Unidad III cinetica enzimatica

1. Universidad de Oriente Núcleo Bolívar Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Batisttini” Dpto. de Ciencias Fisiológicas: Bioquímica Unidad III-Cinética Enzimática Profesora: Zulay Castillo Pérez

2. Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos. Unidades del Metabolismo Regulan la velocidad de las reacciones químicas espontáneas ( Δ G-). No promueven reacciones no-espontáneas ( Δ G +). Incrementan la v el ocidad d e reacción 10 3 a 10 12 veces sin afectar el sentido de la reacción. No forman parte del producto de la reacción. Enzimas

3. Catalizador de origen biológico y naturaleza proteica, de alto peso molecular y conformación tridimensional característica, acelera la reacción al disminuir la energía de activación. Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno apolar . La actividad catalítica requiere que dicho centro adopte una conformación determinada, mantenida por el resto de la molécula proteica. Enzimas Estructura

4. No hacen factibles las reacciones imposibles Son sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica ( ribozimas ) Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas

5. Aumentan la velocidad de reacción De 10 6 a 10 12 veces vs sin enzima. Aún más rápido que los catalizadores químicos. Condiciones de reacción Temperatura 25-40 o C (algunas hasta 75 o C) pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5 Presión atmosférica normal Capacidad de regulación Por concentración de sustrato Por concentración de enzima Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato) Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima) Por regulación alostérica Alta especificidad de reacción Interacción estereoespecífica con el sustrato No hay productos colaterales . Propiedades generales

6. Las enzimas simples están constituidas por proteína sin requerir de la unión de otra molécula o grupo químico para realizar su actividad catalítica . Las enzimas conjugadas poseen en su estructura una parte no protéica esencial para su funcionamiento que según su naturaleza puede llamarse cofactor o coenzima. Enzimas simples y conjugadas

7. Apoenzima : fracción protéica Cofactor : grupo que se une a la fracción protéica para permitir el correcto funcionamiento de la enzima . Holoenzima : fracción protéica + cofactor o coenzima Enzimas conjugadas

8. Átomo , ion o molécula que participa en el proceso catalítico sin ser enzima ni sustrato. Los cofactores participan de dos maneras distintas: A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salen sin ser modificados del sitio catalítico. Como un segundo substrato; salen modificados del sitio catalítico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original. Cofactores

9. En función de su naturaleza los cofactores se denominan: Grupos prostéticos: se trata de iones o moléculas inorgánicas. Coenzima: es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se origina la coenzima, p ara una determinada enzima. Cofactores

10. Tiamina B 1 Tiamina pirofosfato Riboflavina FAD ( Flavín adenín dinucleótido ), FMN ( Flavín mononucleótido ) Piridoxina PLP ( Piridoxal fosfato) Cobalamina Metilcobalamina , cobamida Ácido pantoténico Coenzima A (CoA) Nicotinamida NAD + ( Nicotín adenín dinucleótido ) Y NADP + ( Nicotín adenín dinucleótido fosfato) Ácido lipoico Lipoamida Ácido fólico THF ( Tetrahidrofolato ) Coenzimas de naturaleza vitamínica

11. Hemo Hemoenzimas , citocromos Complejos Fe-S Ferredoxinas Quinonas Transporte electrónico mitocondrial y fotosintético Glutatión Redox , transporte de aminoácidos ATP Transferencia de fosfato y/o energía UTP Transferencia de grupos glucosídicos Carnitina Transportador de grupos acilo Coenzimas de naturaleza no vitamínica

12. R egión de la enzima donde se une la molécula de sustrato de forma específica, suele ser un bolsillo o una hendidura que se forma entre las cadenas laterales de los aminoácidos. Estas cadenas: Facilitan la unión del sustrato (especificidad de sustrato) Intervienen en la catálisis (centro catalítico) Sitio Activo

13. Supone una porción relativamente pequeña del volumen total de la enzima Es una entidad tridimensional Se unen a los sustratos por fuerzas relativamente débiles Son hoyos o hendiduras de las que suele quedar excluida el agua, salvo que sea un componente de la reacción La especificidad del enlace depende de la disposición de los átomos del centro activo Sitio Activo. Características

14. Lugar de la enzima en el que ocurre la catálisis y puede incluir también : Coenzimas Cofactores Puede coincidir o no con el centro activo Sitio Catalítico

15. PUENTES DE H INTERACCIONES IÓNICAS ENLACES COVALENTES Mecanismo de unión del sustrato al sitio activo

16. En 1894, Emil Fischer propuso la hipótesis de la llave-cerradura Modelos de interacción del sustrato y el sitio activo Sitio activo

17. En 1958, Koshland propuso el modelo del ajuste inducido Modelos de interacción del sustrato y el sitio activo Conformación del estado de transición Sitio activo

18. Estereoespecificidad Centros activos asimétricos: sólo L-aminoácidos Capacidad de distinguir entre estereoisómeros Especificidad geométrica Grupos químicos que interactúan con el sitio activo Más limitante que la estereoespecificidad Enzimás digestivas: más “preferencia” que “especificidad” Especificidad de la unión enzima-sustrato

19. Antiguamente, las enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. Ejemplo: amilasa (hidroliza el almidón) Glc + ATP  Glc-6P + ADP Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba . Nomenclatura enzimática. Nombres particulares

20. Consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reacción realizado terminación "asa" E jemplo : la glucoquinasa ATP - glucosa- fosfo - transferasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP Nomenclatura enzimática. Nombres sistemáticos

21. El nombre es identificado por un código numérico: E ncabezado por las letras EC ( enzyme commission ), seguidas de cuatro números separados por puntos : el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción. Nomenclatura enzimática. Comisión de enzimas

22. Ej.: ATP:glucosa fosfotransferasa ( glucoquinasa ) Glc + ATP  Glc-6P + ADP EC 2.7.1.2. 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato. Nomenclatura enzimática. Comisión de enzimas

23. Clases Óxido- reductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas Nomenclatura enzimática. Comisión de enzimas

24. Catalizan reacciones de transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro AH 2 + B ⇄ A + BH 2 A red + B ox ⇄ A ox + B red Clase 1-Oxidorreductasas

25. Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro A- B + C ⇄ A + C- B Clase 2-Transferasas

26. Catalizan las reacciones de hidrólisis A-B + H 2 O ⇄ A H + B- O H Clase 3-Hidrolasas

27. Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos A-B ⇄ A + B Clase 4-Liasas

28. Catalizan la interconversión de isómeros AB BA Clase 5-Isomerasas

29. Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.) A + B + XTP A-B + XDP + P i Clase 6-Ligasas

30. Perfil energético de una reacción espontánea Perfil energético de una reacción catalizada Mecanismo de acción enzimática La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación. Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la energía de activación, aún más que los catalizadores inorgánicos.

31. Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H 2 O 2 ) puede ocurrir: sin catalizador E a = 18 Kcal/mol con un catalizador inorgánico (platino) E a = 12 Kcal/mol con una enzima específico (catalasa) E a = 6 Kcal/mol Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces. Mecanismo de acción enzimática

32. Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y una orientación adecuadas. La enzima : A umenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la probabilidad de choque) P ermite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca y M odifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos Mecanismo de acción enzimática

33. Estudio cuantitativo de la catálisis enzimática que proporciona información sobre las velocidades de reacción, afinidad de las enzimas por su sustrato, mecanismos de reacción y los inhibidores Aplicación : - Mejor comprensión de las rutas metabólicas - Diseño de tratamientos más adecuados Velocidad de una reacción bioquímica: Cambio de la concentración de un reactante o un producto por unidad de tiempo Cinética enzimática

34. Concentración de sustrato Concentración de enzima pH Temperatura Efectores (Activadores e Inhibidores) Variables que influyen en la velocidad de una reacción enzimática

35. La velocidad inicial Vo de la reacción A → P , donde A= Sustrato y P= Producto, es: Es proporcional a la frecuencia con que las moléculas reactantes forman el producto, la velocidad de reacción es - Δ [A] Δ [P] Vo = Δ t Δ t = Donde [A]= concentración de sustrato [P]= concentración del producto T= tiempo Vo = K [A] x Donde Vo= velocidad K= constante de velocidad (temp, pH, fuerza iónica) X= orden de reacción

36. Reacción de Primer Orden: La velocidad es proporcional a la concentración de sustrato Reacción de Orden Cero: Independientemente de la concentración de sustrato, la velocidad es constante Orden de Reacción: Suma de los componentes de los términos de concentración en la expresión de velocidad Orden de una reacción enzimática

37. Modelo propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913 Hipótesis del Estado Estacionario: establece que [ES] se mantiene casi constante durante gran parte de la reacción E + S ES E + P k 1 K -1 k 2 Donde: K 1 = constante de velocidad de la formación de ES K -1 = constante de velocidad de la disociación de ES K 2 = constante de velocidad de la formación y liberación del producto del lugar catalítico K 1 [E][S]=K -1 [ES] + K 2 [ES] Cinética Michaelis-Menten

38. Inducen una nueva constante: Km (Constante de Michaelis ) Ecuación de Michaelis-Menten : Donde Vmax = velocidad máxima Km= constante de Michaelis [S]= concentración del sustrato Km= K -1 + K 2 K 1 Cinética Michaelis-Menten

39. Representa la Ecuación de Michaelis-Menten Km (Constante de Michaelis ): mide la concentración del sustrato a la que la enzima tiene la mitad de la velocidad máxima ( V máx /2 ) V máx : Se alcanza cuando todos los centros catalíticos de la enzima se encuentran ocupados por sustrato Efecto de la [S] Km y Vmax se determina midiendo las velocidades iniciales de reacción a varias [S]

40. No todas las enzimas cumplen las condiciones (Enzimas alostéricas ) Difícilmente aplicable a reacciones con dos sustratos No se puede determinar con exactitud Vmax ni Km (Hipérbola rectangular, nunca llega a Vmax ) Cinética Michaelis-Menten . Limitantes

41. Unidades Internacionales (UI): Cantidad de enzima necesaria para producir 1 μmol de producto/minuto Nueva Unidad: Katal Cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato/segundo (6 x 10 7 UI ) Grado de Pureza: Actividad Específica. Número de UI en 1 mg de proteína Unidades de actividad enzimática

42. Ecuación de Lineweaver-Burk Consiste en representar la recíproca de la ecuación de Michaelis-Menten Resultado : línea recta Pendiente : Km/ Vmax Corte en ordenada: 1/ Vmax Corte en Abscisa (extrapolado): -1/Km Donde: y = 1/ Vo x = 1/[S] m = Km/ Vmáx b = 1/ Vmáx Y = mx + b

43. Representación de Lineweaver-Burk

44. Inhibidores : moléculas que reducen la actividad de una enzima (fármacos, antibióticos, conservantes alimentarios, venenos ) - Importante para regular las rutas metabólicas - Tratamiento clínico Tipos de Inhibición Enzimatica : Isostérica : Reversible (competitiva, acompetitiva y no competitiva) e Irreversible Alostérica Inhibición enzimática

45. Inhibición Competitiva El inhibidor competitivo es muy similar al sustrato normal de la enzima. Dada esa similitud estructural, este tipo de inhibidor se une reversiblemente al sitio activo de la enzima. Varia el Km, en presencia del inhibidor Vmáx , no es alcanzada. Puede ser superada al aumentar la [S]

46. Inhibición Acompetitiva El inhibidor se combina sólo con ES, por lo que el inhibidor ejerce su efecto sólo a altas concentraciones de sustrato en las que hay gran cantidad de complejo enzima-sustrato (ES). Aumenta el Km, disminuye Vmáx y mantiene Km/ Vmáx

47. Inhibición no competitiva El inhibidor se combina con la enzima en un lugar distinto al sitio activo. Tanto EI como EIS se forman: Mantiene el Km disminuye Vmáx y aumenta Km/ Vmáx

48. Tabla resumen del efecto de inhibición sobre Km y Vmáx

49. Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente, su acción no se describe por una constante de equilibrio, sino por una constante de velocidad: E + I E’ A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor . Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos. Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados Inhibidores

50. Sustratos suicidas: (Inhibidores activados enzimáticamente) E + I EI EI* E’ + I* 1 2 3 El inhibidor se unen al centro activo de la enzima, de manera específica, igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* I * modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible . Tienen por tanto: (a) la especificidad del inhibidor competitivo y ( b) la potencia de los inhibidores irreversibles

51. Ejemplo: Sistema de la b- lactamasa bacteriana La utilización masiva de antibióticos b- lactámicos (penicilinas, sus derivados semisintéticos y cefalosporinas ) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b- lactamasa , que inactiva a los antibióticos b- lactámicos . b - Lactamasa Penicilina (activa) Ác.peniciloico (inactivo)

52. Factores que afectan la actividad enzimática [E] Temperatura pH

53. Características: También llamadas regulables, la actividad de la enzima se afecta por moléculas efectores que se unen en otros lugares; sitios alostéricos o regulables Catalizan pasos reguladores claves de las rutas bioquímicas La regulación puede ser: Activación alostérica : enzima aumenta afinidad por el sustrato (disminuye su Km), así como su velocidad de catalisis Inhibición alosterica : efectores negativos. Enzimas Alostéricas

54. Características: Cinéticamente n o sigue el comportamiento catalítico de MM - Gráfica: curva sigmoidea o hiperbólica La presencia de una sigmoide implica la existencia de cooperatividad en la fijación del substrato Vo [S] Enzimas Alostéricas

55. La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así hasta ocuparse toda la molécula s s s s s s s s s s + + + 1 2 3 En términos de Km veríamos que K m1 > K m2 > K m3 Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación de una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente. Enzimas Alostéricas

56. Monad , Wyman y Chanqeux ( MWC) Kosland , Nemethy y Filmes (KNF) Eigen ( Eig ) s s s s s s s s s s i i i i i i i i i i Forma R Forma T Modelos que tratan de explicar la cinética de las enzimas alostéricas

57. Los inhibidores alostéricos aumentan el grado de cooperatividad Los activadores alostéricos disminuyen el grado de cooperatividad ; a concentraciones elevadas de activador, la cinética pasa a ser michaeliana , y deja de ser sigmoide . Activador Inhibidor Sin Inhibición Los efectores alostéricos operan sobre el grado de cooperatividad del sistema

58. Control Homoalostérico Control Heteroalostérico

59. s s i Centro activo Centro alostérico Centro alostérico Centro activo En ausencia de inhibidor, el sustrato se fija normalmente al centro activo Cuando el inhibidor ocupa el centro alostérico , tiene lugar un cambio conformacional en el centro activo que impide la fijación del sustrato Inhibición Alostérica

60. La mayoría de las enzimas catalizan reacciones con dos o más sustratos Varios mecanismos posibles - Orden de unión de los sustratos - Orden de liberación de los productos Determinación más compleja que en las enzimas monosustrato - Para cada sustrato hay Km, Kcat y Vmax Cinética de reacciones multiustrato

61. Secuencial Ordenado Secuencial Aleatorio Mecanismo secuencial o de desplazamiento simple: adición de todos los sustratos para poder obtener los productos Mecanismos principales de reacciones multiustrato

62. Mecanismo de doble desplazamiento o ping pong : N o se han unidos todos los sustratos cuando ya hay salida de productos Mecanismos principales de reacciones multiustrato

63. Catálisis Covalente - Grupo reactivo que se une transitoriamente mediante enlace covalente Catálisis Ácido-Base - Molécula diferente de H 2 O acepta o cede protón Catálisis por Iones Metálicos - Varias funciones, dependiendo de la reacción Catálisis por Aproximación Catálisis por unión del Estado de Transición Catálisis: Proceso en el que aumenta la velocidad a la que una reacción se aproxima al equilibrio

64. Quimotripsina : proteasa que rompe enlaces peptídicos adyacentes a los aminoácidos aromáticos Catálisis Covalente - Unión irreversible con el diisopropilfluorofosfato (DFP) - Actividad de residuo clave, Ser 195 Catálisis Ácido-Base - Otros dos elementos de “triada catalítica” - Asp 102 e His 57 Quimotripsina : Dos Mecanismos Catalíticos

65. Aprox . 30% de las enzimas usan iones metálicos: - Metaloenzimas unidas fuertemente a metales de transición: Fe 2+ , Fe 3+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ o Co 3+ - Metaloenzimas unidad débilmente a metales en solución: Na + , K + , Mg 2+ o Ca 2+ Mecanismos : - Enlace con el sustrato para permitir su adecuada orientación - Participación del metal en mecanismos de oxidorreducción - Estabilizador de la reacción al atraer cargas negativas del sustrato Catálisis por Iones Metálicos

66. Observada en reacciones con varios sustratos - Reactantes se encuentran en relación espacial óptima Proximidad : acercamiento simple de las moléculas - Aumentos de velocidad de hasta 5x Orientación : acercamiento de los grupos Catálisis por Proximidad y Orientación

67. Uno de los mecanismos más importantes - Enzima tiene mayor afinidad por el estado de transición que por los sustratos o productos Conjuntamente con los demás, es responsable de los grandes aumentos de velocidad Catálisis por unión del Estado de Transición

68. Regulación de la actividad enzimática Las rutas bioquímicas están organizadas en reacciones químicas catalizadas por enzimas, donde la regulación se hace más compleja Razones de la regulación: - Mantenimiento de un estado ordenado - Conservación de la energía - Respuestas a las variaciones ambientales Se realiza: - Regulación de la concentración enzimática - Regulación de la actividad intrínseca de la enzima 1. Regulación alostérica 2. Regulación por modificación covalente

69. Regulación alostérica Procesos a nivel celular; regulación de ajuste fino de la actividad enzimática, a través de efectos de retroalimentación (negativa o positiva) Regulación por modificación covalente Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulación a gran escala de actividades enzimáticas, a través de modificación covalente de enzimas, provocadas por señales (transducción de señales)

70. Retroalimentación Negativa en Vías Metabólicas Thr a-cetobutirato Ile Treonina desaminasa Síntesis de Isoleucina El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera enzima de la misma, Treonina desaminasa Regulación alostérica

71. Suele haber fenómenos de modificación covalente de enzimas en la respuesta celular a señales químicas : Neurotransmisores Hormonas Factores de crecimiento Estímulos morfogenéticos y de diferenciación Muerte celular programada ( apoptosis) Estímulos antigénicos Luz y otros agentes físico-químicos Regulación por modificación covalente

72. Fosforilación : Protein kinasas Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr Defosforilación : Protein fosfatasas Sobre residuos previamente fosforilados : Ser-P, Thr -P, Tyr -P Regulación por modificación covalente Adenilación . Sistema de la Glutamina sintetasa Tyr ADP- ribosilación . A ctúa NAD+ como donador del grupo ADP-ribosa

73. Son variantes de una misma enzima. Formas físicamente distintas de una enzima pero que catalizan una misma reacción Enzimas multiméricas con varios tipos de subunidades - LDH: cuatro cadenas, tipos M y H - 5 isoenzimas diferentes - Preferencia por reacciones diferentes Permite ajustes sutiles en función catalítica, una enzima simple puede tener isoenzimas , ej : anhidrasa carbónica Isoenzimas

74. Niveles enzimáticos como índices de enfermedad Enzimas Funcionales: Actúan normalmente en las reacciones del metabolismo Enzimas No Funcionales: Aumentan sus niveles cuando hay daño tisular o orgánico

75. Niveles enzimáticos como índices de enfermedad Enzima no Funcional Daño ocasionado a-amilasa Daño pancreático Fosfatasa Alcalina Obstrucción biliar, cáncer de huesos Fosfataa Ácida Cáncer de Próstata Creatinfosfoquinasa (CKmb), Lactato Deshidrogenasa (LDH-H 4 ), a-hidroxibutirato DH Infarto al miocardio Trasaminasa Glutámica Oxaloacético (TGO) Evalúa infarto Trasaminasa Glutámica Pirúvica (TGP) Evalúa la Hepatitis