noconservadoras
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote
HumanoCachalote84%identidad94%incluyendocambiosconservadores
Comparacióndelassecuenciasdeaminoácidosdelasmioglobinashumanaydecachalote
Comparación de secuencias de proteínas
→ cambios su5les
→ cambios estructurales y/o funcionales
Mismatch
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Puntuación del
0 al 9

13. 1. Siempre que puedas, u0liza proteínas.
2. Empieza con un número pequeño de secuencias (5-10), y luego
añadir de forma progresiva.
3. No puedo alinear secuencias muy diferentes, por lo que
descartamos aquellas que coincidan menos del 30%. Una buena idea
es que la secuencia tenga un parecido entre el 30 y 70% con, al menos,
la mitad de las secuencias con las que quiero trabajar.
4. No es bueno u<lizar secuencias con longitudes muy dis<ntas,
porque la herramienta 0ende a expandir las secuencias y va a meter
huecos por todas partes.
5. Las secuencias proceden de proteínas homologas.
¿Qué pautas sigo para seleccionar las secuencias a incluir en un AMS?
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

14. Pasos básicos
! Para hacer un alineamiento, generalmente necesitamos
seleccionar:
1. Las secuencias homólogas a alinear
2. El software que utilice una función de puntuación óptima
3. Los parámetros adecuados (fundamentalmente huecos)
! No hay un alineamiento perfecto
! Las secuencias evolucionan más rápido que las estructuras o
funcionalidades (la secuencia puede variar y la estructura o
función seguir invariante)
6
Pasos básicos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

15. Algoritmos
! Existen cinco aproximaciones algorítmicas distintas al MSA
1. Métodos exactos
2. Alineamiento progresivo
3. Aproximaciones iterativas
4. Métodos basados en la consistencia
5. Métodos basados en la estructura
! Las aproximaciones no son excluyentes
! Las tres últimas, por ejemplo, utilizan alineamiento progresivo
9
Algoritmos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

16. DIALIGN
AMS globales
PROBCONSMétodos
probabilísticos
1. Métodos exactos
(basados en la PD)
CLUSTAL OMEGA
T-COFFEE
MUSCLE
PRALINE
Métodos
progresivos
Métodos híbridos
2. Métodos
heurísticos
MAFFT
Métodos
iterativos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
TOOLS

17. 1. Métodos exactos
- Para alinear dos secuencias de 300 aa, el algoritmo de programación
dinámica u?liza una matriz bidimensional, por lo que el número
de operaciones que hay que hacer es de 3002.
- Para N secuencias se u?liza una matriz N-dimensional, con 300N
operaciones. Debido a esto, necesita una gran can?dad de
recursos computacionales y mucho ?empo. En la prác?ca apenas se
u?liza, solo si N = 3 o si las secuencias son cortas, 6 < N < 8.
Solo recomendado para número pequeño de secuencias
(7-10) cuya longitud no sea muy grande (200-300 aa)
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

18. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

19. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

20. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
GATACTA----A
G--AT--TACCA

21. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

22. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

23. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

24. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

25. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

26. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

27. 1. Métodos exactos, ejemplo
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

28. 1. Métodos exactos
- Para alinear dos secuencias de 300 aa, el algoritmo de programación
dinámica u?liza una matriz bidimensional, por lo que el número
de operaciones que hay que hacer es de 3002.
- Para N secuencias se u?liza una matriz N-dimensional, con 300N
operaciones. Debido a esto, necesita una gran can?dad de
recursos computacionales y mucho ?empo. En la prác?ca apenas se
u?liza, solo si N = 3 o si las secuencias son cortas, 6 < N < 8.
Solo recomendado para número pequeño de secuencias
(7-10) cuya longitud no sea muy grande (200-300 aa)
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

29. DIALIGN
AMS globales
PROBCONSMétodos
probabilísticos
1. Métodos exactos
(basados en la PD)
CLUSTAL OMEGA
T-COFFEE
MUSCLE
PRALINE
Métodos
progresivos
Métodos híbridos
2. Métodos
heurísticos
MAFFT
Métodos
iterativos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
TOOLS

30. Tipos de métodos de alineamiento múltiple de secuencias
Se puede usar la programación dinámica para alinear cualquier número de
secuencias, sin embargo el tiempo de cálculo y la memoria requerida
aumenta exponencialmente. En la práctica los enfoques heurísticos son
los más utilizados.
Existen tres tipos de algoritmos heurísticos:
Alineamiento progresivo (ClustalW/Omega)
Alineamiento iterativo
Alineamiento basado en bloques
2. Métodos heurís=cos
!Alineamiento progresivo
!Alineamiento itera?vo
!Alineamiento probabilís?cos
!Alineamiento híbridos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
En la prácHca los métodos heurís1cos son más empleados

31. Se cuenta el número de residuos que coinciden en cada pareja de secuencias.
Con esos datos se genera un árbol filogené;co (árbol guía) que servirá de guía
para la construcción del AMS.
El AMS comienza alineando las dos secuencias más parecidas. A continuación, va
añadiendo de forma progresiva las secuencias (o grupos de secuencias) que más
se parecen a las que ya están alineadas.
El AMS depende mucho de los alineamientos iniciales por parejas. Cualquier
error come;do en las primeras etapas se va arrastrando durante todo el
proceso.
Hace un análisis de grupo (cluster analysis) para generar una jerarquía de
secuencias en base a su similitud. En base a su similitud, se comparan todas las
secuencias, dos a dos, u;lizando el algoritmo de programación dinámica.
CaracterísHcas
Alineamiento progresivo (jerárquico o de árbol)
Alineamiento AMS (métodos heurísticos)
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

32. Árbol guía
Matriz de
distancias
(distancias
entre seq.)
Alineamiento progresivo1 2
34
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

33. Ventajas e inconvenientes
Alineamiento progresivo
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

34. Clustal Omega
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

35. Clustal Omega: Etapas
Árbol guía
Matriz de distancias
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

36. Se empieza alineando las dos
secuencias más parecidas. A
este alineamiento se le van
añadiendo secuencias o
alineamientos por orden
decreciente de similitud.
Clustal Omega: etapa nº 3
Árbol guía
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

37. Para hacer un AMS con Clustal Omega:
2.- Selecciona el tipo de secuencias a alinear
3.- Introduce las secuencias en el campo (FASTA)
4.- Selecciona el formato de salida para los resultados
5.- Selecciona los parámetros del alineamiento (opta?vo)
6.- Indica si quieres recibir los resultados por e-mail
Cómo se hace un AMS con Clustal Omega
7.- Submit
1.- hYps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

38. Formato FASTA
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

39. Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

40. Escoge ADN,
ARN o proteínas
Corta/pega las secuencias
aquí. El límite son 4000.
Si ya tienes las secuencias
seleccionadas en un único
archivo, pincha aquí para cargarlo
en el formulario. El tamaño
máximo del archivo es 4 Megas
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

41. Selecciona el
formato de salida
del alineamiento
Selecciona los
parámetros del
alineamiento (opcional)
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

42. Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

43. mu
lambda
beta
TdT
Alineamiento
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

44. NUEVO 2025
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal

45. Árbol guía
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

46. Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

47. Jalview es una herramienta que te
permite crear MSA o modificar MSA
hechos con otros programas
introduciendo otros tipos de información
que ClustalW no ha tenido en cuenta.
La herramienta Jalview
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

48. Estructura secundaria
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

49. Error
inicial
ABCD
El gran inconveniente de ClustalW
Propagación
del error inicial
Alineamiento progresivo, Ejemplo: Clustal
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

50. DIALIGN
AMS globales
PROBCONSMétodos
probabilísticos
1. Métodos exactos
(basados en la PD)
CLUSTAL OMEGA
T-COFFEE
MUSCLE
PRALINE
Métodos
progresivos
Métodos híbridos
2. Métodos
heurísticos
MAFFT
Métodos
iterativos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

51. T-Coffee = Tree-based Consistency
Objective Function for alignmEnt Evaluation
Bloque I: Alineamiento de secuencias
T-CoffeeAlineamiento progresivo, Ejemplo: T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

52. Clustal Lalign
1.- El programa comienza
haciendo alineamientos
globales (con CLUSTALW)
y locales (con Lalign) en
cada pareja de secuencias
2.- A partir de los
alineamientos crea una
biblioteca primaria en la
que cada pareja de
residuos alineados está
ponderada (su
importancia depende del
porcentaje de identidad
entre las dos secuencias)
Bloque I: Alineamiento de secuencias
Alineamiento progresivo, Ejemplo: T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

53. 3.- Se extiende la biblioteca: cada pareja
de secuencias se alinea con una tercera
(si es posible) y se recalcula el factor de
ponderación para cada posición del
alineamiento.
4.- Se hace un alineamiento progresivo.
utilizando los nuevos factores de
ponderación. Primero se calcula una
matriz de distancias y luego se construye
un árbol guía que dirija el alineamiento.
Se empieza por las más parecidas y se
van añadiendo las secuencias restantes
(o parejas de secuencias), empezando
por las de mayor parecido, hasta
completar el alineamiento.
T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencias
Alineamiento progresivo, Ejemplo: T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

54. T-Coffee
Ejemplo de la extensión de la biblioteca
Librería primaria: cada pareja de secuencias alineada recibe un factor de ponderación
Librería extendida: Cada pareja de secuencias alineada se compara con una tercera (si
es posible) y se recalculan los factores de ponderación de cada pareja de residuos
El trazo grueso
tiene mayor
factor de
ponderación
Bloque I: Alineamiento de secuencias
Alineamiento progresivo, Ejemplo: T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

55. MSA en T-Coffee
http://tcoffee.crg.cat/
Pincha aquí para hacer
un AMS sencillo
Bloque I: Alineamiento de secuencias
Alineamiento progresivo, Ejemplo: T-Coffee
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

56. AMS en T-Coffee
(mas preciso pero lento)
AMS en Clustal
(rápido)
finger domain as well as an EAR transcriptional
repression motif [(L/F)DLN(L/F)XP, where X is any
amino acid; Ohta et al., 2001]. The interaction was
confirmed by cotransforming yeast cells with the can-
didate cDNA and with either PtiMPK3-1 or PtiMPK6-2,
two MAPKs belonging to group A (Supplemental Fig.
S1; Hamel et al., 2006). No interaction could be de-
tected using empty vectors or the group C MAPK
PtiMPK2, suggesting a specific interaction between the
truncated TF and group A MAPKs.
Search of thePopulus trichocarpagenome identified a
540-bp gene model corresponding to the cDNA iso-
lated using Y2H assay. The novel gene is located on
chromosome X and displays no intron (Supplemental
Fig. S2). The deduced amino acid sequence shares
closest similarity to that of zinc finger proteins that
possess two Cys-2/His-2 zinc finger domains (Fig.
1A) and was namedP. tr ich o ca rp aZinc Finger Pro-
tein1 (PtiZFP1; protein identifier 659738). Within
the conserved sequence of each zinc finger domain
(Cx
2–4
Cx
3
Fx
5
Lx
2
Hx
3–5
H), two Cys and two His resi-
dues tetrahedrally coordinate a zinc atom to produce
a compact structure that interacts with the major
groove of the DNA in a sequence-specific manner
(Choo and Klug, 1997). Zinc fingers found in PtiZFP1
are separated by a 24-amino acid spacer, and both
domains display a QALGGH motif that is the main
DNA-contacting surface and is specific to plant zinc
finger proteins (Fig. 1B; Kubo et al., 1998). Apart from
the two zinc fingers, the primary sequence of this
class of TF is overall poorly conserved, with only two
other recognizable regions preserved across putative
orthologs: an N-terminal L-box motif of unknown
function and the C-terminal EAR motif (Fig. 1B).
With 176 members in Arabidopsis, Cys-2/His-2-
type zinc finger proteins form one of the largest groups
of transcriptional regulators in plants (Englbrecht
et al., 2004). These proteins are further classified into
different families, with the most studied members
belonging to the C1 family (Ciftci-Yilmaz and Mittler,
2008). C1 members either possess one isolated or two
to five separated zinc fingers, denoted by the acronym
“i”; for example, PtiZFP1 belongs to subclass C1-2i.
Phylogenetic analysis was conducted to identify the
closest putative orthologs of PtiZFP1 (Supplemental
Fig. S3). Among Arabidopsis candidates, AtZAT7,
AtZAT10, and AtZAT12 are the most extensively
characterized, as they have been associated with abi-
otic stress relief (Ciftci-Yilmaz and Mittler, 2008). Other
members from this subclass are induced by biotic
challenges, including AtZAT11 in response to Flg22
elicitor peptide (Zipfel et al., 2004). Several Cys-2/His-
2-type zinc finger proteins have also been studied in
Catharanthus roseus, where they were shown to repress
Figure 1.Structure and conservation of PtiZFP1. A, Schematic view of the PtiZFP1 protein and organization of its conserved
motifs. B, Protein sequence alignment of homologous Cys-2/His-2-type zinc finger proteins. PtiZFP1 (protein identifier 659738)
is derived fromP. trichocarpa. CrZCT2 (CAF74934) is derived fromC. roseus. PhZPT2-5 (BAA19110) and PhZPT2-14
(BAA21923) are derived fromPetunia hybrida. AtZAT11 (NP_181279) and AtZAT18 (NP_190928) are derived from Arabidopsis.
The unnamed product (ACB20696) is derived fromCamellia sinensis.
MAPK-Promoted Degradation of an EAR Repressor
Plant Physiol. Vol. 157, 2011 1381
www.plant.org on May 18, 2016 - Published by www.plantphysiol.orgDownloaded from
Copyright © 2011 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
Bloque I: Alineamiento de secuenciasBloque I: Alineamiento de secuencia II
Artículo

57. DIALIGN
AMS globales
PROBCONSMétodos
probabilísticos
1. Métodos exactos
(basados en la PD)
CLUSTAL OMEGA
T-COFFEE
MUSCLE
PRALINE
Métodos
progresivos
Métodos híbridos
2. Métodos
heurísticos
MAFFT
Métodos
iterativos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

58. El principal problema de los alineamientos progresivos es que los errores iniciales
se arrastran. Los métodos itera;vos intentan corregir este problema por
medio de realineamientos de subgrupos de secuencias, que después se alinean
para obtener un AMS global de las secuencias.
-DIALIGN: pone énfasis en alineamiento locales entre las secuencias
-MUSCLE: alineamiento múl;ple de secuencias porlog-esperanza
Otros métodos heurís=cos
Métodos itera0vos
Alineamiento AMS (métodos heurísticos)
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

59. Alineamiento itera?vo
Árbol
guía
Matriz de
distancias
Una razón por la que los métodos progresivos (CLUSTAL, T-COFFEE) son tan
fuertemente dependientes de la alta calidad del alineamiento inicial es el hecho de que
estos alineamientos se incorporan siempre al resultado final; esto es, una vez que una
secuencia ha sido alineada dentro del AMS, su alineamiento no vuelve a ser
considerado.
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

60. Se pueden alinear 5000 secuencias
de 350 caracteres en 7 minutos con
un ordenador personal.
MUltiple Sequence Comparison
by Log- Expectation
Alineamiento itera?vo, MUSCLE
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

61. MUSCLE permite
alinear miles de
secuencias
El proceso se lleva
a cabo en 3 etapas:
1.- AMS progresivo (borrador)
2.- AMS progresivo (mejorado)
3.- Refinado
Alineamiento itera?vo, MUSCLE
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

62. El algoritmo de MUSCLE: Etapa 1 (AMS provisional)
The kmerdistance is derived
from the fraction of kmersin
common. This measure does
not require an alignment,
giving a significant speed
advantage.
Alineamiento itera?vo, MUSCLE
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

63. The approximate
kmer distance
results in a
suboptimal tree.
Now is time to
improveit.
El algoritmo de MUSCLE: Etapa 2 (AMS mejorado)
Alineamiento itera?vo, MUSCLE
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

64. El algoritmo de MUSCLE: Etapa 3 (Refinado)
Alineamiento iterativo, MUSCLE
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

65. Alineamiento itera?vo
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
MUSCLEClustalW
MUSCLErealizaelalineamientousandomenoshuecos,perosigue
teniendoproblemas

66. 3 Métodos probabilís7cos
U;lizan el cálculo de una probabilidad, por lo que es una puntuación con
un fundamento matemá;co más sólido. A par;r de ahí te genera la función
obje;va y detecta los mejores alineamientos.
4 Métodos híbridos
U;liza dos ;pos de aproximaciones: combina los métodos progresivos con
los métodos itera;vos.
Otros métodos heurísticos
Alineamiento AMS (métodos heurísticos)
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

67. ConclusionesAlineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

68. DIALIGN
AMS globales
PROBCONSMétodos
probabilísticos
1. Métodos exactos
(basados en la PD)
CLUSTAL OMEGA
T-COFFEE
MUSCLE
PRALINE
Métodos
progresivos
Métodos híbridos
2. Métodos
heurísticos
Métodos
iterativos
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

69. Los mejores programas para hacer MSA
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

70. Algunas recomendaciones para elegir programa
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

71. Herramientas para editar AMS
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

72. Editores de AMS : Jalview y Boxshade
Los editores de AMS son programas que permiten
modificar los AMS generados por otros métodos.
Permiten retocar los alineamientos para que tengan
en cuenta otros tipos de información o cambiar el
formato por otro más adecuado para su publicación
en una revista científica.
http://www.jalview.org/
http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

73. La herramienta WebLogo3
http://weblogo.threeplusone.com/
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

74. La herramienta cons (EMBOSS)
http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cons
La herramienta cons
(EMBOSS) genera una
secuencia consenso a
partir de un AMS.
Selecciona el fichero con el AMS
Selecciona el formato de
salida de la secuencia
consenso
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

75. Aplicaciones del AMS
> Identificación de regiones conservadas o semiconservadas
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

76. > Iden?ficación de regiones conservadas o semiconservadas
>Iden?ficación de lugares variables dentro de secuencias conservadas
Aplicaciones del AMS
Alineamiento AMS
Lospolimorfismosdeunsolonucleó0do(SNP)representanalasvariantesgené0cas
máscomúnmenteencontradasenelgenomahumano.
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

77. > Identificación de regiones conservadas o semiconservadas
>Identificación de lugares variables dentro de secuencias conservadas
> Detectar motivos o regiones conservados con función común
Aplicaciones del AMS
Alineamiento AMS
Jalview
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

78. > Iden?ficación de regiones conservadas o semiconservadas
>Iden?ficación de lugares variables dentro de secuencias conservadas
> Detectar mo?vos o regiones conservados con función común
> Ayuda a predecir la estructura secundaria / terciaria
Aplicaciones del AMS
Alineamiento AMS
Jalview
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

79. Aplicaciones del MSA
IdenHficación de regiones conservadas
Iden;ficación de dominios de unión a ATP de dimerización de la proteína RD2
(universal stress protein) de Arabidopsis
!"# $%!&#%' (! !)* +#'$!$#%' $%,$-(!*, $% .$/0 10 2%!&#% 3 )('
( 4*%/!) #5 363 %7-4*#!$,*' (%, $%!&#% 1 )(' ( 4*%/!) #5 338
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Downloaded from https://academic.oup.com/jxb/article/53/379/2325/512535 by Centro de Investigaciones Científicas Isla de la Cartuja user on 07 October 2020
purified SlRd2 protein and performed a nucleotide
binding assay in vitro by incubating SlRd2 in the
presence of [a-
32
P]ATP. Samples were then analyzed by
SDS-PAGE followed by autoradiography (Fig. 5B, up-
per panel). Indeed, SlRd2 was able to bind [a-
32
P]ATP,
whereas no [a-
32
P]ATP binding was observed when the
GFP protein was incubated in its presence. To further
confirm that SlRd2 was also able to bind ATP in vivo,
a synthetic analog of ATP, (+)-biotin-hex-acyl-ATP
(BHAcATP), consisting of ATP, an acyl-P linker and a
biotin tag, was used (Villamor et al., 2013). Incubation
of GFP-SlRd2 expressing plant extracts with BHAcATP
followed by streptavidin purification revealed that
SlRd2 was able to bind BHAcATP in planta (Fig. 5C,
upper panel). Moreover, ATP addition suppressed
BHAcATP labeling by competing with BHAcATP and
saturating the nucleotide-binding site of SlRd2 (Fig. 5C,
upper panel). Thesefindings indicate that SlRd2 binds
ATP and therefore functionally belongs to the ATP-
binding subgroup of the UspA family represented by
Mj0577.
The dimerization motif, present in UspA family
proteins, is also conserved in SlRd2 and is localized
close to the C terminus (Figs. 5A and S4). Mj0577 and
HiUspA were shown to exist as homodimers in vivo
(Sousa and McKay, 2001; Zarembinski et al., 1998).
Mj0577 crystallizes as a homodimer, and each mono-
mer binds the other through antiparallel hydrogen
bonds in thefifth beta sheet within each subunit. To test
whether SlRd2 was also able to form homodimers, we
performed a Y2H analysis in which the yeast strain
expressed SlRd2 both in the prey (pJG4-5) and in the
bait (pEG202) plasmids. Indeed, SlRd2 can form homo-
dimers because growth was observed in restrictive me-
dia and blue color developed in the presence of X-gal
(Fig. 6A). No interaction was detected when Y2H anal-
ysis was performed using a SlRd2 mutant version,
SlRd2∆dim (amino acids 163 to 166 deletion), in which
the putative dimerization domain VIIV was deleted (Fig.
6A). SlRd2 and SlRd2∆dim, were expressed in yeast (Fig.
6B). Therefore, SlRd2 forms dimers and the conserved
VIIV domain is necessary for dimerization in vivo.
It has been described thatE.coliUspC is able to form
tetramers in vivo (Nachin et al., 2008). To check if SlRd2
also formed homotetramers in vivo, anE.coliculture
overexpressing SlRd2 tagged at the N terminus with the
epitope His (His-SlRd2) was treated with a cross-linking
agent, disuccinimidyl glutarate (DSG), for 30 min.
Thereafter, protein extractswereobtained,analyzed
by SDS-PAGE and His-SlRd2 detected by immuno-
blot. Two bands of approximately 42 and 24 kD were
observed in the extracts treated with the crosslinker,
which corresponded likely with SlRd2 dimer and mon-
omer, whereas only the lowerM
r
band was observed in
control conditions (Fig. 6C). Thus, we concluded that
SlRd2 is able to form homodimers but not homote-
tramers in vivo.
To determine that SlRd2 formed homodimers in
planta and their putative subcellular localization, BiFC
assays were performed.SlRd2cDNA was cloned in the
BiFC vectors, transformed intoAgrobacteriumand agro-
infiltrated inN.benthamianaleaves. Reconstitution of
YFPfluorescence was observed 2 d after under the
confocal microscope when SlRd2-YFP
C
and SlRd2-YFP
N
Figure 4.Tomato SlRd2 protein structure and
phylogenetic analysis. A, Schematic structure of
SlRd2 containing N-terminal and C-terminal domains
and a conservedUspdomain, which encompasses
a dimerization motif. Special symbols indicate the
conserved residues described to be involved in
ATP-binding. B, Phylogenetic relationship of pro-
teins containing Usp domains from plants and
bacteria includingA.thaliana,AtRD2;tomato,SlRd2
and LeER6;N.benthamiana,NbRd2;O. sativa,
OsUSP1;V. faba, VfENOD18;E. coli, EcUspG and
EcUspA;H. influenzae,HiUspA;andM. jannaschii,
Mj0577. SlCbl10 was used as the outgroup. The
numbers on the tree represent bootstrap scores.
Plant Physiol. Vol. 173, 2017 841
SlRd2 Phosphorylation and Role in Stress Defense
www.plantphysiol.org on January 27, 2017 - Published by www.plantphysiol.orgDownloaded from
Copyright © 2017 American Society of Plant Biologists. All rights reserved.
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

80. IdenHficación de regiones conservadas
>AtRD2
MEALPEDEEYSFREVVLPSLIPVVPEPELERESGERRRGRDVIVAVDHGPNSKHAFDWALVHFCRLADTLHLVHAVSSSFSLQCVK
NDVVYETSQALMEKLAVEAYQVAMVKSVARVVEGDAGKVICKEAEKVKPAAVIVGTRGRSLVRSVLQGSVSEYCFHNCKSAPVII
VPGKEAGDESIVDWTRSEDPKPS
>SlRd
MVMEDEKYNWSEVKLHSLIPIVPEPELDRETGERRRGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHLCRLADTLHLVHAVSSLKNEIVYEAT
QGLMEKLAVEAFSVAMVKTVARIVEGDAGKVICKEAERLKPSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAPVIIVPGKEAGEV
SVI
>NbRd
METLMEEEEYNWREVKLPSLIPVVPPPELERETGERRRGRDIVIAIDHGPNSKHAFDWAVTHICRLADTIHLVHAVSSLRNEIVYEA
TQALMEKLAIEAFEVAMVKTVARIVEGDAGKVICKEAERLKPAAVVMGTRGRSLIKSVLQGSVSEHCFHQCKTAPIIIVPGKEAGEE
SVI
>LeER6
MNALNWTLDNIKLKPHDPDSPESQGFIVILHVQSPPSIAAGLNPGAIPFGGPSDVEVPAFTAAIEAHQKRITQAILDHALGICAKKN
ANVKTQVVIGDPKEKICDAVEEMNADLLVMGSRAFGPIKRMFLGSVSNYCTNHAQCPVIIVKATP
>OsUSP1
MAAAEGEQRKTVVVVGVDDSEHSNYALEWTMQHLASGMAGGGGAELVIVHAKPSPSSVVGFGAGPGSGEVVRYVEADLRKT
AEDVVEKARRLCIANAMHALIEVIEGEPRYVLCNAVEKHSAGLLVVGSHGYGAIKRAFLGSVSDYCAHHAHCSVMIVKQPKAKRSR
AETA
>VfEnod18
MVEDRKVGVGIDFSKNSKNALKWAIVNMADKGDTFYLIHINSNSSDESRSKLFAKTGSPLIPLELKEAGVMKQYGVQTDVEVIDLL
EIAATQKEVSVVAKLYWGDARQKLMDSIEDLKLDALVLGSRGLSTIKRILLGSVSNFVMVHSPCPVTIVKDYSSSSSD
>Mj0577
MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFSLLLGVAGLNKSVEEFENELKNKLTEEAKNKMENIKK
ELEDVGFKVKDIIVVGIPHEEIVKIAEDEGVDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNKPVLVVKRKNS
>EcUspA
MAYKHILIAVDLSPESKVLVEKAVSMARPYNAKVSLIHVDVNYSDLYTGLIDVNLGDMQKRISEETHHALTELSTNAGYPITETLSGS
GDLGQVLVDAIKKYDMDLVVCGHHQDFWSKLMSSARQLINTVHVDMLIVPLRDEEES
>HiUspA
MYKHILVAVDLSEESPILLKKAVGIAKRHDAKLSIIHVDVNFSDLYTGLIDVNMSSMQDRISTETQKALLDLAESVDYPISEKLSGSGD
LGQVLSDAIEQYDVDLLVTGHHQDFWSKLMSSTRQVMNTIKIDMLVVPLRDE
Aplicaciones del MSA
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

81. Clustal
Aplicaciones del MSA
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

82. Results colour-coded for amino acid conservation
The current colourscheme of the alignment is for amino acid conservation.
The conservation scoring is performed by PRALINE. The scoring scheme works from 0 for the least conserved alignment position, up to 10 for the most conserved alignment position.
The colour assignments are:
Unconserved012345678910Conserved
.........10.........20.........30.........40.........50
SlRd M--VMEDEKYNWSEVKLHSLIPIVPEPELDRETGERRRGRDIVIAIDHGP
NbRd METLMEEEEYNWREVKLPSLIPVVPPPELERETGERRRGRDIVIAIDHGP
AtRD2 MEALPEDEEYSFREVVLPSLIPVVPEPELERESGERRRGRDVIVAVDHGP
LeER6 --------------------------------------------------
OsUSP1 ----------------------MAAAEGEQRKT-------VVVVGVDDSE
VfEnod18----------------------MV----EDR---------KVGVGIDFSK
Mj0577 --------------------MSVM-----YK---------KILYPTDFSE
EcUspA ----------------------MA-----YK---------HILIAVDLSP
HiUspA ----------------------M------YK---------HILVAVDLSE
Consistency00000000000000000000115310111361100000002746467254
.........60.........70.........80.........90.........100
SlRd NSKHAFDWAVTHLCRL-----AD----TLHLVHAVS---SL---------
NbRd NSKHAFDWAVTHICRL-----AD----TIHLVHAVS---SL---------
AtRD2 NSKHAFDWALVHFCRL-----AD----TLHLVHAVSSSFSL---------
LeER6 --MNALNWTLDNIKLKPHDPDSPESQGFIVILHVQSPPSIAAGLNP-GAI
OsUSP1 HSNYALEWTMQHLASGMAGGGGA----ELVIVHAKPSPSSVVG---FGAG
VfEnod18NSKNALKWAIVNMADK-----GD----TFYLIHINSNSSDESRSKLF-AK
Mj0577 TAEIALKHVKAFKTLKAE---------EVILLHVIDE-REIKKRDIF-SL
EcUspA ESKVLVEKAVSMARPYNA---------KVSLIHVD-----VN----Y-SD
HiUspA ESPILLKKAVGIAKRHDA---------KLSIIHVD-----VN----F-SD
Consistency47537655763444330100022000047388*63310135100002031
.........110.........120.........130.........140.........150
SlRd ------------KNEIVYEATQGLMEKLAVEAFSVAMVK----TVARIVE
NbRd ------------RNEIVYEATQALMEKLAIEAFEVAMVK----TVARIVE
AtRD2 ---------QCVKNDVVYETSQALMEKLAVEAYQVAMVK----SVARVVE
LeER6 PFGGPSDVEVPAFTAAIEAHQKRITQAILDHALGICAKK-NANVKTQVVI
OsUSP1 P--GSGEV-VRYVEADLRK--TAEDVVEKARRLCIANAM---HALIEVIE
VfEnod18T--GSPLIPLELKEAGVMKQYGVQTDVEVIDLLEIAATQKEVSVVAKLYW
Mj0577 LLGVAGLNKSVEEFENELKNKLTEEAKNKMENIKKELEDVGFKVKDIIVV
EcUspA LY--TGL---IDVNLGDMQKRISEETHHALTELSTNA---GYPITETLSG
HiUspA LY--TGL---IDVNMSSMQDRISTETQKALLDLAESV---DYPISEKLSG
Consistency10002210011145434462334444435544645542301115444853
.........160.........170.........180.........190.........200
SlRd -GDAGKVICKEAERLKPSAVVMGTRGRGIIQSVLQGSVAEYCLHNCKIAP
NbRd -GDAGKVICKEAERLKPAAVVMGTRGRSLIKSVLQGSVSEHCFHQCKTAP
AtRD2 -GDAGKVICKEAEKVKPAAVIVGTRGRSLVRSVLQGSVSEYCFHNCKSAP
LeER6 -GDPKEKICDAVEEMNADLLVMGSRAFGPIKRMFLGSVSNYCTNH-AQCP
OsUSP1 -GEPRYVLCNAVEKHSAGLLVVGSHGYGAIKRAFLGSVSDYCAHH-AHCS
VfEnod18-GDARQKLMDSIEDLKLDALVLGSRGLSTIKRILLGSVSNFVMVH-SPCP
Mj0577 -GIPHEEIVKIAEDEGVDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKK-SNKP
EcUspA SGDLGQVLVDAIKKYDMDLVVCGHH-QDFWSKLM--SSARQLINT-VHVD
HiUspA SGDLGQVLSDAIEQYDVDLLVTGHH-QDFWSKLM--SSTRQVMNT-IKID
Consistency0*74455855569544456795*5644535656735*7754544404346
.........210.........220......
SlRd VIIVPGKEAGEVSVI-----------
NbRd IIIVPGKEAGEESVI-----------
AtRD2 VIIVPGKEAGDESIVDWTRSEDPKPS
LeER6 VIIV--KATP----------------
OsUSP1 VMIV--KQPKAKRSRAETA-------
VfEnod18VTIV--KDYSSSSSD-----------
Mj0577 VLVVKRKNS-----------------
EcUspA MLIVPLRDEEES--------------
HiUspA MLVVPLRDE-----------------
Consistency879*3185422121100000000000
10/07/2020 02:50:12 PM
Results colour-coded for amino acid conservation 1
ATP binding
dimeriza=on
Clustal
Praline
Aplicaciones del MSA
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

83. El programa PRALINE
Alineamiento AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

84. Métodoprogresivo:
1.Añadesecuencuenciasadicionales
relacionadasfilogené;camenteconla
informaciónintroducida(Psi-BLAST)
2.Puedeincorporarinformaciónsobre
estructurassecundariaspredichapor
diferentesprogramas
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
PRALINE busca homólogos e incorpora información estructural

85. Praline: opciones

86. Perfiles
Perfiles HMM
Motivos (patrones)
Patrones difusos
Dominios
Reglas
Huellas dactilares
Bloques
Motivos
locales
conservados
Motivos
únicos
Alineamientos
completos
Motivos
múltiples
Identificar de motivos conservados en un AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

87. Motivos (bloques, segmentos, características)
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Los residuos conservados son idén=cos

88. Varios motivos conservados en un AMS
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

89. Bloque I: Alineamiento de secuencia II

90. Bloque I: Alineamiento de secuencia II

91. Supplemental Data. Ramon et al. (2019). Plant Cell 10.1105/tpc.18.00500.


Supplemental Figure 1. SnRK1 heterotrimeric complex and SnRK1α1 catalytic α subunit domain structure and composition (Supports Figure 1). (A) Cartoons of 3D homology models of the SnRK1α1β2βγ heterotrimeric complex, the full-length (FL, 512 aa) SnRK1α1 subunit, and truncated (404, 333, and 290 aa) SnRK1α1 proteins. The regulatory α C-terminal domain (αCTD), α linker, and ubiquitin associated (UBA) domain are indicated in addition to the N-lobe, C-lobe and catalytic cleft of the catalytic domain. (B) Schematic overview of SnRK1α1 catalytic and regulatory domain composition and progressive truncation of the catalytic domain to 404 aa (- αCTD), 333 aa (-α linker) and 290 aa (- UBA domain). The phosphorylated T-loop T175 residue is indicated in the C-lobe.
!!!!!!!



Lo que se sabe
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

92. Bloque I: Alineamiento de secuencia II

93. Ejercicio aplicando conocimientos previos
>protein_X
MTTGRPNNILALKISTRSSSLTVGEQFCAVFIPFFAIIDVLVSSVGQCFDCRSTSPRTCQ
HADLERLARESQFSVNEVEALYELFKKLSCSIIDDGLIHKEELRLALFQAPYGENLFLDR
VFDLFDEKKNGVIEFEEFIHALSVFHPYASIQEKTDFAFRLYDLRQTGFIEREEVQQMVS
AILLESDMMLSDELLTMIIDKTFADADSDKDGKISKDEWNVYVHKHPSLLKNMTLPYLKD
VTTAFPSFIFNTEVED
Pasos a seguir:
1.BLAST (ncbi) => le ponemos nombre y especie
2.BLAST en DB del organismos => iden;ficamos si existen proteínas similares
3.(Uniprot => seleccionamos secuencias para hacer el alineamiento)
4.ClustalW => iden;ficamos las regiones conservadas
5.Análisis por Jalview (edición del alineamiento)
6.PROSITES => iden;ficamos los dominios
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

94. 1
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

95. 2
tair
uniprot
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

96. 3
Coger el mayor número posible de secuencias
homologas y de diferentes organismos
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

97. 3
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

98. 3
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

99. 4
Bloque I: Alineamiento de secuencia II
Arbol guía

100. 5
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

101. 6
Bloque I: Alineamiento de secuencia II

102. Actividad 2: aplicando alineamiento de secuencia
Aplicando conocimientos previos:
1.Determinar especie e iden;dad de la secuencia problema
2.Realizar alineamiento múl;ple usando para ello las TRES secuencias ortólogas
(Clustal Omega y Jalview). Incluye árbol guia
3.Determinar las estructuras secundarias
4.Iden;ficar mo;vos funcionales (dominios)
>protein_X
MNTNRGRYPPGVGTGRGAPPNPDYHQSYRQQQPPQDQQYVQRGYSQNPQQMQLQQQHQQQQQQQQWSRRPQLPGNASNANEVVQQTTQPEASSDANGQ
DWKATLRLPPPDTRYQTADVTA TKGNEFEDYFLKRDLLKGIYEKGFEKPSPIQEESIPIALTGSDILARAKNGTGKTGAFCI
PVLEKIDPNNNVIQAMILVPTRELALQTSQVCKELSKYLNIQVMVTTGGTSLRDDIMRLH
QPVHLLVGTPGRILDLTKKGVCVLKDCAMLVMDEADKLLSAEFQPSLEELIQFLPQNRQF
LMFSATFPVTVKAFKDRHLRKPYVINLMDQLTLMGVTQYYAFVEERQKVHCLNTLFSKLQ
INQSIIFCNSVNRVELLAKKITELGYSCFYIHAKMVQDHRNRVFHEFRNGACRNLVCTDL
FTRGIDIQAVNVVINFDFPRTSESYLHRVGRSGRFGHLGLAVNLVTYEDRFKMYQTEQEL GTEIKPIPSNIDQAIYCQ
Importante:
- Formato pdf
- Apellidos nombre_Ac;vidad 2
Bloque I: Alineamiento de secuencia II